一種快速檢測沙眼衣原體的實時熒光定量pcr檢測試劑盒及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測沙眼衣原體的實時熒光定量PCR檢測試劑盒及應用，涉及一種沙眼衣原體基因定量檢測技術。本發(fā)明由DNA裂解液、熒光定量PCR反應液、標準陽性品、陰性質控標準品組成。熒光定量PCR反應液含有正反向引物和熒光染料。本發(fā)明特異性好，靈敏度高，定量精確，能快速簡便地檢測沙眼衣原體的基因拷貝數(shù)，同時提供了一種沙眼衣原體細胞培養(yǎng)包涵體形成單位(IFU)計數(shù)與沙眼衣原體PCR檢測基因拷貝數(shù)之間進行相互換算的方法?？蓱帽景l(fā)明技術在分泌物等標本中進行沙眼衣原體基因定量檢測，且彌補了以往只能計數(shù)細胞內包涵體而不能計數(shù)細胞外沙眼衣原體的空白，具有無創(chuàng)傷，簡便、經濟、快速的特點，尤其可以進行沙眼衣原體基因拷貝數(shù)與IFU計數(shù)之間的換算，客觀定量，應用前景十分廣泛。
【專利說明】-種快速檢測沙眼衣原體的實時熒光定量PCR檢測試劑盒 及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種沙眼衣原體基因的快速檢測技術，即實時熒光定量PCR(聚合酶 鏈式反應）檢測沙眼衣原體基因的試劑盒，還涉及一種沙眼衣原體基因拷貝數(shù)與傳統(tǒng)沙眼 衣原體細胞培養(yǎng)包涵體形成單位（IFU)計數(shù)之間的換算方法。適用于沙眼衣原體快速定量 檢測及其應用。

【背景技術】
[0002] 沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，C. trachomatis)是一種嚴格胞內寄 生的原核細胞型微生物，具有獨特的生命周期，即原體（elementary bodies, EBs)感 染宿主細胞后發(fā)育為始體（reticulate bodies, RBs)，始體進一步發(fā)育分裂為原體從 宿主細胞釋放，重復感染過程。因此原體（EB)是感染型，與沙眼衣原體的感染能力 有關(Abdelrahman YM, Belland RJ ：The chlamydial developmental cycle. FEMS microbiology reviews2005, 29 (5) :949-959)，分布于細胞外，如生殖道的分泌物中的 沙眼衣原體以EB形式存在，可通過接觸傳播（Choroszy-Krol, I. C. , Frej-Madrzak，M., Jama-Kmiecik, A. , Bober, T. &Jolanta Sarowska, J. Characteristics of the Chlamydia trachomatis species-immunopathology and infections. 2012, 799-808) 〇 因此，通過檢 測分泌物中的沙眼衣原體EB的DNA，可作為是否具有傳染性的評估指標之一。沙眼衣原體 可導致沙眼，是人類致盲的主要因素，也可通過性傳播感染，是目前全球最常見的性傳播疾 病（Sexually Transmitted Diseases，STDs)病原體，尤以育齡期婦女生殖道沙眼衣原體的 感染率為高（Goulet V，de Barbeyrac B，Raherison S，et al. Grp CSF !prevalence of Chlamydia trachomatis !results from the first national population-based survey in France. Sex Transm Infect 2010;86:263-27)。沙眼衣原體感染的特征為易復發(fā)和隱 匿感染，若未經及時發(fā)現(xiàn)和有效治療，沙眼衣原體可上行感染導致盆腔炎癥疾?。╬elvic inflammatory disease，PID)或輸卵管性炎癥等而致不孕不育（Land JA，van Bergen JE， Morre SAiPostma MJ. Epidemiology ofChlamydia trachomatis infection in women and the cost-effectiveness of screening. Hum Reprod Update2010;16:189_204·)，且可誘 發(fā)因免疫病理反應而致的自身免疫性疾?。≧izzo，A.，et al.，The Role of Chlamydia and Chlamydophila Infections in Reactive Arthritis. Internal Medicine,2012. 51(1)： p. 113-117)。因此，沙眼衣原體己成為危及人類健康衛(wèi)生的重要原因之一，迫切需要開展沙 眼衣原體感染性疾病的早期診斷研究。
[0003] 傳統(tǒng)的沙眼衣原體的檢測方法主要有三種：（1)細胞生物學方法：如沙眼衣原體 的細胞分離培養(yǎng)。目前，國內外均常采用細胞分離培養(yǎng)法培養(yǎng)沙眼衣原體，計數(shù)細胞內包 涵體形成單位（IFU)來評價沙眼衣原體感染情況（Suchland RJ，Brown K，Rothstein DM， et al〇 Rifalazil pre-treatment of mammalian cell cultures prevents subsequent chlamydia infection[J]. Antimicrob Agents Chemother，2006,50 (2) :439-44)〇 該 方法也是目前臨床評價沙眼衣原體感染的"金標準"，但其包涵體形成單位（IFU)的計 數(shù)是通過顯微鏡觀察并人工計數(shù)的，往往帶有主觀因素，因此對技術人員的要求較高 (Carolyn MB. Current methods of Laboratory diagnosis of chlamydiatrachomatis infection[J]· Clinical Microbiology Reviews，1997，10(l) :160-4)。（2)免疫學方法檢 測：又可分為抗原檢測和抗體檢測。目前，臨床常采用的免疫層析快速試劑檢測沙眼衣原 體，雖然特異性較高，方便快捷，但靈敏度很低（劉玲麗，毛春麗，谷海瀛.金標記免疫層析 法測定沙眼衣原體檢測下限的確定[J].中國熱帶醫(yī)學，2008,8(3) :476-4)。而ELISA方 法則是通過檢測沙眼衣原體抗體的一種診斷方法，結果只能說明曾經或正在感染沙眼衣原 體，并不能直接反映沙眼衣原體的感染量和感染情況。（3)沙眼衣原體基因擴增PCR法： 近年來發(fā)展起來的實時熒光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)技術以其檢測靈敏度高、 特異性強、方便快捷、定量精確等特點在基因表達分析水平廣泛應用，在用于病原體檢測的 定性或和定量檢測等方面得到了廣泛的應用，并且已經成為病毒核酸定量檢測的主要方 法（Nellemann C, Vinggaard AM, Dalgaard M, et al. Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology[J]. Taxicology, 2001, 163 :29-38)> (McGoldrick A, Lowings JP, Ibata G, et al.A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with a fiuorogenic Probe (TaqMan) [J] ·J-virol.Methods,1998,72 ：125-135 ；BhudeviB, Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J]. Vet. Microbiol.2001,83 ： 1-00.) (Desire N, Dehee A, Schneider V, et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus TypelProviralLoad by a TaqMan Real-Time PCR Assay [J].J. Cline. Microbiol. 2001,39 ： 1303-1310. ；V. Borges, R. Ferreira, et al. Normalization strategies for real-time expression data in Chlamydia trachomatis[J]. Journal of Microbiological Methods. 2010,82 :256-264. )〇 國內多種病原體的熒光定量PCR檢測試劑盒也已經上市，如用于結核桿菌、乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒、HIV、支原體等的PCR檢測試劑盒。但沙眼衣原體的RT-PCR檢測試劑盒尚未 上市用于臨床標本的檢測和應用。
[0004] 綜上所述，本領域迫切需要開發(fā)出一種可檢測沙眼衣原體的快速、敏感、特異性 高，可定性也可定量的檢測試劑盒；尤其在分泌物中檢測沙眼衣原體原體，用于判斷感染者 是否具有傳染性一種指標；同時能夠在RT-PCR與IFU之間能夠精確互相換算，滿足動物實 驗等計數(shù)沙眼衣原體的需要。


【發(fā)明內容】

[0005] 1.本發(fā)明的目的在于補充現(xiàn)有沙眼衣原體檢測方法的不足，建立一種更加靈敏、 快速的定量檢測組織或分泌物中沙眼衣原體基因拷貝數(shù)的方法，提供一種沙眼衣原體實時 熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0006] 2.發(fā)明的另一個目的在于提供一種沙眼衣原體包涵體形成單位（IFU)計數(shù)法與 沙眼衣原體基因拷貝數(shù)之間進行相互換算的方法。即通過熒光定量PCR法快速檢測沙眼衣 原體基因拷貝數(shù)的方法，與目前傳統(tǒng)的沙眼衣原體細胞培養(yǎng)的包涵體形成單位（IFU)計數(shù) 法方法之間進行換算。適用于臨床標本檢測和動物實驗模型沙眼衣原體的感染劑量的確定 等方面的應用。
[0007] 應理解的是，本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言 是顯而易見的。
[0008] 本發(fā)明采用以下技術方案：
[0009] 一、PCR 試劑盒：
[0010] 該試劑盒包括：a) DNA裂解液b)熒光定量PCR反應液c)標準陽性品d)陰性質控 標準品；
[0011] 熒光定量PCR反應液中有含有引物和熒光染料，引物分為正向引物和反向引物；
[0012] 正向引物為 5' -CCTGTGGGGAATCCTGCTGAA-3'（SEQ ID NO :1);
[0013] 反向引物為 5' -GTCGAAAACAAAGTCACCATAGTA-3'（SEQ ID NO :2);
[0014] 熒光染料為SYBR Green I ;標準陽性品pET21a(+)/MOMP重組質粒是含有沙眼衣 原體基因組中ompA基因的重組質粒，該重組質?？梢栽诖竽c桿菌DH5ci中擴增；
[0015] 所述的PCR即為聚合酶鏈式反應，MOMP為沙眼衣原體主要外膜蛋白核苷酸序列。
[0016] 具體的說：
[0017] a)DNA裂解液包含：100mMTrisHCl(PH8·0)，5mMEDTA，200mMNaCl，0·2%SDS，蛋 白酶 Κ200μ g/ml ;
[0018] b)熒光定量PCR反應液包含：10ymol/L正向引物、ΙΟμπιοΙ/L反向引物、dNTPs、 MgCl2溶液、SYBR Green I染料工作液以及無菌雙蒸水組成。在本發(fā)明的一個具體方案中， 熒光定量PCR反應液由ΙΟμπιοΙ/L正向引物0. 2μ l、10ymol/L反向引物0. 2μ l、10mmol/L dNTPs0.4yl、MgCl225mmol/L1.6yl、5U TaqDNA 多聚酶 0.3yl、SYBR Green I 工作液（稀 釋 1000 倍）1 μ 1，ddH2014. 3 μ 1。反應液總體積 18 μ I ;
[0019] c)標準陽性品：標準陽性品為pET21a(+)/M0MP重組質粒。pET21a(+)/M0MP重組 質粒是含有沙眼衣原體基因組中ompA基因的重組質粒，該重組質粒含有1107bp的ompA基 因，PCR反應液中的特異性引物可以擴增該陽性模板中144bp的核苷酸片段。該標準品可 以在大腸桿菌DH5a中擴增。貯存濃度為2.5X10 9拷貝/μ?，使用前系列稀釋。該質粒轉 化大腸桿菌DH5 α后，經質粒提取試劑盒提取質粒，并用分光光度計測DNA濃度定量并稀釋 至2.5父109拷貝/^1，-201：貯存 ；
[0020] d)陰性質控標準品：陰性質控標準品為無菌雙蒸水。
[0021] 二、本試劑盒工作原理：
[0022] 在本發(fā)明提供的沙眼衣原體實時熒光定量PCR檢測試劑盒中，含有SYBR Green I 熒光染料，SYBR Green特異性的摻入DNA雙鏈時發(fā)出熒光，否則不發(fā)光。在PCR反應的退火 和延伸階段，隨著引物的延伸，SYBR Green染料特異性的摻入DNA雙鏈中，新擴增的DNA鏈 發(fā)熒光，所發(fā)出的熒光可以被實時熒光電量PCR儀中內置的熒光計檢測。熒光量的增加與 PCR產物的累積量呈正比例關系。對沙眼衣原體的定量可以通過與標準品的循環(huán)閾值（Ct， threshold cycles)相比較得到。Ct值是每個反應管內的突光信號達到設定的域值時所經 歷的循環(huán)數(shù)。它與樣品中起始模板數(shù)是呈一定比例關系的。樣品中起始模板數(shù)越多，Ct值 越小，反之，起始模板數(shù)越少，Ct值越大。利用標準陽性品進行梯度系列稀釋，得到每個稀 釋度相應的Ct值，并根據(jù)Ct值和已知的起始模板數(shù)繪制成一條標準曲線。再根掘待測樣 品的Ct值即可測出該樣品的起始模板數(shù)。
[0023] 在本發(fā)明提供的沙眼衣原體實時熒光定量PCR檢測試劑盒中，針對沙眼衣原體檢 測的特殊性，對反應條件進行了反復的摸索，如引物濃度、退火溫度等的優(yōu)化，最終確定了 沙眼衣原體定量檢測的方案，并研制出沙眼衣原體實時熒光定量PCR試劑盒。該試劑盒的 靈敏度很高，最低可以檢測出每個反應體系中100個拷貝的沙眼衣原體。該試劑盒可以滿 足快速實時定量檢測沙眼衣原體的要求。
[0024] 三、本發(fā)明的使用方法包括下列步驟：
[0025] A)對貯存濃度為2.5X109標準陽性品進行系列梯度稀釋，分別稀釋成原液 (2· 5Χ109)、2· 5Χ108,2· 5Χ107,2· 5Χ1〇6,2· 5Χ105,2· 5Χ104,2· 5Χ103,2· 5X102,共 8 個 濃度梯度；
[0026] Β)用DNA裂解液從待測樣品中提取DNA ;
[0027] C)分別取梯度稀釋的陽性標準品和從Β)步驟中提取的DNA與熒光定量PCR反應 液中，用熒光定量PCR儀進行PCR檢測；
[0028] D)通過比較待測樣品的Ct值與梯度稀釋的標準陽性品的Ct值，對待測樣品的起 始基因拷貝數(shù)進行定量檢測。
[0029] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種通過熒光定量PCR法檢測沙眼衣原體核苷酸 拷貝數(shù)來與目前傳統(tǒng)沙眼衣原體包涵體形成單位（IFU)計數(shù)法進行相互換算的方法。其特 征是：
[0030] 沙眼衣原體IFU與基因拷貝數(shù)之間呈線性關系，log沙眼衣原體基因的拷貝數(shù)（X) 與IogIFU(V)之間的關系為，利用該公式可以在沙眼衣原體IFU與基因拷貝數(shù)之間進行換 算。該換算方法，不僅克服了作為沙眼衣原體IFU計數(shù)方法主觀性強、易受外界條件干擾、 只能計數(shù)細胞內形成包涵體的沙眼衣原體的缺點外，還為臨床評估、動物模型的建立等提 供了精確定量的方法，同時還能對存在于細胞外的沙眼衣原體進行精確的計數(shù)并與細胞內 的包涵體進行比較，同步了細胞外和細胞內的感染量。具有非常廣闊的應用前景。
[0031] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下效果和優(yōu)點：
[0032] 1、與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明所提供的熒光定量PCR試劑盒具有特異性 好，靈敏度高，定量精確的特點。對每一個循環(huán)后的熒光數(shù)值變化進行采集，并于標準陽性 品的Ct值進行比較，實現(xiàn)了真正意義上的定量；
[0033] 2、檢測范圍廣，靈敏度高，標準品在IO9-IO2之間內有極好的線性關系，檢測范圍 達到9個數(shù)量級，最低可以檢測反應體系中100個拷貝的沙眼衣原體，這是其他方法無法比 擬的；
[0034] 3、步驟簡單，可操作性強、可進行高通量的樣品檢測；
[0035] 4、可利用分泌物進行沙眼衣原體的檢測，也就是對自宿主細胞釋放的具有感染性 的原體進行檢測，可以判斷感染性，操作簡便，結果準確，且可定量。
[0036] 5、可在沙眼衣原體IFU計數(shù)與沙眼衣原體基因拷貝數(shù)之間進行換算，克服了肉眼 顯微鏡下計數(shù)的缺點，確立了沙眼衣原體IFU與基因拷貝數(shù)之間的關系，同步了細胞外和 細胞內的沙眼衣原體感染量；可達到客觀準確計數(shù)的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖I :real-time PCR檢測梯度稀釋標準品的Ct值及其溶解曲線。
[0038] 圖中，"A"為real-time PCR檢測梯度稀釋標準品的Ct值曲線圖：橫坐標為標準 品基因拷貝數(shù)的IoglO，縱坐標為相應的Ct值；"B"為real-time PCR檢測標準品的溶解曲 線。
[0039] 圖2 :熒光定量PCR檢測沙眼衣原體基因拷貝數(shù)與沙眼衣原體包涵體形成單位 (IFU)之間的標準曲線。
[0040] 圖中，X軸為沙眼衣原體基因拷貝數(shù)（copies/ml)的log值，Y軸為相應IFU數(shù)量 (IFU/ml)的 log 值。該曲線的線性關系為 y = 0· 6262X-0. 071R2 = 0· 9979。

【具體實施方式】
[0041] 下面將結合具體實例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施實例僅用于說明本 發(fā)明而不要求限制本發(fā)明要求保護的范圍。下列的實施實例中均未注明具體的實驗條件 和方法，通常按常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992,分子克隆指南（第三 版）；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982,或按 照制造廠商所建議的條件。
[0042] 實施例1、沙眼衣原體實時熒光定量PCR試劑盒的組成與配制及其定量檢測待測 樣品中沙眼衣原體。
[0043] 一、組成與配置
[0044] I、DNA 裂解液（裂解液）：IOOmM Tris HCl (PH8. 0)，5mM EDTA，200mM NaCl，0· 2 % SDS，蛋白酶 Κ200μ g/ml ;
[0045] 2、熒光定量PCR反應液組成：熒光定量PCR反應液由10 μ mol/L正向引物0. 2 μ I、 10μmol/L反向引物0·2μl、10mmol/LdNTPs0·4μl、MgCl225mmol/Ll·6μl、5UTaqDNA多 聚酶 0· 3 μ 1、SYBR Green I 工作液 1 μ 1 和 ddH2014. 3 μ 1，總體積 18 μ 1 ;
[0046] 3、標準陽性品貯存液：貯存濃度為2. 5 X IO9拷貝/ μ 1的pET21a (+) /MOMP重組質 粒；
[0047] 4、陰性質控標準品為無菌雙蒸水。
[0048] 二、熒光定量PCR試劑盒檢測待測樣品中沙眼衣原體基因拷貝數(shù)
[0049] 1、將200 μ 1待測標本4°C HOOrpm離心10min，棄去上清，取沉淀加入200 μ I DNA 裂解液重懸，55°C水浴2h，加入等體積異丙醇，-20°C沉降過夜。4°C 12000rpm離心20min， 棄去上清，預冷的70%乙醇洗滌2遍。30 μ 1無菌雙蒸水溶解DNA。取2 μ 1做PCR反應；
[0050] 2、將標準陽性品（試劑c)進行系列梯度稀釋，分別稀釋成2.5X 108, 2.5X 107， 2. 5 X 106, 2. 5 X 105, 2. 5 X 104, 2. 5 X 103, 2. 5 X 102,加原液（2. 5 X IO9)共 8 個濃度梯度；
[0051] 3、分別取實時定量熒光PCR反應液（試劑b) 18 μ 1，加入梯度稀釋的標準陽性品各 2 μ 1和2 μ 1待測樣品DNA，分別加入不同的反應管中，并設置陰性對照；
[0052] 4、將反應管放入實時熒光定量PCR儀中做PCR平行檢測。每管設定3個平行副 孔；
[0053] 5、擴增程序為94°C預變性10min，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸10min，擴 增40個循環(huán)。將熒光檢測設定在每個循環(huán)結束時進行；
[0054] 6、循環(huán)結束后，運行實時熒光定量PCR儀自帶軟件，根據(jù)標準陽性品的Ct值繪制 標準曲線，讀取待測樣品基因拷貝數(shù)（圖1)。
[0055] 結果為：標準陽性模板 2. 5 X 109, 2. 5 X 108, 2. 5 X 107, 2. 5 X 106, 2. 5 X 105， 2· 5Χ104,2· 5Χ103,2· 5X102Ct 值分別為 9· 79、10· 55、14· 08、17· 08、20· 14、20· 45、2L 91、 22. 58,陰性對照為0,待測樣品Ct值為22. 12,定量檢測反應體系中沙眼衣原體基因拷貝數(shù) 為 2· 13X104。
[0056] 實施例2、熒光定量PCR試劑盒檢測沙眼衣原體基因拷貝數(shù)與沙眼衣原體包涵體 形成單位（IFU)與之間的線性關系。
[0057] 1、沙眼衣原體分離培養(yǎng)：將hela229細胞加入六孔板中，每孔IO6個，加入2ml/孔 的細胞培養(yǎng)液，5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)16個小時至細胞長成單層。棄去細胞培養(yǎng)基，力口 入促沙眼衣原體感染培養(yǎng)基Iml/孔，5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)30min。棄去促沙眼衣原 體分離培養(yǎng)基，-80°C保存的沙眼衣原體4°C解凍，每孔加入IO 6Copies的沙眼衣原體感染 hela229細胞和Iml的細胞培養(yǎng)基。30°C，2000rpm，水平離心60min，5% CO2培養(yǎng)箱中37°C 培養(yǎng)2h。每孔加入Iml沙眼衣原體培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48h。顯微鏡下觀察 細胞內有明顯包涵體形成；
[0058] 2、IFU計數(shù)：事先在六孔板中放置IOmm直徑的蓋玻片，按上述步驟培養(yǎng)沙眼衣原 體。培養(yǎng)結束后，取出蓋玻片，甲醇固定IOmin,吉姆薩染色30min，無水乙醇沖洗3遍，ddH 20 清洗3遍，晾干，脫水，封片觀察。400X顯微鏡下計數(shù)包涵體形成單位（IFU)，觀察30個視 野，取平均值，并乘以654,即得該孔中包涵體數(shù)量；
[0059] 3、沙眼衣原體的收集：每孔加入沙眼衣原體保存液1ml，用細胞刮刀收集細胞；
[0060] 4、衣原體基因組DNA的提?。簩?)步收集的含沙眼衣原體包涵體（IFU)按所需要 求分別稀釋成10 4、103、102、10,按實例1二部分1)步所示提取相應的DNA ;
[0061] 5、實時熒光定量PCR試劑盒檢測相應IFU中沙眼衣原體基因拷貝數(shù)：按實例1所 示步驟檢測10 4、103、102、10IFU中沙眼衣原體基因拷貝數(shù)；
[0062] 6、重復1?5步兩次，所得結果求均值后，經數(shù)據(jù)處理分析，分別將IFU與所對應 的沙眼衣原體基因拷貝數(shù)取IoglO，以log沙眼衣原體基因拷貝數(shù)為橫坐標GO，IogIFU為 縱坐標（y)，得到它們之間的關系為y = 0. 6262x-0. 071R2 = 0. 9979 (圖2)。
[0063] 實施例3、熒光定量PCR試劑盒檢測沙眼衣原體基因拷貝數(shù)換算為沙眼衣原體包 涵體形成單位（IFU)
[0064] 根據(jù)實例1所述步驟檢測出待測樣品反應體系中沙眼衣原體的基因拷貝數(shù)為 2. 13X104,樣品總量為200μ 1，提取DNA30y 1，上樣量為2μ 1，則200μ 1樣品中沙眼 衣原體的總基因拷貝數(shù)為3. 2Χ105,根據(jù)【專利附圖】

【附圖說明】所示的標準曲線（圖2)，公式為y = 0. 6262x-0. 071R2 = 0. 9979, X為log基因拷貝數(shù)，y為loglFU。計算得相應的IFU為 2· 4X103。
[0065] 實施例4、熒光定量PCR試劑盒檢測小鼠生殖沙眼衣原體感染模型分泌物中沙眼 衣原體
[0066] 1、小鼠生殖道沙眼衣原體感染模型的建立：BALB/c小鼠感染沙眼衣原體之前 l〇d，注射黃體酮2. 5mg/只。用PBS稀釋IFU為IO6直接攻擊小鼠生殖道，將小鼠倒置懸掛 半小時，使沙眼衣原體充分接觸生殖道上皮細胞；
[0067] 2、小鼠生殖道分泌物的采集：沙眼衣原體攻擊后3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、 24d、
[0068] 27d用200 μ I PBS反復沖洗小鼠生殖道，獲取陰道分泌物；
[0069] 3、沙眼衣原體的分離培養(yǎng)和IFU計數(shù)：如實例2所述分離培養(yǎng)沙眼衣原體并進行 IFU計數(shù)（具體見表1);
[0070] 4、熒光定量PCR試劑盒檢測細胞分離培養(yǎng)后IFU中沙眼衣原體：如實例1所述步 驟，用細胞刮刀收取含沙眼衣原體包涵體的hela229細胞，提取DNA后，用熒光定量PCR試 劑盒檢測IFU中沙眼衣原體基因拷貝數(shù)（具體見表1)。結合實例3所述IFU計數(shù)與沙眼衣 原體基因拷貝數(shù)的換算方法計算得理論上對應的IFU數(shù)量（具體見表1)。
[0071] 結果為，用Real-time PCR法定量檢測小鼠陰道分泌物中沙眼衣原體DNA拷貝數(shù)， 經本專利公開的換算方法計算得到的IFU數(shù)量與細胞培養(yǎng)法檢出的IFU數(shù)量比較，經配對 T檢驗的統(tǒng)計學分析，兩組之間無顯著性差異（T = -. 266, P = 0. 797 > 0. 05)。
[0072] 表1小鼠生殖道沙眼衣原體感染模型分泌物中沙眼衣原體的及換算方法的檢驗
[0073]

【權利要求】
1. 一種快速定量檢測沙眼衣原體的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于： 該試劑盒由DNA裂解液、熒光定量PCR反應液、標準陽性品、陰性質控標準品組成； 熒光定量PCR反應液中有含有引物和熒光染料，引物分為正向引物和反向引物：SEQ IDNO :1、SEQ ID NO :2 ;SYBR Green I 染料工作液；dNTPs ;標準陽性品pET21a(+)/M0MP重組 質粒是含有沙眼衣原體基因組中ompA基因的重組質粒，該重組質?？梢栽诖竽c桿菌DH5 α 中擴增； 所述的PCR即為聚合酶鏈式反應，Μ0ΜΡ為沙眼衣原體主要外膜蛋白。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種快速定量檢測沙眼衣原體的熒光定量PCR檢測試劑盒， 其特征是： 熒光定量PCR反應液是由10 μ mol/L正向引物、10 μ mol/L反向引物、TaqDNA聚合酶、 SYBR Green I染料工作液、dNTP、MgCl2溶液以及無菌雙蒸水組成。
3. 根據(jù)權利要求1所述的PCR試劑盒，其特征是： 標準陽性品pET21a(+)/M0MP重組質粒所包含的ompA基因的1107bp核苷酸序列為： SEQ ID NO ：3 ； 特異性正向和反向引物所檢測的標準陽性品上的一段144bp核苷酸序列：SEQ ID NO: 4。
4. 根據(jù)權利要求1所述熒光定量PCR試劑盒在快速定量檢測沙眼衣原體中的應用。
5. -種沙眼衣原體包涵體形成單位（IFU)計數(shù)法與沙眼衣原體基因拷貝數(shù)之間進行 相互換算的方法。即通過熒光定量PCR法快速檢測沙眼衣原體基因拷貝數(shù)的方法，與目前 傳統(tǒng)的沙眼衣原體細胞培養(yǎng)的包涵體形成單位（IFU)計數(shù)法方法之間進行換算。其特征 是： 沙眼衣原體IFU與基因拷貝數(shù)之間呈線性關系，log沙眼衣原體的基因拷貝數(shù)（X)與 l〇gIFU(y)之間的關系為y = 0. 6262x-0. 071R2 = 0. 9979,利用該公式可以在沙眼衣原體 IFU與基因拷貝數(shù)之間進行換算。
【文檔編號】C12Q1/04GK104278080SQ201310287577
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月4日 優(yōu)先權日:2013年7月4日
【發(fā)明者】張麗芳, 薛向陽, 朱珊麗, 朱小春, 涂建欣 申請人:溫州醫(yī)科大學