一種鑒定子鼠基因型的pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，包括：（1）通過Blast兩種品系小鼠的線粒體序列，找到4個(gè)SNP位點(diǎn)，選取其中一個(gè)位點(diǎn)以子代小鼠線粒體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（2）PCR結(jié)束后對PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)陽性條帶，則進(jìn)行LDR反應(yīng)；其中，LDR反應(yīng)中，每一個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)三條探針；（3）LDR結(jié)束后，對LDR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束后，利用軟件提取泳道數(shù)據(jù)，即可。本發(fā)明通過鑒定子代小鼠母本，比較子代表型差異，將母體效應(yīng)和基因類型聯(lián)系起來，補(bǔ)充了以往研究中通過改變孕鼠的營養(yǎng)狀況或藥物激素暴露等方式，從環(huán)境因素揭示母體效應(yīng)的不足，擴(kuò)展了人們對母體效應(yīng)的遺傳學(xué)機(jī)制的認(rèn)識。
【專利說明】—種鑒定子鼠基因型的PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于小鼠遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種鑒定子鼠基因型的PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002]性發(fā)育是指個(gè)體性成熟并獲得生殖能力的過程。下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)的重新激活對哺乳動(dòng)物性發(fā)育的啟動(dòng)起著決定性的作用。該性狀是一個(gè)復(fù)雜性狀，在個(gè)體水平上受多種遺傳因素和環(huán)境因素的影響。性發(fā)育的啟動(dòng)除了受個(gè)體本身的基因型影響外，還受到母體效應(yīng)的影響。母體效應(yīng)主要包含兩方面的因素，胚胎發(fā)育的子宮環(huán)境以及由于父本及母本來源的不同所產(chǎn)生的基因印跡的影響。
[0003]流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，母親的身高能直接影響胎兒的大小，同母異父的同胞出生體重的相似性小于同父異母的同胞的出生體重(Gluckman PD, Hanson MA (2004), Maternalconstraint of fetal growth and its consequences.，Semin Fetal NeonatalMed9:419 - 425);另外，試管嬰兒的出生體重只與受體母親的體重有關(guān)而與供卵母親的體重?zé)o關(guān)(Brooks AA, Johnson MR, Steer PJ, Pawson ME, Abdalla HI (1995), Birthweight:nature or nurture?Early Hum Dev42:29 - 35)。大鼠實(shí)驗(yàn)顯不，在妊娠過程中給予母鼠低蛋白飲食，會(huì)導(dǎo)致雌性后代陰門開啟時(shí)間延遲；而以6-不飽和脂肪酸喂飼妊娠期雌鼠，其雌性后代的陰門開啟時(shí)間提前；而給妊娠期雌鼠注射雌激素，會(huì)導(dǎo)致其雌性后代的性發(fā)育時(shí)間提前并增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)(Hilakiv1-Clarke L, Clarke R, Onojafe I, RaygadaM, CHO E, Lippman M, (1997)A maternal diet high in n26polyunsaturated fats altersmammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female ratoffspring Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.94:9372 - 9377)。
[0004]早期胚胎中基因的表達(dá)還受到基因印跡的調(diào)控，基因印記對個(gè)體出生前后的發(fā)育，行為和疾病都發(fā)揮作用。有.研究表明，小鼠的父源性印跡基因Pgel表現(xiàn)出很強(qiáng)的方向性和親源效應(yīng)，父系為Pgel (中胚層特異性轉(zhuǎn)錄的)突變的小鼠表現(xiàn)出發(fā)育遲緩，而且雌性多為不育，而這種表型與其本身的基因型無關(guān)(Lefebvre, L., S.Viville, S.C.Barton, F.1shino,E.B.Keverne et al., (1998), Abnormal maternal behaviour andgrowth retardation associated with loss of the imprinted gene Mest.Nat.Genet.20:163 - 169)。與此相似的是小鼠父源性基因3的突變會(huì)影響子代的胚胎發(fā)育和出生后的生長(Curley, J.P.，S.Barton, A.Surani and E.B.Keverne, (2004), Coadaptationin mother and infant regulated by a paternally expressed imprinted gene.Proc.R.Soc.Lond.Ser.B271:1303 - 1309)。
[0005]目前，研究性發(fā)育調(diào)控的母體因素多從營養(yǎng)學(xué)角度來進(jìn)行，一般采用對孕期母本的營養(yǎng)攝入改變或激素藥物暴露來研究胚胎發(fā)育環(huán)境對子代出生后性狀的影響，沒有涉及母本基因背景的影響研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，該方法通過鑒定子代小鼠母本，比較子代表型差異，將母體效應(yīng)和基因類型聯(lián)系起來，補(bǔ)充了以往研究中通過改變孕鼠的營養(yǎng)狀況或藥物激素暴露等方式，從環(huán)境因素揭示母體效應(yīng)的不足，擴(kuò)展了人們對母體效應(yīng)的遺傳學(xué)機(jī)制的認(rèn)識。
[0007]本發(fā)明的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，包括:
[0008](I)通過Blast兩種品系小鼠的線粒體序列，找到4個(gè)SNP位點(diǎn)，選取其中一個(gè)位點(diǎn)以子代小鼠線粒體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，PCR引物為:
[0009]上游引物:5，-CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3，；
[0010]下游引物:5，-TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3，；
[0011](2) PCR結(jié)束后對PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)陽性條帶，則進(jìn)行LDR反應(yīng)；其中，LDR反應(yīng)中，每一個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)三條探針,一條為位點(diǎn)通用探針(Allele-universalprobe)可以與模板完全配對，其5’端磷酸化，3’端用FAM熒光標(biāo)記；另外兩條位點(diǎn)特異性探針(Allele-specific probes)分別對應(yīng)該多態(tài)性位點(diǎn)的兩種等位基因,位點(diǎn)特異性探針的長度相差若干堿基，從而導(dǎo)致其連接產(chǎn)物長度亦有同樣的差異，在377測序系統(tǒng)上，兩種不同長度的連接產(chǎn)物將表現(xiàn)為不同位置的峰，從而得到鑒別；本發(fā)明采用的特異性探針是:
[0012]mtDNA_G: TTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAC ；
[0013]mtDNA_A: TTTTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAT ；
[0014](3 )LDR結(jié)束后，對LDR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束后，利用軟件提取泳道數(shù)據(jù)，即可。
[0015]所述步驟(I)中的兩.種品系小鼠分別為B6C3HF1和C3HB6F1。
[0016]所述步驟(I)中作為模板的SNP位點(diǎn)為G9349A。
[0017]所述步驟(I)中的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95°C 15min,94°C 30s, 55 °C lmin,72°C lmin，72°C lOmin，共 35 個(gè)循環(huán)。
[0018]所述步驟(2)中的凝膠電泳檢測為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0019]所述步驟(2)中的LDR反應(yīng)體系為:ddH205.95 μ L，10XLDR Bufferl μ L，探針總體積I μ L, Taq DNA連接酶0.05 μ L, PCR產(chǎn)物2 μ L，總體積10 μ L。
[0020]所述步驟(2)中的LDR反應(yīng)條件為:94°C 2min，94°C 30s, 50°C 2min，共35個(gè)循環(huán)。[0021 ] 所述步驟(3 )中的凝膠電泳檢測為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
[0022]有益.效果
[0023]本發(fā)明通過鑒定子代小鼠母本，比較子代表型差異，將母體效應(yīng)和基因類型聯(lián)系起來，補(bǔ)充了以往研究中通過改變孕鼠的營養(yǎng)狀況或藥物激素暴露等方式，從環(huán)境因素揭示母體效應(yīng)的不足，擴(kuò)展了人們對母體效應(yīng)的遺傳學(xué)機(jī)制的認(rèn)識。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為B6C3HF1的小鼠LDR分型結(jié)果圖，分子片段大小為82bp ；
[0025]圖2為C3HB6F1的小鼠LDR分型結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0027]實(shí)施例1
[0028]通過Blast兩種品系小鼠(B6C3HF1和C3HB6F1)的線粒體序列，找到4個(gè)SNP位點(diǎn)，選取其中一個(gè)位點(diǎn)(G9349A)以子代小鼠線粒體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95°C 15min，94°C 30s, 55 °C lmin, 72 °C lmin, 72 °C lOmin，共 35 個(gè)循環(huán)；其中，PCR引物為:上游引物:5’ - CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3’ ；下游引物:5， -TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3，；
[0029]PCR結(jié)束后，取8μ I PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)陽性條帶，則進(jìn)行LDR反應(yīng)。
[0030]LDR反應(yīng)中，每一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)需設(shè)計(jì)三段探針。其中一條位點(diǎn)通用探針(Allele-universalprobe)可以與模板完全配對,其5’端磷酸化,3’端用FAM突光標(biāo)記；另外兩條位點(diǎn)特異性探針(Allele-specific probes)分別對應(yīng)該多態(tài)性位點(diǎn)的兩種等位基因。位點(diǎn)特異性探針的長度相差若干堿基，從而導(dǎo) 致其連接產(chǎn)物長度亦有同樣的差異。在377測序系統(tǒng)上，兩種不同長度的連接產(chǎn)物將表現(xiàn)為不同位置的峰，從而得到鑒別。
[0031 ] 本實(shí)施例使用的LDR探針:
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，包括: (1)通過Blast兩種品系小鼠的線粒體序列，找到4個(gè)SNP位點(diǎn)，選取其中一個(gè)位點(diǎn)以子代小鼠線粒體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，PCR引物為: 上游引物:5 ’ -CATTCTTCATGGCTACTGGATTC-3，； 下游引物:5’ -TGCTCATGGTAGTGGAAGTAGAA-3’ ； (2)PCR結(jié)束后對PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)陽性條帶，則進(jìn)行LDR反應(yīng)；其中，LDR反應(yīng)中，每一個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)三條探針，一條為位點(diǎn)通用探針，另外兩條位點(diǎn)特異性探針分別為:
mtDNA_G: TTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAC ；
mtDNA_A: TTTTGGAGACGTATAGGAAAAGTCAGAT ； (3)LDR結(jié)束后，對LDR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束后，利用軟件提取泳道數(shù)據(jù)，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(I)中的兩種品系小鼠分別為B6C3HF1和C3HB6F1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(I)中作為模板的SNP位點(diǎn)為G9349A。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(I)中的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95V 15min,94°C 30s,55°C lmin,72°C lmin,72°C lOmin，共 35 個(gè)循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(2)中的凝膠電泳檢測為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(2)中的LDR反應(yīng)體系為:ddH205.95 μ L, IOXLDR Bufferl μ L，探針總體積I μ L，Taq DNA連接SI 0.05 μ L, PCR 產(chǎn)物 2 μ L，總體積 10 μ L0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(2)中的LDR反應(yīng)條件為:94°C 2min,94°C 30s, 50°C 2min，共35個(gè)循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定子鼠基因型的PCR方法，其特征在于:所述步驟(3)中的凝膠電泳檢測為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436603SQ201310296488
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月15日
【發(fā)明者】周宇荀, 管清華, 肖君華, 李凱 申請人:東華大學(xué)