B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2作為低劑量電離輻射生物劑量計的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于電離輻射生物劑量計，具體涉及B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2(B?cell?translocation?gene2，BTG2)作為電離輻射生物劑量計的應(yīng)用。人淋巴母細(xì)胞受到低劑量電離輻射后，以及哺乳動物輻射后外周血淋巴細(xì)胞的BTG2基因mRNA水平表達(dá)的增加與受到的電離輻射劑量成正比，存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，于照射后24h、48h和72h采用實時熒光定量PCR法即可快速簡便地定量檢測，因此，BTG2可作為低劑量電離輻射范圍的生物劑量計，可以采用BTG2基因表達(dá)定量分析法對人體和哺乳動物受到低劑量電離輻射的劑量大小進(jìn)行評估。
【專利說明】B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2作為低劑量電離福射生物劑量計的應(yīng)用
1【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于低劑量電離輻射生物劑量計，具體涉及B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2(B celltranslocation gene2, BTG2)作為低劑量范圍電離福射生物劑量計的應(yīng)用。
2【背景技術(shù)】
[0002]低劑量電離輻射暴露的人群和幾率遠(yuǎn)比大劑量照射事件或事故大，如天然本底輻射、頻繁的飛行活動、醫(yī)學(xué)檢查、不適當(dāng)?shù)木幼…h(huán)境、職業(yè)照射和空間活動等。低劑量電離輻射雖不足以引起臨床可見的損傷，但對低劑量暴露人群若不及時采取監(jiān)測、危害評價和防護(hù)措施，會對暴露人員帶來遠(yuǎn)后效應(yīng)的健康危害，還可能造成人員嚴(yán)重的心理損害等。作為輻射損傷救治和危害評價的重要依據(jù)，輻射劑量的準(zhǔn)確估算對診斷和治療有重要的指導(dǎo)作用。目前，輻射生物劑量計的研究已有了長足的發(fā)展，但在臨床應(yīng)用中仍存在耗時長、費(fèi)用高、專業(yè)技術(shù)要求高等問題，且主要應(yīng)用范圍為較高劑量的輻射損傷。近年來，國內(nèi)外相關(guān)實驗室開展了一些新型生物劑量計的研究，也報道了適用于低劑量輻射的生物標(biāo)志物，如CCNGl (cyclin Gl)、FDXR(ferredoxin reductase)基因表達(dá)測定等。迄今為止，這些研究尚處于探索階段，因此，有必要尋找新型、快速、可靠的低劑量電離輻射生物劑量指標(biāo)。
[0003]B 細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因 2 (B cell translocation gene2, BTG2)又名PC3(pheocromocytoma cell-3)、TIS21(TPA-1nduced sequence21)，是1991年 Bradbury等從PC12細(xì)胞CDNA文庫中篩選出可被神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種分泌型蛋白，具有抗增殖特性，由此得名PC3基因。隨后,Herschman等用腫瘤促進(jìn)劑TPA (12-0-tetradecanoylphorbol-13)作用鼠的NIH3T3細(xì)胞株誘導(dǎo)產(chǎn)生了相同的基因序列，并命名為TIS21。1998年，Zhu等用p53和p73誘導(dǎo)表達(dá)了與PC3/TIS21同源的人類基因BTG2。BTG2是具有抗增殖作用特性的瞬時早期反應(yīng)基因，參與了細(xì)胞分化、發(fā)育、凋亡、腫瘤細(xì)胞抑制等各種生理及病理過程并發(fā)揮著重要作用。電離輻射導(dǎo)致DNA損傷`，誘導(dǎo)BTG2活化，繼而抑制周期素Dl使細(xì)胞周期停滯在Gl期，DNA復(fù)制被抑制，使受損細(xì)胞得到充分修復(fù)，同時，抑制周期素Dl可活化增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)共同參與對損傷的DNA的修復(fù)。因此，BTG2被認(rèn)為是聯(lián)系細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)的橋梁。最近有研究報道BTG2可以調(diào)節(jié)DNA雙鏈斷裂(DNA doublestrand breaks, DSBs)的修復(fù)和凋亡，BTG2表達(dá)可促進(jìn)DSBs修復(fù)，并通過激活Mrell和PRMTl (protein arginine methyltransferasel),阻礙憐酸化的 ATM(S198)將損傷信號傳導(dǎo)至Chk2 (T68)和p53 (S20)，從而減少細(xì)胞凋亡。
3
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2 (B cell translocation gene2, BTG2)作為低劑量電離輻射生物劑量計的應(yīng)用。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2(B celltranslocation gene2, BTG2)作為低劑量電離福射生物劑量計的應(yīng)用。
[0006]一種檢測人或動物所受低劑量范圍輻射劑量的方法，包括如下步驟:[0007](I)按照常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞置于已知輻射強(qiáng)度的環(huán)境中接受輻射，照后在三個以上時間點收集輻射后細(xì)胞，定量檢測其B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2的mRNA表達(dá)水平，獲得該細(xì)胞受到的電離輻射劑量和B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2表達(dá)水平關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0008](2)分離并收集接受了待測劑量輻射的動物外周血淋巴細(xì)胞，測定其中的B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2的mRNA表達(dá)水平，根據(jù)步驟-(I)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到該動物所受到的電尚福射劑量。
[0009]上述技術(shù)方案中，待測細(xì)胞可來自細(xì)胞株，如人淋巴母細(xì)胞，也可來自人或動物的組織細(xì)胞，如外周血淋巴細(xì)胞。
[0010]上述技術(shù)方案中，測定細(xì)胞中B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2的表達(dá)水平的方法是:采用實時熒光定量PCR法測定細(xì)胞中B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2的mRNA表達(dá)水平。
[0011]由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用；本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
[0012]由于細(xì)胞株或動物受到低劑量電離輻射后，其中BTG2含量的增加與受到的電離輻射劑量正相關(guān)，存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且于照射后24h即可采用簡便易行、定量準(zhǔn)確、敏感度高的方法進(jìn)行快速檢測，因此，BTG2可作為低劑量電離輻射生物劑量計，定量檢測人或動物受到低劑量電離輻射。
4【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為實施例一中指數(shù)生長期的AHH-1細(xì)胞經(jīng)不同劑量137Cs Y射線照射后BTG2基因表達(dá)量隨時間變化圖；
[0014]圖2為實施例一中指數(shù)生長期的AHH-1細(xì)胞經(jīng)不同劑量137Cs Y射線照射后24小時BTG2基因表達(dá)量的劑量-效應(yīng)曲線；
[0015]圖3為實施例一中指數(shù)生長期的AHH-1細(xì)胞經(jīng)不同劑量137Cs Y射線照射后48小時BTG2基因表達(dá)量的劑量-效應(yīng)曲線；
[0016]圖4為實施例一中指數(shù)生長期的AHH-1細(xì)胞經(jīng)不同劑量137Cs Y射線照射后72小時BTG2基因表達(dá)量的劑量-效應(yīng)曲線。
5【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
[0018]實施例一:不同低劑量電離輻射人淋巴母細(xì)胞中BTG2基因表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系
[0019]1.材料:人淋巴母細(xì)胞(AHH-1)由第二軍醫(yī)大學(xué)防原醫(yī)學(xué)教研室惠贈；TRlzolreagent 和 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶為 Invitrogen 公司產(chǎn)品；SYBR Premix Ex Taq 為 Takara 公司
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[0020]2.細(xì)胞培養(yǎng):AHH-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %小牛血清，谷氨酰胺及100萬U/L青霉素和鏈霉素的RPM11640培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37°C、5% C02孵箱中培養(yǎng)，2~3天傳代I次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于輻照。
[0021]3.福照:復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所，Gamma cell40,137Cs (N0RD10NInternational Inc.CANADA)，劑量率為 0.162Gy/min，劑量為 0,0.1,0.2,0.5,0.8，1.0Gy。
[0022]4.Real-time PCR法測定人淋巴母細(xì)胞中BTG2基因表達(dá)的量:
[0023]4.1總RNA抽提及cDNA合成:實驗組經(jīng)照射后和未照射對照組細(xì)胞置于37°C、5% C02孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)他，411，2411，4811，7211，16811，隨后每組樣品取I X IO6細(xì)胞，加ImlTRIzol，裂解后提取總RNA，Nanodrop ND-1000檢測樣品RNA濃度和純度，進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。用Invitrogen公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對抽提的人淋巴母細(xì)胞總RNA進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成，逆轉(zhuǎn)錄總體積為20ul，總RNA為lug，引物為OIigo (dT) 18,具體操作依據(jù)產(chǎn)品說明書。
[0024]4.2引物設(shè)計:依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的β -actin和BTG2基因序列，用Primerpremier5軟件設(shè)計實時熒光定量PCR的相應(yīng)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。
[0025]4.3實時熒光定量PCR:采用SYBR實時熒光定量PCR方法，用Chromo4(BIO-RAD公司)實時熒光PCR檢測儀，按照用戶手冊操作。PCR反應(yīng)程序為:95°C 3min ；95°C IOs ；60°C 30s ;共40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)做3個平行樣，每次反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，排除非特異性PCR產(chǎn)物的影響。以β-actin為內(nèi)參，同時設(shè)置空白對照組。
[0026]4.4定量方法和統(tǒng)計分析:采用相對定量法，以看家基因β -actin為內(nèi)參，采用MJOptionMonitor Analysis Software V3.1 和 Excel 軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。
[0027]如圖1所示，照射后24h，與未照射組比較，0.1Gy照射組BTG2基因上調(diào)2.61倍，0.2Gy照射組BTG2基因上調(diào)3.06倍，0.5Gy照射組BTG2基因上調(diào)4.41倍，0.8Gy照射組BTG2基因上調(diào)5.10倍，1.0Gy照射組BTG2基因上調(diào)6.36倍；照射后48h，與未照射組比較，
0.1Gy照射組BTG2基因上調(diào)2.09倍，0.2Gy照射組BTG2基因上調(diào)2.37倍，0.5Gy照射組BTG2基因上調(diào)2.92倍，0.8Gy照射組BTG2基因上調(diào)3.51倍，1.0Gy照射組BTG2基因上調(diào)
4.44倍；照射后72h，與未照射組比較，0.1Gy照射組BTG2基因上調(diào)2.07倍，0.2Gy照射組BTG2基因上調(diào)2.44倍，0.5Gy照射組BTG2基因上調(diào)2.83倍，0.8Gy照射組BTG2基因上調(diào)
3.58倍，1.0Gy照射組BTG2基因上調(diào)4.01倍。
[0028]結(jié)果表明，低劑量電離輻射后24h，受照細(xì)胞BTG2基因表達(dá)上調(diào)，并隨照射劑量增加而增加，與照射劑量正相關(guān)，呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖2)，擬合劑量-效應(yīng)曲線方程為:y = 4.612X+1.757，R2 = 0.939。隨著時間的延長，受照細(xì)胞BTG2基因表達(dá)開始下調(diào)，在48h和72h時處于平臺期，但仍顯著高于未照射組，并與照射劑量正相關(guān)，呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖3和圖4)，擬合劑量-效應(yīng)曲線方程分別為:y = 2.847X+1.487，R2=0.928 ；y = 2.559x+l.545，R2 = 0.910。其中Y為BTG2基因在mRNA水平的相對表達(dá)量，X為照射劑量(Gy)。
[0029]實施例二:不同低劑量電離輻射Balb/c小鼠外周血淋巴細(xì)胞中BTG2基因表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系
[0030]1.材料:肝素鈉；小鼠淋巴細(xì)胞分離液為達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TRlzolreagent 和 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶為 Invitrogen 公司產(chǎn)品；SYBR Premix ExTaq 為 Takara 公司產(chǎn)品O
[0031]2.動物分組及處理:20只雄性Balb/c小鼠，體重20 ±2g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。動物隨機(jī)分為4組，分別為未照射組、0.1Gy照射組、0.5Gy照射組和
1.0Gy照射組，每組5只。各照射組在海軍醫(yī)學(xué)研究所輻照室進(jìn)行照射，放射源為6°Co，單次照射，劑量率為0.5Gy/h。
[0032]3.分離淋巴細(xì)胞: 于照射結(jié)束后24h，收集照射組和未照射組小鼠的抗凝血，分離淋巴細(xì)胞，具體操作依據(jù)說明書的操作步驟。
[0033]4.Real-time PCR法測定小鼠外周血淋巴細(xì)胞中BTG2基因表達(dá)的量:
[0034]4.1總RNA抽提及cDNA合成:取I X IO6細(xì)胞，加Iml TRIzol，裂解后提取總RNA，Nanodrop ND-1000檢測樣品RNA濃度和純度，進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。用Invitrogen公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對抽提的外周血淋巴細(xì)胞總RNA進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成，逆轉(zhuǎn)錄總體積為20ul，總RNA為lug，引物為OIigo (dT) 18，具體操作依據(jù)產(chǎn)品說明書。
[0035]4.2引物設(shè)計:依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的β -actin和BTG2基因序列，用Primerpremier5軟件設(shè)計實時熒光定量PCR的相應(yīng)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。
[0036]4.3實時熒光定量PCR:采用SYBR實時熒光定量PCR方法，用Chromo4(BIO-RAD公司)實時熒光PCR檢測儀，按照用戶手冊操作。PCR反應(yīng)程序為:95°C 3min ；95°C IOs ；60°C 30s ;共40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)做3個平行樣，每次反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，排除非特異性PCR產(chǎn)物的影響。以β-actin為內(nèi)參，同時設(shè)置空白對照組。
[0037]4.4定量方法和統(tǒng)計分析:采用相對定量法，以看家基因β -actin為內(nèi)參，采用MJOptionMonitor Analysis Software V3.1 和 Excel 軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。
[0038]如表1所示，照射后24h，與未照射組比較，0.1Gy照射組BTG2基因平均上調(diào)倍數(shù)為2.35，0.5Gy照射組BTG2基因平均上調(diào)倍數(shù)為3.97，1.0Gy照射組BTG2基因平均上調(diào)倍數(shù)為6.82 ;根據(jù)上調(diào)倍數(shù)和實施例一中照射后24h的擬合劑量-效應(yīng)曲線方程:y =4.612X+1.757，計算得到各組動物受照射劑量分別為0.129Gy，0.480Gy和1.098Gy。
[0039]結(jié)果表明，小鼠在低劑量電離輻射后24h，外周血淋巴細(xì)胞中BTG2基因表達(dá)上調(diào)，與照射劑量正相關(guān)，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，根據(jù)劑量-效應(yīng)曲線計算得到的理論受照劑量接近實際受照劑量
[0040]表1不同劑量6tlCo Y射線照射后動物外周血淋巴細(xì)胞中BTG2基因表達(dá)變化
【權(quán)利要求】
1.B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2作為低劑量電離輻射生物劑量計的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1中B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2作為一種快速檢測輻射劑量的生物指標(biāo)，其特征在于，一定時間范圍內(nèi)B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2mRNA表達(dá)量與輻射劑量相關(guān)。
3.權(quán)利要求2中所述輻照劑量特征為低劑量電離輻射。
4.B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2作為低劑量電離輻射生物劑量計的應(yīng)用，包括如下步驟: (1)按照常規(guī)方法培養(yǎng)離體細(xì)胞或飼養(yǎng)哺乳動物，將細(xì)胞或動物置于已知輻射強(qiáng)度的環(huán)境中接受輻射，照后在三個以上時間點收集輻射后細(xì)胞或采集哺乳動物外周血淋巴細(xì)胞，定量檢測其B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2的mRNA表達(dá)水平，獲得該細(xì)胞或哺乳動物受到的電離輻射劑量和B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2表達(dá)水平關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)收集接受了待測劑量的輻射照射的離體細(xì)胞，或?qū)⒉溉閯游镏糜诖郎y劑量的環(huán)境中接受輻射，照后分離外周血淋巴細(xì)胞，測定其B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2的mRNA表達(dá)水平，根據(jù)步驟(I)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到該細(xì)胞或動物所受的輻射劑量。
5.權(quán)利要求4中所述B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因2含量也可以聯(lián)合其他指標(biāo)，共同估算輻射劑量。
6.權(quán)利要求4中所述離體細(xì)胞可以來源于細(xì)胞株，如人淋巴母細(xì)胞，也可來自離體細(xì)胞，如人或哺乳動物的外周血`淋巴細(xì)胞。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555818SQ201310298218
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】何穎, 沈先榮, 錢甜甜, 陳偉, 王慶蓉, 蔣定文, 劉玉明, 李珂嫻, 侯登勇, 劉瓊 申請人:中國人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所