一種基于特異引物鑒定5種常見儲糧扁谷盜的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定或輔助鑒定5種常見儲糧扁谷盜的試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒包括如下5個引物對中的至少一對：引物對1（序列1和序列2）、引物對2（序列3和序列4）、引物對3（序列5和序列6）、引物對4（序列7和序列8）和引物對5（序列9和序列10）。實驗證明，利用本發(fā)明所提供的試劑盒對儲糧扁谷盜進行種的鑒定，與傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法相比，該方法不需要形態(tài)分類學(xué)基礎(chǔ)且實現(xiàn)了對非成蟲態(tài)的鑒定；而與其它分子生物學(xué)鑒定方法相比，該方法簡化了鑒定常見儲糧扁谷盜的分子檢測步驟，具有操作簡便、耗時較短、靈敏度高且較穩(wěn)定，結(jié)果直觀等特點，為進一步鑒定扁谷盜屬近緣種的研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種基于特異引物鑒定5種常見儲糧扁谷盜的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于鑒定或輔助鑒定5種常見儲糧扁谷盜的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]扁谷盜隸屬于鞘翅目(Coleoptera)、扁谷盜科(Laemophloeidae)、扁谷盜屬(Cryptolestes)，該屬國內(nèi)外共記述有20余種，其中危害儲糧的扁谷盜約為10種，在世界范圍內(nèi)分布較為廣泛的為銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜等5種。
[0003]鞘翅目昆蟲在儲糧害蟲中數(shù)量最大、種類最多、檢疫意義最突出，扁谷盜即是鞘翅目儲糧害蟲中具有重要經(jīng)濟意義的一個類群，其幼蟲和成蟲可危害谷物、豆類、油料等多種農(nóng)產(chǎn)品與其加工產(chǎn)品，大量發(fā)生時能造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，主要通過農(nóng)副產(chǎn)品的貿(mào)易進行跨境傳播。近年來，我國進出境檢驗檢疫部門截獲的扁谷盜批次明顯增多。明確口岸截獲和糧庫發(fā)生的儲糧扁谷盜種類，對檢疫決策制定和有害生物治理具有十分重要的意義。由于扁谷盜個體微小(體長2_左右)且種間外部形態(tài)極為相似等原因，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)僅能鑒定具有明顯特征形態(tài)的成蟲，對鑒定人員的形態(tài)分類學(xué)技術(shù)要求較高，并不能滿足快速、準(zhǔn)確鑒定扁谷盜種類的需求。
[0004]近幾年發(fā)展起來的分子生物學(xué)鑒定方法主要包括同工酶電泳技術(shù)、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)技術(shù)、隨機擴增DNA多態(tài)性分析(RAPD)技術(shù)、核酸序列分析技術(shù)及特異引物PCR技術(shù)。限制性片段長度多態(tài)性PCR技術(shù)結(jié)果較為準(zhǔn)確，但篩選所需限制性內(nèi)切酶種類的工作量較大。截至目前，未見針對銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜這5種世界常見儲糧扁谷盜的分子鑒定技術(shù)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的試劑盒。
[0006]本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的試劑盒，可包括如下5個引物對中的至少一對:
[0007](1)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I ;
[0008](2)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ；
[0009](3)由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3 ；
[0010](4)由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4 ；
[0011](5)由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5。
[0012]其中，序列I由21個核苷酸組成；序列2由20個核苷酸組成；序列3由21個核苷酸組成；序列4由23個核苷酸組成；序列5由22個核苷酸組成；序列6由22個核苷酸組成；序列7由21個核苷酸組成；序列8由22個核苷酸組成；序列9由19個核苷酸組成?’序列10由22個核苷酸組成。
[0013]在所述試劑盒中，組成每個引物對的兩條單鏈DNA的摩爾數(shù)相等。[0014]所述儲糧扁谷盜可為如下中的至少一種:銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜。
[0015]在所述試劑盒中，所述引物對I特異于銹赤扁谷盜；所述引物對2特異于長角扁谷盜；所述引物對3特異于微扁谷盜；所述引物對4特異于土耳其扁谷盜；所述引物對5特異于開普扁谷盜。
[0016]本發(fā)明的再一個目的是提供所述試劑盒的制備方法。
[0017]所述試劑盒的制備方法，具體可包括如下步驟:將組成所述試劑盒中各引物對的各單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi):PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
[0018]本發(fā)明的還一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的方法。
[0019]本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的方法，可為如下(a)_ (e)中的任一種:
[0020](a)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為銹赤扁谷盜的方法，包括如下(al)和(a2)的步驟:
[0021](al)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I進行PCR擴增；
[0022](a2)檢測步驟(al)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為銹赤扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有158bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為銹赤扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為銹赤扁谷盜；
[0023](b)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為長角扁谷盜的方法，包括如下(bl)和(b2)的步驟:
[0024](bl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2進行PCR擴增；
[0025](b2)檢測步驟(bl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為長角扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有371bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為長角扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為長角扁谷盜；
[0026](C)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為微扁谷盜的方法，包括如下(Cl)和(c2)的步驟:
[0027](Cl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3進行PCR擴增；
[0028](c2)檢測步驟(Cl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為微扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有585bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為微扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為微扁谷盜；
[0029](d)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為土耳其扁谷盜的方法，包括如下(dl)和(d2)的步驟:
[0030](dl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4進行PCR擴增；[0031](d2)檢測步驟(dl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為土耳其扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有355bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為土耳其扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為土耳其扁谷盜；
[0032](e)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為開普扁谷盜的方法，包括如下(el)和(e2)的步驟:
[0033](el)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5進行PCR擴增；
[0034](e2)檢測步驟(el)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為開普扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有289bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為開普扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為開普扁谷盜。
[0035]在上述方法中，步驟(a)_步驟(e)中，所有的所述進行PCR擴增的退火溫度均為50。。。
[0036]在上述方法中，所述引物對1、所述引物對2、所述引物對3、所述引物對4和所述引物對5，組成每個引物對的兩條單鏈DNA在各自的PCR反應(yīng)體系中的摩爾比均為1:1。在本發(fā)明中，每個引物對的兩條單鏈DNA在各自的PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度均為0.2 μ M。
[0037]在上述方法中，步驟(a)中，所述158bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列11 ;步驟(b)中，所 述371bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列12 ;步驟(c)中，所述585bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列13 ;步驟(d)中，所述355bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列14 ;步驟(e)中，所述289bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列15。
[0038]上述任一所述鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的方法中，所述待測儲糧扁谷盜屬于扁谷盜科(Laemophloeidae)的扁谷盜屬(Cryptolestes),具體為銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜中的至少一種。
[0039]本發(fā)明針對銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜這5種世界常見儲糧扁谷盜，基于mtDNA COI基因序列分別設(shè)計了特異引物，可直接鑒別以上5種儲糧扁谷盜。與傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法相比，該方法不需要形態(tài)分類學(xué)基礎(chǔ)且實現(xiàn)了對非成蟲態(tài)的鑒定；而與其它分子生物學(xué)鑒定方法(如限制性片段長度多態(tài)性PCR、核酸序列分析)相比，該方法簡化了鑒定常見儲糧扁谷盜的分子檢測步驟，具有操作簡便、耗時較短、靈敏度高且較穩(wěn)定，結(jié)果直觀等特點，為進一步鑒定扁谷盜屬近緣種的研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為用于鑒定銹赤扁谷盜的引物對CF84F21/CF222R20的特異性檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盜(河南商丘)；4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)；5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江);8，9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南?？?；16:陰性對照(ddH20)。[0041]圖2為用于鑒定長角扁谷盜的引物對CP53F21/CP401R23的特異性檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格);2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格);3:土耳其扁谷盜(河南商丘);4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)；5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江);8，9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南?？?；16:陰性對照(ddH20)。
[0042]圖3為用于鑒定微扁谷盜的引物對C038F22/C0601R22的特異性檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盜(河南商丘)；4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)；5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江)；8,9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南?？?；16:陰性對照(ddH20)。
[0043]圖4為用于鑒定土耳其扁谷盜的引物對CT81F21/CT414R22的特異性檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盜(河南商丘)；4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)；5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江);8，9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南?？?；16:陰性對照(ddH20)。
[0044]圖5為用于鑒定開普扁谷盜的引物對CC82F19/CC349R22的特異性檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格);2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格);3:土耳其扁谷盜(河南商丘);4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)； 5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江);8，9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南海口)；16:陰性對照(ddH20)。
[0045]圖6為用于鑒定銹赤扁谷盜的引物對CF84F21/CF222R20的靈敏度檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
[0046]圖7為用于鑒定長角扁谷盜的引物對CP53F21/CP401R23的靈敏度檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
[0047]圖8為用于鑒定微扁谷盜的引物對C038F22/C0601R22的靈敏度檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2:DNA模板用量5ng ；3:DNA模板用量Ing ；4:DNA模板用量0.5ng ；5:DNA模板用量0.1ng ；6:DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
[0048]圖9為用于鑒定土耳其扁谷盜的引物對CT81F21/CT414R22的靈敏度檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6:DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
[0049]圖10為用于鑒定開普扁谷盜的引物對CC82F19/CC349R22的靈敏度檢測結(jié)果。其中，泳道M為DNA相對分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
【具體實施方式】
[0050]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0051]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052]5種儲糧扁谷盜:銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜。其中，銹赤扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、美國堪薩斯州種群、山東濟寧種群、廣東湛江種群；長角扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、美國堪薩斯州種群、湖北武漢種群、海南?？诜N群；微扁谷盜涉及如下地理種群:云南瀘西種群；土耳其扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、河南商丘種群；開普扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群。以上5種儲糧扁谷盜記載在“謝更祥，唐易，張連中等.海南地區(qū)扁谷盜抗藥性和實倉防治研究.糧食儲藏 ，2013 (I):9-12”、“祝長清等.河南昆蟲志鞘翅目(一).河南科學(xué)技術(shù)出版社，1999-12出版”、“蔣慶慈，黃輔元，姜武峰等.幾種主要儲糧害蟲對磷化氫的抗性抽測報告.糧油倉儲科技通訊，1992 (6):46-52”、uZuzana Kucerova, Vaclav Stejskal.Comparative egg morphology of silvanid andalaemophloeid beetles (Coleptera)pccurring in stored products.Journal of StoredProducts Research，2002(38):219-227”、“RENNIE ROESLI, BHADRIRAJU SUBRAMANYAM, etal.Stored-Product Insects Associated with a Retail Pet Store Chain in Kansas.JOURNAL OF E⑶NOMIC ENTOMOLOGY, 1958-1966”、“David W.Hagstrum.1mmigration ofinsects into bins storing newly harvested wheat onl2Kansas farms.Journal ofStored Products Research, 2001 (37): 221-229”、“張永富.防治銹赤扁谷盜值得關(guān)注的問題.糧油倉儲科技通訊，2002 (1):33-40”、“劉永平，張生芳.我國微扁谷盜的發(fā)現(xiàn)及初步調(diào)查研究.植物檢疫，1984 (3):1-4”、“商永輝，杜明華.探索書虱、銹赤扁谷盜綜合防治的措施.137-143” 中。
[0053]實施例1、針對5種世界常見儲糧扁谷盜的特異引物的設(shè)計與合成
[0054]一、5種世界常見儲糧扁谷盜mtDNA COI序列的獲得
[0055]實驗材料:涉及5種儲糧扁谷盜，具體為銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜。其中，銹赤扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、美國堪薩斯州種群、山東濟寧種群、廣東湛江種群；長角扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、美國堪薩斯州種群、湖北武漢種群、海南海口種群；微扁谷盜涉及如下地理種群:云南瀘西種群；土耳其扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、河南商丘種群；開普扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群。
[0056](I)扁谷盜基因組DNA的提取
[0057]采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書操作，提取單頭扁谷盜成蟲去除腹部后蟲體或單頭非成蟲態(tài)整個蟲體的總DNA，根據(jù)提取效果做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，保證提取DNA質(zhì)量良好，可用于下一步實驗。具體提取程序如下:
[0058]①取待測的成蟲樣品在雙目解剖鏡下去除其腹部，將無腹部的扁谷盜成蟲樣品或整頭非成蟲樣品用雙蒸水清洗1-3次，然后置于濾紙上自然干燥。
[0059]②取上述干燥后的單頭扁谷盜于1.5ml體積離心管中，加入液氮，迅速用燒溶封口后的槍頭將樣品徹底研磨碎。
[0060]③加入200 μ L緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮。
[0061]④加入10 μ L蛋白酶K混勻，在56°C水浴條件下放置至少3小時，直至組織溶解，每小時顛倒混勻樣品2-3次。離心30秒以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進行下一步驟。
[0062]⑤加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，離心30秒以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0063]⑥加入200 μ L無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0064]⑦將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將CB3吸附柱放回收集管中。
[0065]⑧向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液⑶，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0066]⑨向吸附柱CB3中加入700 μ L緩沖液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0067]⑩向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液。
[0068](11)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置15分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0069](12)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加20ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0070](13)扁谷盜的基因組DNA被洗脫到離心管中，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0071 ] (2) mtDNA COI 序列 PCR 擴增
[0072]以步驟(1)提取得到的扁谷盜基因組DNA為模板，利用通用引物對:LC01490和HC02198擴增扁谷盜的mtDNA COI序列，不同種擴增產(chǎn)物長度約為700bp。反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)總體積為50yL，其中2XTaq PCR MasterMix25 μ L (上海生工生物工程有限公司)，ddH2021 μ L,模板2μ L,上游引物IyL,下游引物IyL,引物濃度均為10 μ Μ。熱循環(huán)程序為:94°C預(yù)變性 3min，接著進行 35 個循環(huán)(94°C lmin,50°C lmin，72°C lmin)，最后在 72°C反應(yīng)10min后結(jié)束。
[0073]LC01490:5， -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，；
[0074]HC02198: 5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。
[0075](3) mtDNA COI 序列的獲得
[0076]采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，將擴增條帶明亮且背景干凈的樣品委托北京奧科生物技術(shù)公司進行純化并雙向測序，測序采用以上通用引物對(LC01490/HC02198)。測序反應(yīng)均在AB1-3730測序儀上進行。將測得序列用DNAMAN6.0軟件進行比對拼接，切除引物段后獲得最終長為658bp的序列片段。[0077]二、針對5種儲糧扁谷盜特異引物的設(shè)計
[0078](I)引物設(shè)計
[0079]將步驟一獲得的5種扁谷盜(每種包含I至多個地理種群)的mtDNA COI序列進行DNAMAN比對分析后，采用Primer Premier5.0軟件分別設(shè)計針對5種扁谷盜的特異引物。
[0080](2)引物評估
[0081]采用01igo7軟件對引物對各項指標(biāo)進行評估，評估內(nèi)容及評估標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0082]上下游引物的Delta G值絕對值不超過9 ;可形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的結(jié)合堿基對不要超過3個；GC%含量控制在30%-60%之間，且上下游之間不要相差太大；錯誤引發(fā)效率不超過100 ;最后，結(jié)合01 igo7軟件給出不同引物對最適退火溫度，將退火溫度統(tǒng)一設(shè)定為50°C。
[0083]根據(jù)以上所述，設(shè)計并合成得到針對5種儲糧扁谷盜的特異引物如下(表1):
[0084]表1世界常見5種儲糧扁谷盜的特異引物一覽表
[0085]
【權(quán)利要求】
1.一種用于鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的試劑盒，包括如下5個引物對中的至少一對: (O由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I ; (2)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2； (3)由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3； (4)由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4； (5)由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中組成每個引物對的兩條單鏈DNA的摩爾數(shù)相等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述儲糧扁谷盜為如下中的至少一種:銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟:將組成所述試劑盒中各引物對的各單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi):PCR反應(yīng)緩沖液、DNA 聚合酶和4種dNTP。
5.鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的方法，為如下(a)- (e)中的任一種: (a)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為銹赤扁谷盜的方法，包括如下(al)和(a2)的步驟: (al)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I進行PCR擴增； (a2)檢測步驟(al)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為銹赤扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有158bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為銹赤扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為銹赤扁谷盜； (b)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為長角扁谷盜的方法，包括如下(bl)和(b2)的步驟: (bl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2進行PCR擴增； (b2)檢測步驟(bl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為長角扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有371bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為長角扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為長角扁谷盜； (c)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為微扁谷盜的方法，包括如下(Cl)和(c2)的步驟: (Cl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3進行PCR擴增； (c2)檢測步驟(Cl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為微扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有585bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為微扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為微扁谷盜； (d)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為土耳其扁谷盜的方法，包括如下(dl)和(d2)的步驟: (dl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4進行PCR擴增； (d2)檢測步驟(dl)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為土耳其扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有355bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為土耳其扁谷盜；反 之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為土耳其扁谷盜； (e)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為開普扁谷盜的方法，包括如下(el)和(e2)的步驟: (el)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5進行PCR擴增； (e2)檢測步驟(el)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為開普扁谷盜:若所述PCR產(chǎn)物中含有289bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為開普扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為開普扁谷盜。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:步驟(a)_步驟(e)中，所有的所述進行PCR擴增的退火溫度均為50°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述引物對1、所述引物對2、所述引物對3、所述引物對4和所述引物對5，組成每個引物對的兩條單鏈DNA在各自的PCR反應(yīng)體系中的摩爾比均為1:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于:步驟(a)中，所述158bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列11 ;步驟(b)中，所述371bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列12 ;步驟(c)中，所述585bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列13 ;步驟(d)中，所述355bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列14 ;步驟(e)中，所述289bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列15。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952463SQ201310298148
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】李志紅, 王一椒 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)