一種檢測布魯氏菌的lamp引物及包含該引物的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測布魯氏菌的LAMP引物及包含該引物的試劑盒。本發(fā)明所述的LAMP引物包括內(nèi)引物FIP和BIP，外引物F3和B3，以及2對環(huán)引物（LF1和LB1，或者LF2和LB2）；所述試劑盒包括所述LAMP引物、Bst?DNA聚合酶、含dNTPs的反應(yīng)緩沖液等。本發(fā)明利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（LAMP），由Bst?ploymerase和所述LAMP引物對靶基因BCSP31進行特異性擴增，可以快速、準確、方便地檢測出人血樣或者牛奶中的布魯氏菌。本發(fā)明所述的檢測方法靈敏度較高，檢測下限可達到35fg，反應(yīng)時間短，不需要昂貴的儀器來實現(xiàn)，可操作性強；并且產(chǎn)物檢測方便，通過肉眼觀察或染色法就能實現(xiàn)，具有很高的實用價值。
【專利說明】—種檢測布魯氏菌的LAMP引物及包含該引物的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速檢測布魯氏菌的方法以及LAMP引物及包含該引物的試劑盒，屬于微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]布魯氏菌(Brucella spp.)是一種革蘭氏陰性菌，無鞭毛，無芽孢，光滑有莢膜。常在細胞內(nèi)寄生。內(nèi)毒素是其重要的致病物質(zhì)。布魯氏菌可通過完整皮膚和粘膜進入宿主，具有較強的侵襲力。根據(jù)表型，抗原性及宿主的不同，布魯氏菌被分為6各種，分別是Brucella abortus (牛種布魯氏菌)，Brucella melitensis (羊種布魯氏菌)，Brucellaovis (綿羊附睪種布魯氏菌)，Brucella canis (犬種布魯氏菌)，Brucella suis (豬種布魯氏菌)and Brucella neotomae (沙林鼠種布魯氏菌)；感染人類的主要是牛種布魯氏菌,羊種布魯氏菌和豬種布魯氏菌。長久以來，布魯氏菌一直被列為潛在的生物武器。
[0003]布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的一種重要的人獸共患傳染病，在許多國家引起了嚴重的公共健康問題和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟問題。該病可以導(dǎo)致許多家畜和野生動物流產(chǎn)和不育；人類感染布魯氏菌的臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱(波浪熱)、寒戰(zhàn)、頭痛、全身疼痛、疲勞、腦神經(jīng)功能障礙癥狀、關(guān)節(jié)炎等非特異性癥狀。
[0004]由于布魯氏菌病的臨床癥狀是非特異性的，并且變化無常，因此必須借助實驗室診斷技術(shù)對布魯氏菌病進行最后的確診。細菌學檢測是必要的，但是細菌在培養(yǎng)基中生長較慢，并對實驗室工作人員有危險；血清學診斷雖然比較簡單，但是特異性比較低，因為布魯氏菌的脂多糖與其他病原菌的脂多糖(如小腸結(jié)腸炎耶氏菌)存在結(jié)構(gòu)相似性，因此容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)；基于DNA的PCR檢測方法敏感，準確，快速，可以替代病原學檢測，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測`費用及對檢測人員較高的技術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及基層普及應(yīng)用。因此，迫切需要開發(fā)出一種可以快速、特異、簡單、安全地檢測布魯氏菌病的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中無法快速、準確的檢測布魯氏菌的不足，提供一種可以快速、特異、簡單、安全地檢測布魯氏菌的方法；
[0006]進一步的，本發(fā)明提供了一種能夠快速檢測布魯氏菌的LAMP引物以及包含該引物的試劑盒。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0008]一種用于檢測布魯氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向內(nèi)引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向內(nèi)引物BIP、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向外引物B3。
[0009]所述LAMP引物還包括核苷酸序列分別如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示的環(huán)引物LFl和LB1，或者核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的環(huán)引物LF2和LB2。
[0010]一種用于檢測布魯氏菌的試劑盒，包括:權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物、BstDNA聚合酶、含dNTPs的反應(yīng)緩沖液和去離子水；
[0011]其中，所述含dNTPs的反應(yīng)緩沖液包含40mM pH8.8的Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH4)2S04U6mM MgS04、0.2% 吐溫 20,1.6M 甜菜堿以及 2.8mM dNTPs
[0012]所述試劑盒包括40?]\1/^1^引物卩1?10(^1^，40?]\1/^1^引物81?10(^1^，5?]\1/^1^弓丨物 F3100y L，5pM/y L 引物 B3100 μ L，20ρΜ/μ L 引物 LFl 或 LF2100 μ L，20pM/μ L 引物 LBl或LB2100 μ L，8U/ μ L的Bst DNA聚合酶100 μ L，含dNTPs的反應(yīng)緩沖液1.5mL,去離子水ImL0
[0013]一種利用權(quán)利要求3所述的試劑盒檢測布魯氏菌的方法，包括如下步驟:
[0014]S01:制備模板 DNA;
[0015]S02:以SOl中所得的DNA作為模板，采用權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物，于60°C~65°C進行LAMP擴增反應(yīng)，反應(yīng)時間為55min~90min ;所述LAMP擴增反應(yīng)的體系為25 μ L，各組分的含量如下:
[0016]
模板 DNA2μΙ_
40ρΜ/μΙ_ 引物 FIPΙμΙ
40ρΜ/μ!_ 引物 BIP1μ!_
5ρΜ/μ1_#_Ρ31μ!_
5ρΜ/μΙ_ 引物 Β3ΙμΙ
含dNTPs的反應(yīng)緩沖液12 5μ?
Bst DNA 聚合酶1μ!_
去離子水5.5μΙ_ [0017]或者
[0018]模板DNA2μΙ
40ρΜ/μ!_ 引物 FIP1μ1_
40ρΜ/μ? 引物 BIP1μ1_
5ρΜ/μΙ_ 引物I F31μ1_
5ρΜ/μ1_ 引物 Β31μ!_
5ρΜ/μΙ_ 引物 LFl 或 LF2Ιμ?
5ρΜ/μΙ_ 引物 LBl 成 LB21μ1_
含dNTPs的反應(yīng)緩沖液12.5μ!_
Bst DNA 聚合酶1μΙ_
去離子水3.5μ?
[0019]S03:擴增結(jié)果判定。
[0020]所述步驟S02中，利用Real-time turbidimeter池度儀進行LAMP擴增反應(yīng)；通過濁度儀連接的LA-320程序顯示的濁度上升時間鑒定所述步驟S02中特異性擴增產(chǎn)物的存 在。
[0021 ] 本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)實際需要按比例調(diào)節(jié)所述步驟S02中的反應(yīng)體系，亦可以實現(xiàn)本發(fā)明。
[0022]所述步驟S02中，所述LAMP擴增反應(yīng)的溫度為63°C，時間為90min。
[0023]在所述步驟S02結(jié)束后，可以將反應(yīng)產(chǎn)物于80°C恒溫滅活5min或95°C恒溫滅活5min。
[0024]所述布魯氏菌為人體血液或者牛奶中的布魯氏菌。
[0025]一種利用所述的試劑盒進行檢測布魯氏菌的應(yīng)用。
[0026]BCSP31基因在所有布魯氏菌種和生物型中是保守的，它編碼了大小為31 ku具有免疫原性的可溶性細胞表面蛋白質(zhì)。該基因于1988年被克隆測序和體外表達；1992年Baily等擴增BCSP31基因的一段大小為223bp的片段，結(jié)果表明該序列在牛種布魯氏菌和羊種布魯氏菌中是保守的；1996年Da Costa等證實BCSP31基因能鑒別所有的布魯氏菌種和生物型，他們還檢測了其他98種對照細菌，結(jié)果均為陰性；王勝昌等(2003)以BCSP31為靶基因建立套式PCR反應(yīng)，不同型的布魯氏菌都能出現(xiàn)預(yù)期的擴增帶；結(jié)果表明BCSP31序列具有高度的布魯氏菌特異性，可用于鑒別布魯氏菌。
[0027]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP,loop-mediated isotherma lamplification)是一種全新的核酸擴增方法。該法在等溫條件下(60~65°C )就能完成擴增反應(yīng)，它可以在Ih以內(nèi)在恒溫條件下特異地擴增DNA到109個拷貝，在保持PCR技術(shù)優(yōu)點的基礎(chǔ)上，進一步增強了反應(yīng)的特異性和縮短了檢測時間。LAMP技術(shù)利用Bst DNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計的兩對特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標DNA區(qū)啟動互補鏈合成，結(jié)果在同一鏈上互補序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。由于它針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特意的引物，因而對靶基因序列有高度的特異性；如果再增加一對環(huán)引物，則可以使反應(yīng)加速，提高擴增效率。LAMP擴增結(jié)果判定的方法包括:(I)熒光染色法:向LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR Green I等燃料，進行呈色反應(yīng)，通過觀察LAMP反應(yīng)體系的顏色變化來判定擴增結(jié)果。若發(fā)生了擴增反應(yīng)，SYBR Green I會摻入雙鏈DNA中，反應(yīng)體系的顏色會從橙色變?yōu)榫G色；若反應(yīng)體系的顏色保持不變，則沒有發(fā)生擴增反應(yīng)。(2)瓊脂糖凝膠電泳法:根據(jù)LAMP的擴增原理，LAMP反應(yīng)的最終產(chǎn)物含有不同長度(目的片段長度的自然數(shù)倍)的花椰菜狀的反向重復(fù)序列，所以其產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)特征性梯狀條帶，而非單一條帶。(3)焦磷酸鎂濁度檢測:DNA大量合成時，從dNTPs析出的焦磷酸根離子與溶液中的鎂離子結(jié)合產(chǎn)生焦磷酸鎂白色沉淀，出現(xiàn)肉眼可見的渾濁，濁度大小與DNA的含量成正t匕，可以通過肉眼觀察反應(yīng)前后的渾濁情況來判斷是否發(fā)生了 LAMP反應(yīng)，也可以用分光光度計檢測其在400nm處的吸光度，實現(xiàn)實時定量檢測。
[0028]如果LAMP反應(yīng)的靶序列在除引物區(qū)外帶有限制性酶切位點，則可以利用該酶切位點進行LAMP反應(yīng)特異性擴增產(chǎn)物的鑒定。本發(fā)明所述的靶序列在除引物區(qū)外帶有限制性酶切位點BstH2 I，用該酶對所述LAMP擴增產(chǎn)物進行酶切，所得到的酶切片段的大小的計算如下所示:
[0029]所述LAMP反應(yīng)的機理如附圖11所示。
[0030]LAMP擴增產(chǎn)物的線性示意圖如附圖12所示。
[0031 ] 本發(fā)明所述的LAMP反應(yīng)的目的基因如圖13所示。
[0032]
[0033]由以上各圖可推知:
[0034]B+的長度=Blc的長度+B2的長度+B2和BI之間的長度+BI的長度=22+18+35+22=97bp
[0035]B-的長度=22+l8+35+22=97bp
[0036]F+的長度=Flc的長度+Flc和F2c之間的長度+F2c的長度+Fl的長度=22+22+19+22=85bp
[0037]F-的長度=22+22+l9+22=85bp
[0038]+的長度=_的長度=Bl和Flc之間的距離=2bp
[0039]BstH2 I的酶切位點位于Flc和BI之間，酶切產(chǎn)物預(yù)期片段的大小推導(dǎo)結(jié)果如圖14所示。
[0040]
[0041]酶切后的片段大小為:
[0042]97+2+22+20+16=141bp
[0043]2+I9+22+2+97+2+22+I9+2=I87bp
[0044]20+22+2+97+2+22+20=I85bp
[0045]本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點:
[0046](1)本發(fā)明所述的一種檢測布魯氏菌的LAMP引物及包含該引物的試劑盒，所述LAMP引物以BCSP31基因為靶基因進行擴增；該基因序列具有高度的布魯氏菌特異性，因而可以實現(xiàn)布魯氏菌的特異性檢測。
[0047](2)本發(fā)明所述的一種檢測布魯氏菌的LAMP引物及包含該引物的試劑盒，在檢測布魯氏菌時更加快速和高效，因為LAMP擴增反應(yīng)不需要對模板DNA進行熱變性，避免了溫度循環(huán)造成的時間損失，核酸擴增在Ih內(nèi)即可完成；添加環(huán)引物后20-30min內(nèi)就可以檢測到擴增產(chǎn)物，Ih內(nèi)可擴增出109個靶序列拷貝，且產(chǎn)物可以達到0.5mg/mL。
[0048](3)本發(fā)明所述的LAMP法檢測布魯氏菌，針對靶序列的6個區(qū)域設(shè)計了 4種特異性引物，6個區(qū)域中任何一處與引物不匹配均不能進行核酸擴增，因而具有高特異性；同時LAMP擴增法具有高靈敏度，所需模板拷貝量少，靈敏度較較高，檢測下限約為35fg。
[0049](4)本發(fā)明所述的LAMP反應(yīng)可操作性強，只需要一個簡單的恒溫器即可完成此操作；并且產(chǎn)物檢測方便，通過肉眼觀察或染色法就能實現(xiàn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中，
[0051]圖1是本發(fā)明所述實施例4中實驗例(I)不加環(huán)引物的LAMP反應(yīng)開始時間(min)，均在45min之后開始反應(yīng)；
[0052]圖2是本發(fā)明所述實施例2中LAMP反應(yīng)特異性分析的實時濁度法反應(yīng)結(jié)果，橫坐標代表反應(yīng)時間(min)，縱坐標代表濁度；CHl-8分別對應(yīng):大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蘇云金芽孢桿菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、酵母菌、黃曲霉；
[0053]圖3是本發(fā)明所述實施例2中實時濁度法反應(yīng)結(jié)果，橫坐標代表樣品編號，縱坐標代表濁度；1_8分別對應(yīng):大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蘇云金芽孢桿菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、酵母菌、黃曲霉；
[0054]圖4是本發(fā)明所述實施例3中向LAMP擴增產(chǎn)物肉眼觀察結(jié)果，編號1_8對應(yīng)的稀釋梯度分別為 3.5ng/ μ L,350pg/ μ L,35pg/ μ L,3.5pg/μ L、350fg/μ L、35fg/μ L、3.5fg/μ L 和 350ag/ μ L ；
[0055]圖5是本發(fā)明所述實施例4中實驗例(2)、(3)和(4)加入環(huán)引物的LAMP實時濁度法反應(yīng)結(jié)果，橫坐標代表反應(yīng)時間(min)，縱坐標代表濁度；CH1為標準布魯氏菌株對照DNA、CH5為實驗例(2)的擴增結(jié)果、CH6為實驗例(3)的擴增結(jié)果、CH7為實驗例(4)的擴增結(jié)果、CH8為陰性對照(水)；所述反應(yīng)均在45min之前開始反應(yīng)；
[0056]圖6是本發(fā)明所述實施例4中實驗例(2)、(3)和(4)的實時濁度法反應(yīng)結(jié)果，橫坐標代表樣品編號，縱坐標代表池度；1為標準布魯氏菌株對照DNA、5為實驗例(2)的擴增結(jié)果、6為實驗例(3)的擴增結(jié)果、7為為實驗例(4)的擴增結(jié)果、8為陰性對照(水)；
[0057]圖7是本發(fā)明所述實施例4中實驗例(5)的LAMP實時濁度法反應(yīng)結(jié)果，橫坐標代表反應(yīng)時間(min)，縱坐標代表濁度；CH1和CH2為陰性對照，CH3為標準布魯氏菌株對照DNA, CH7為本實驗例的擴增結(jié)果；
[0058]圖8是本發(fā)明所述實施例4中實驗例(5)的實時濁度法反應(yīng)結(jié)果，橫坐標代表樣品編號，縱坐標代表濁度；1和2為陰性對照(水和大腸桿菌)、3為標準布魯氏菌株對照DNA、7為實驗例(5)的擴增結(jié)果；[0059]圖9本發(fā)明所述實施例4實驗例(I)擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖，所用Marker為lOO-llOObp，泳道I為實驗例(I)的擴增產(chǎn)物；
[0060]圖10本發(fā)明所述實施例4實驗例(I)擴增產(chǎn)物酶切后所得酶切產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖，所用Marker為100_600bp，泳道I為實驗例(I)擴增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物；
[0061 ] 圖11所述LAMP反應(yīng)的機理圖；
[0062]附圖12所述LAMP擴增產(chǎn)物的線性示意圖；
圖13為所述的LAMP反應(yīng)的目的基因；
圖14為所述的LAMP反應(yīng)酶切產(chǎn)物預(yù)期片段的大小推導(dǎo)結(jié)果。
【具體實施方式】
[0063]實施例1用于檢測布魯氏菌的LAMP引物的設(shè)計與合成
[0064]選擇羊種布魯氏菌BCSP31基因作為目的基因，通過在線工具http://primerexplorer.jp/e/,使用Primer Explorer V4設(shè)計、篩選并合成一套參數(shù)符合LAMP引物設(shè)計要求的引物。所述引物包括2條外引物(F3、B3)，2條內(nèi)引物(FIP、BIP)和2對環(huán)引物(LF1、LBl和LF2、LB2),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。各引物的序列見表I:
[0065]表1:檢測布魯氏菌的LAMP弓丨物
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測布魯氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向內(nèi)引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向內(nèi)引物BIP、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向外引物B3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測布魯氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物還包括核苷酸序列分別如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的環(huán)引物LFl和LB1，或者核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的環(huán)引物LF2和LB2。
3.一種用于檢測布魯氏菌的試劑盒，其特征在于，包括:權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反應(yīng)緩沖液和去離子水； 其中，所述含dNTPs的反應(yīng)緩沖液包含40mM pH8.8的Tris_HCl、20mM KCl、20mM(NH4)2S04U6mM MgS04、0.2% 吐溫 20,1.6M 甜菜堿以及 2.8mM dNTPs。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測布魯氏菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括40ρΜ/μ L 弓丨物 FIPlOOy L,40pM/y L 弓丨物 BIP100 μ L, 5ρΜ/μ L 弓丨物 F3100 μ L, 5ρΜ/μ L 引物 Β3100 μ L, 20ρΜ/ μ L 引物 LFl 或 LF2100 μ L, 20ρΜ/ μ L 引物 LBl 或 LB2100 μ L, 8U/ μ L 的Bst DNA聚合酶100 μ L，含dNTPs的反應(yīng)緩沖液1.5mL，去離子水lmL。
5.一種檢測布魯氏菌的方法，其特征在于，包括如下步驟: 501:制備模板DNA ； 502:以SOl中所得的D NA作為模板，采用權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物，于60V~65°C進行LAMP擴增反應(yīng)，反應(yīng)時間為55min~90min ;所述LAMP擴增反應(yīng)的體系為25 μ L，各組分的含量如下:模板DNA2μ?40ρΜ/μ1_ 引物 F!PΙμΙ40ρΜ/μΙ_ 引物 BIP1μ!_5pMyVL'ji*F31μ!_5ρΜ/μ1_ 引物 Β31μ1_含dNTPs的反應(yīng)緩沖液12.5μ!_Bst DNA 聚合酶1μΙ_去離子水5.5μ? 或者模板DNA2μ?40ρΜ/μ?:’j丨構(gòu) FIPΙμ?40ρΜ/μ?_ 1J丨物 BIPΙμ?5ρ!/1/μ!_ 引物 F31μ!_5ρΜ/μ?_ 引物 Β31μ1_5ρΜ/μ?丨物 LFl 或 LF2ΙμΙSpM/μΙ 引物 LBl 或 LB21μ!_含dNTPs的反應(yīng)緩沖液12.5μ?Bst DNA聚合酶Ιμ?去離子水3.5μΙ_ S03:擴增結(jié)果判定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測布魯氏菌的方法，其特征在于，所述步驟S02中，利用Real-time turbidimeter池度儀進行LAMP擴增反應(yīng)；通過池度儀連接的LA-320程序顯示的濁度上升時間鑒定所述步驟S02中特異性擴增產(chǎn)物的存在。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6 所述的檢測布魯氏菌的方法，其特征在于，所述步驟S02中，所述LAMP擴增反應(yīng)的溫度為63°C，時間為90min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的檢測布魯氏菌的方法，其特征在于，所述布魯氏菌為人體血液或者牛奶中的布魯氏菌。
9.一種利用權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在檢測布魯氏菌中的應(yīng)用。
10.一種利用權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物在檢測布魯氏菌中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/04GK103602721SQ201310298369
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】黃耀江, 蔣丹, 楊志達, 靳衛(wèi)林, 閆強 申請人:黃耀江