一種用于檢測豬瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種用于檢測豬瘟病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR試劑盒，包含OneStepRT-PCRbufferIII、ExTaqHS、PrimerScriptRTEnzymeMixII、陰性對照、陽性對照、以及序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的擴(kuò)增引物及SEQIDNO:3的探針引物的混合物。本發(fā)明將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程在一步反應(yīng)中完成，使得檢測時間縮短，有利于快速檢測。本發(fā)明還使用了探針法，只有當(dāng)探針引物特異的結(jié)合到擴(kuò)增靶序列上時才會產(chǎn)生有效的結(jié)果，而且閉管操作的實時檢測可以有效防止反應(yīng)產(chǎn)物的污染，與普通PCR方法相比具有更高的準(zhǔn)確性，有助于CSFV的防控和隱性帶毒動物的剔除。
【專利說明】—種用于檢測豬瘍病毒的Taqman Real-time RT-PCFHii1J
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【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬瘟病毒防治【技術(shù)領(lǐng)域】，具體說是一種用于檢測豬瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR (探針法實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))試劑盒，本發(fā)明還包括該試劑盒的使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]古典豬痕(Classical swine fever, CSF)簡稱豬痕,是由豬痕病毒(Classicalswine fever virus, CSFV)引起豬的急性、烈性、接觸性傳染病,我國是豬痕嚴(yán)重的流行國家之一，每年因豬瘟造成的直接經(jīng)濟(jì)損失有數(shù)十億元，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)及其國際貿(mào)易的發(fā)展。以前采取接種豬瘟兔化弱毒疫苗的方法來預(yù)防和控制豬瘟的流行，成功的控制了豬瘟的大爆發(fā)。然而，豬瘟的流行特點卻從大流行轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫粤餍泻蜕l(fā)，并且不分季節(jié)的隨時發(fā)生。臨床特點也從典型豬瘟轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫托载i瘟，診斷和預(yù)防難度越來越大，因此豬瘟仍是威脅養(yǎng)豬戶的頭號傳染病。目前，國外和國內(nèi)均已建立了 RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))檢測方法。國外應(yīng)用PCR診斷CSFV已取得很大進(jìn)展，許多學(xué)者根據(jù)CSFV序列，設(shè)計了不同引物，建立了檢測CSFV核酸的普通RT-PCR方法、套式RT-PCR方法及復(fù)合式RT-PCR方法等。該方法直接從豬的脾臟、全血、淋巴結(jié)及肉品等中擴(kuò)增出預(yù)期的片斷，但是上述方法耗時長，擴(kuò)增結(jié)束后還需要進(jìn)行電泳才能觀察結(jié)果，檢測一份樣品需耗時7小時左右。同時CSFV是一種高度傳染性的病毒，其RNA (核糖核酸)特別容易發(fā)生變異，現(xiàn)有的檢測方法不具有快速，敏感和準(zhǔn)確的特點，需要研制并開發(fā)出快速，敏感、準(zhǔn)確以及價格便宜的CSFV檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)不能適應(yīng)快速、敏感和準(zhǔn)確的檢測需求，從而提供一種能夠快速、敏感、準(zhǔn)確地檢測病毒的一種用于檢測豬瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR試劑盒,本發(fā)明還提供該試劑盒的使用方法。
[0004]為解決上述問題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案:
一種用于檢測豬痕病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒，所述試劑盒包含PrimerScript RT Enzyme Mix II (反轉(zhuǎn)錄酶混合液)、One Step RT-PCR bufferlll (一步反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液)、Ex Taq HS (具有校正功能耐熱脫氧核糖核酸聚合酶)、陰性對照、陽性對照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 2的擴(kuò)增引物和序列SEQ ID NO: 3的探針引物的混合物。
[0005]所述擴(kuò)增引物序列SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:2為:
SEQ ID NO:1:上游引物 CTGGCCAAGAGGGGTGAGC，
SEQ ID NO: 2:下游引物 ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。
[0006]所述針引物序列為:SEQ ID NO:3:AGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCGo
[0007]所述擴(kuò)增弓丨物擴(kuò)增出的條帶序列為:
SEQ ID NO:4 (274 bp):
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測豬瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒，包含One Step RT-PCRbufferlll、Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix I1、陰性對照，其特征在于:還包含有陽性對照、序列SEQ ID NO:1 M SEQ ID NO: 2的擴(kuò)增引物和序列SEQ ID NO: 3的探針引物的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:2為:
SEQ ID NO:1:上游引物 CTGGCCAAGAGGGGTGAGC， SEQ ID N0:2:下游引物 ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒，其特征在于所述探針引物序列為:
SEQ ID NO:3:AGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCGo
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種用于檢測豬瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR試劑盒，其特征在于所述序列SEQ ID N0:1M SEQ ID NO: 2的擴(kuò)增引物和序列SEQ ID NO: 3的探針引物濃度均為lOpmol/yL，擴(kuò)增引物及探針引物配比為1:1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于檢測豬瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR試劑盒，其特征在于所述擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的條帶序列為: 序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的由5’端向3’端延長的序列；
SEQ ID NO:4 (274 bp):
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種用于檢測豬痕病毒的TaqmanReal-time RT-PCR試劑盒，其特征在于所述探針引物的5’端標(biāo)記物為FAM報告熒光基團(tuán)、3’端標(biāo)記物為TAMRA淬滅熒光基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR試劑盒，其特征在于所述陽性對照為構(gòu)建的pMD-274陽性質(zhì)粒，該質(zhì)粒是擴(kuò)增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所擴(kuò)增的豬瘟病毒基因序列，長度274bp，克隆至pMD-18T克隆載體，命名為pMD-274。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的TaqmanReal-time RT-PCR試劑盒，其特征在于所述試劑盒組分的配比為:
a.2XOne Step RT-PCR bufferlll:25 份；
b.Ex Taq HS:1 份；
c.PrimerScript RT Enzyme Mix I1:1 份； d.引物濃度均為lOpmol/μI的三條引物混合液6份，274bp上游引物2份，274bp下游引物2份，探針引物2份； e.無RNA酶水13份； f.陽性對照pMD-274陽性質(zhì)粒6份； g.陰性對照無RNA酶水6份。
9.一種如權(quán)利要求1所述用于檢測豬痕病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟: a.使用權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,條件如下:42°C反轉(zhuǎn)錄5min；94°C預(yù)變性 2min; 94°C 20s，退火溫度 57°C 30 s，72°C 20 s，40 個循環(huán)； b.結(jié)果分析； 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定:在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽性；Ct值介于35-40為可疑，需重復(fù)檢 測；再次測定時該樣品Ct值〈35為陽性，Ct值> 35為陰性。
【文檔編號】C12Q1/70GK103436633SQ201310269949
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月29日
【發(fā)明者】劉湘濤, 吳錦艷, 田宏, 陳妍, 尚佑軍, 尹雙輝, 王光祥, 張克山, 楊順利, 劉永杰, 宋江偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所