雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA的篩選方法，該方法包括：S101，選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官；S102，分別從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA，得到雌花總RNA和雄花總RNA；S103，根據(jù)提取出總RNA建立cDNA；S104，對(duì)建立的cDNA文庫進(jìn)行測序；S105，根據(jù)測序結(jié)果及microRNA評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，判斷雌花和雌花cDNA文庫所對(duì)應(yīng)的microRNA種類及數(shù)量;以及S106，根據(jù)microRNA種類及數(shù)量，篩選出雌性花器官與雄性花器官差異表達(dá)的microRNA。本發(fā)明的方法快速高效，易于自動(dòng)化，具有實(shí)用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA的篩選 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，該發(fā)明公開了一種篩選雌雄異株植物中雌雄花器官 差異表達(dá)的microRNA的篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] DNA測序技術(shù)是現(xiàn)在基因組學(xué)最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的 應(yīng)用。1977年Sanger發(fā)明的末端終止測序法對(duì)于基因組測序研究具有里程碑意義。Sanger 法簡便快速，經(jīng)過改良后成為DNA測序研究的主要方法。隨著基因組科學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的 Sanger測序方法已經(jīng)不能滿足科學(xué)研究的需要。為滿足這些研究需求，第二代高通量測序 技術(shù)迅速發(fā)展。第二代高通量測序技術(shù)的基因原理是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的 末端標(biāo)記來確定DNA序列。在Sanger測序方法的基礎(chǔ)上，利用不同顏色的突光標(biāo)記四種 dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒 光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。
[0003] 由于第二代測序技術(shù)是對(duì)序列邊合成邊測序，利用該技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)要求 樣品要具有相同的基因型，否則將會(huì)產(chǎn)生誤差。所以對(duì)于雌雄異株植物(楊樹、柳樹、菠菜、 大麻、銀杏、鐵樹、櫻桃等)，由于其在生長發(fā)育、生理應(yīng)答以及基因表達(dá)等多方面具有顯著 差異，因此很難將第二代測序技術(shù)應(yīng)用到雌雄異株植物的篩選工作中。
[0004] 另外，人們還發(fā)現(xiàn)在雌雄異株植物中最為顯著的差異是具有生長發(fā)育迥異的雌雄 花器官，而microRNA (簡寫為miRNA)對(duì)于植物生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，因此如果能 夠通過篩選雌雄花器官差異或特異表達(dá)的microRNA,就可以對(duì)楊樹性別決定機(jī)制進(jìn)行深入 的研究。但是由于雌雄異株植物的基因型效應(yīng)的影響，雌雄花器官差異表達(dá)microRNA的工 作迄今為止還未找到合適的開展方式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)無法篩選出雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA 的問題，本發(fā)明提供了一種雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA的篩選方法， 該方法包括：
[0006] S101，選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官；
[0007] S102,分別從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA，得到雌花總RNA和雄花總 RNA ；
[0008] S103,根據(jù)提取出的雌花總RNA建立雌花cDNA文庫，根據(jù)提取出的雄花總RNA建 立雄花cDNA文庫；
[0009] S104,分別對(duì)雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫進(jìn)行測序；
[0010] S105,根據(jù)測序結(jié)果及microRNA評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，判斷雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫 所對(duì)應(yīng)的microRNA種類及數(shù)量；以及
[0011] S106,根據(jù)microRNA種類及數(shù)量，篩選出雌性花器官與雄性花器官差異表達(dá)的 microRNAo
[0012] 優(yōu)選地，在步驟SlOl中，相同基因型的雌性花器官和雄性花器官是通過從雌雄異 株植物的雄全同株個(gè)體或者雌全同株個(gè)體產(chǎn)生的兩性花器官中分離得到的。并且，更優(yōu)選 地，兩性花器官的分離是在超低溫條件下實(shí)施的。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明是通過CTAB法從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA的。更 優(yōu)選地，采用的CTAB法包括：S1021，取雌性花器官或雄性花器官加上等量的聚丙烯吡咯烷 酮，液氮研磨，收集到離心管中；S1022,將預(yù)熱的CTAB提取液以及β -巰基乙醇加入所述 離心管中，混勻，65°C水?。籗1023,加入氯仿和異戊醇，混勻抽提，在4°C下離心分離，取上 清液，加入1/3至1/5體積的12M Licl，在4°C下沉淀；S1024,在4°C下繼續(xù)離心分離，棄上 清液，加入緩沖液溶解沉淀，將溶解RNA后的緩沖液轉(zhuǎn)移到另一離心管中；S1025,加入氯仿 和異戊醇，混勻抽提，在4°C下離心，取上清液，重復(fù)抽提多次；S1026,取所述S1025得到的 上清液，加入1/10體積的3M NaAC與2. 5倍體積的無水乙醇，混勻后，-20°C靜置沉淀RNA， 在4°C下離心，棄上清液，收集沉淀物；S1027,將步驟S1026得到的沉淀物溶于RNase-free 水中，并利用DNA消化酶去除DNA，在37°C溫度下水浴，加入等體積的氯仿和異戊醇，混勻后 離心分離；S1028,將步驟S1027得到的上清液分裝到I. 5ml的離心管中，然后加入無水乙醇 和NaAC，混勻后，-20°C靜置并沉淀，在4°C下離心分離，棄上清液，收集沉淀物，分離得到總 RNA。
[0014] 優(yōu)選地，在步驟S1021中，雌性花器官或雄性花器官的用量為0. lg，在步驟S1023 中，12M Licl的加入量為上清液總體積的1/5。
[0015] 優(yōu)選地，在步驟S1028之后，進(jìn)一步包括步驟S1029 :以RNsae - free水為空白對(duì) 照，使用分光光度計(jì)分別測定各RNA樣品的A230、A260與A280值，判定RNA樣品的純度并 計(jì)算其總量；通過凝膠電泳判斷RNA樣品的完整性。
[0016] 在本發(fā)明提供的篩選方法中，優(yōu)選地，上述步驟S103,根據(jù)提取出的雌花(雄花） 總RNA建立雌花(胸花）cDNA文庫的方法包括：S1031，純化所述雌花總RNA或雄花總RNA ; S1032,收集小于30bp的small RNA片段，并經(jīng)過T4RNA連接酶加上人工接口；S1033,將步 驟S1032處理后的RNA片段反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;S1034,對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雌花 cDNA文庫或雄花cDNA文庫。
[0017] 在本發(fā)明提供的篩選方法中，優(yōu)選地，所指雌雄異株植物為楊樹。
[0018] 由上述技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明提供的技術(shù)方案克服了雌雄異株植物基因型對(duì) 差異表達(dá)microRNA篩選的影響，可以精準(zhǔn)的篩選在雌雄花器官之間差異表達(dá)的microRNA， 而且該方法充分利用了第二代高通量測序技術(shù)，對(duì)差異表達(dá)microRNA進(jìn)行高通量的篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí) 施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0020] 圖1示出了本發(fā)明所提供的雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA篩 選方法流程示意圖；
[0021] 圖2示出了采用改良前后的CTAB方法提取出去的RNA的電泳對(duì)比圖；其中，A為 采用現(xiàn)有CTAB方法提取出的RNA的電泳圖，B為采用改良后CTAB方法提取出的RNA的電 泳圖；
[0022] 圖3示出了毛白楊雄全同株個(gè)體和雌全同株個(gè)體產(chǎn)生的混合性別花器官的電鏡 掃描圖；
[0023] 圖4示出了預(yù)測的部分非保守microRNA結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面將結(jié)合本申請(qǐng)的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本申請(qǐng)的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明，但如 下實(shí)施例僅是用以理解本申請(qǐng)，而不能限制本申請(qǐng)，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征 可以相互組合，本申請(qǐng)可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實(shí)施。
[0025] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的無法篩選出雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá) 的microRNA的問題，本發(fā)明針對(duì)楊樹雌雄異株植物基因型效應(yīng)對(duì)雌雄花器官差異表達(dá) microRNA篩選的影響，提供了一種基于新的研究策略而形成的新的篩選方法，該方法包括 以下步驟：
[0026] S101，選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官；
[0027] S102,分別從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA，得到雌花總RNA和雄花總 RNA ；
[0028] S103,根據(jù)提取出的雌花總RNA建立雌花cDNA文庫，根據(jù)提取出的雄花總RNA建 立雄花cDNA文庫；
[0029] S104,分別對(duì)雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫進(jìn)行測序；
[0030] S105,根據(jù)測序結(jié)果及microRNA評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，判斷雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫 所對(duì)應(yīng)的microRNA種類及數(shù)量；以及
[0031] S106,根據(jù)microRNA的種類及數(shù)量，篩選出雌性花器官與雄性花器官差異表達(dá)的 microRNA〇
[0032] 通過以上步驟可以看出，因?yàn)檫x取了具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器 官，從而避免了基因型效應(yīng)對(duì)于雌雄花器官差異表達(dá)microRNA篩選的影響，為后續(xù)的高通 量篩選雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA提供了重要的技術(shù)支持。
[0033] 下面我們將結(jié)合圖1根據(jù)本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，逐步解釋每一個(gè)步驟的具體 實(shí)施過程。
[0034] 關(guān)于步驟S101，其目的在于通過選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器 官，從而避免了基因型效應(yīng)對(duì)于雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA篩選的影響。具體而言， 本發(fā)明的發(fā)明人利用雌雄異株植物的雄全同株個(gè)體或者雌全同株個(gè)體產(chǎn)生的兩性花器官 獲得了具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官，該類型的雌性花器官和雄性花器官因 為產(chǎn)生自同一個(gè)體，因此具有相同的基因型。由于通常雄全同株個(gè)體或者雌全同株個(gè)體非 常罕見，可用于RNA提取的樣本量較少。因此，為了保證RNA不被降解，在本發(fā)明提供的 具體實(shí)施例中，對(duì)兩性花器官的分離是在超低溫下進(jìn)行的，例如，在液氮環(huán)境（_196°C)中， 可利用槍型鑷和解剖針將兩性花器官分離，由于在低溫下植物材料易碎，整個(gè)過程需要緩 慢仔細(xì)進(jìn)行，以防止植物材料破碎。
[0035] 關(guān)于步驟S102,從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA，得到雌花總RNA和雄花 總RNA。此步驟的目的在于得到雌花總RNA和雄花總RNA，以便分析差異化表達(dá)的mircoRNA。 在現(xiàn)有技術(shù)中，提取植物中總RNA的方法有很多種，本發(fā)明并不限制提取RNA的方法。在本 發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中采用CTAB法對(duì)雄性花器官和雌性花器官進(jìn)行總RNA的提取。這里 所指的CTAB法是指利用CTAB進(jìn)行RNA提取的方法，CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀 核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中（>〇.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多 聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸.通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后 加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。本發(fā)明可采用傳統(tǒng)的CTAB方法進(jìn)行RNA提取，也可以 采用改良后的CTAB方法提取RNA。
[0036] 常規(guī)的CTAB方法可包括如下實(shí)施步驟：取雌性花器官或雄性花器官兩克，液氮 中研磨成細(xì)粉末；加入10ml65°C預(yù)熱的CTAB提取液和500 μ 1 β -巰基乙醇，劇烈渦旋勻 漿，65°C水浴溫育30min ;每管加入IOml氯仿異戊醇（24 :1)，渦旋混勻，冰浴lOmin。4°C， 12000rpm離心lOmin。取上清，加入I / 3體積的8M LiCl和500μ1β-乙醇，-20°C沉 淀過夜；4 °C，12000rpm離心20min。棄上清，沉淀用4ml異硫氰酸胍變性液溶解，加入 120 μ 1 β -巰基乙醇和880 μ 12M Na Ac (pH4. 0)，混勻后加入5ml的酚：氯仿：異戊醇（25 : 24:1)，潤旋混勻，冰浴5min。4°C，12000rpm離心10min。取上清，加入等體積酚：氯仿：異 戊醇（25 :24:1)，潤旋混勻，冰浴5111；[11。41€，12000印1]1離心1〇111；[11。取上清，加入等體積氯 仿：異戊醇（24:1)，潤旋混勻，冰浴5min。4°C，12000rpm離心10min。取上清，加入1 / 10 體積的31似40(?冊.2)和2.5倍體積的無水乙醇，-201：放置過夜。41：，14000印111。加入 100以18似86-仕66-(1(1!120溶解沉淀。取1(^1稀釋200倍檢測淠入230、260、280下的(? 值，檢測RNA樣品的純度與濃度。
[0037] 本發(fā)明提供的改良后的CTAB法的具體流程為：S1021，取雌性花器官或雄性花器 官加上等量的聚丙烯吡咯烷酮，液氮研磨，收集到離心管中；S1022,將預(yù)熱的CTAB提取液 以及β -巰基乙醇加入所述離心管中，混勻，65°C水??；S1023,加入氯仿和異戊醇，混勻抽 提，在4°C下離心分離，取上清液，加入1/3至1/5體積的12M Licl，在4°C下沉淀；S1024,在 4°C下繼續(xù)離心分離，棄上清液，加入緩沖液溶解沉淀，將溶解RNA后的緩沖液轉(zhuǎn)移到另一 離心管中；S1025,加入氯仿和異戊醇，混勻抽提，在4°C下離心，取上清液，重復(fù)抽提多次； S1026,取所述S1025得到的所述上清液，加入1/10體積的3M NaAC與2. 5倍體積的無水乙 醇，混勻后，_20°C靜置沉淀RNA，在4°C下離心，棄上清液，收集沉淀物；S1027,將步驟S1026 得到的所述沉淀物溶于RNase-free水中，并利用DNA消化酶去除DNA，在37°C溫度下水浴， 加入等體積的氯仿和異戊醇，混勻后離心分離；S1028,將步驟S1027得到的所述上清液分 裝到1.5ml的離心管中，然后加入無水乙醇和NaAC，混勻后，-20°C靜置并沉淀，在4°C下離 心分離，棄上清液，收集沉淀物，分離得到總RNA。通過實(shí)施上述提取過程，就可將雌性花器 官和雄性花器官中的總RNA提取出來。這種改良的CTAB方法與傳統(tǒng)方法相比，在抽提步驟 中，減少了等體積苯酚：氯仿：異戊醇抽提這一步驟，不但精簡了試驗(yàn)步驟，還取得了很好 的提取效果。另外，在步驟S1023中，優(yōu)選加入Licl的濃度為12M，加入量為上清液總體積 的1/5體積，與傳統(tǒng)方法相比，改變了 LiCL的濃度和用量。通過以上步驟的改良，使得本發(fā) 明提供的CTAB方法具有所需組織量小，適用于微量組織取樣，有利于提高轉(zhuǎn)錄分析的精準(zhǔn) 性的優(yōu)點(diǎn)；將采用傳統(tǒng)CTAB方法提取出的總RAN與采用改良后CTAB法提取的總RAN的電 泳圖片（如圖2所示）可以看出，采用改良后CTAB方法提取得到的RNA片段完整，無拖尾現(xiàn) 象，說明該方法提取的精準(zhǔn)性更好，純度更高。
[0038] 完成上述步驟后，可進(jìn)一步對(duì)得到的總RNA進(jìn)行測試和計(jì)算，具體可以 RNsae-free水為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)分別測定各RNA樣品的A230、A260與A280值， 判定RNA樣品的純度并計(jì)算其總量，然后通過凝膠電泳判斷RNA樣品的完整性。
[0039] 關(guān)于S103,完成總RAN的提取后，就可以根據(jù)提取出的雌花總RNA建立雌花cDNA 文庫，根據(jù)提取出的雄花總RNA建立雄花cDNA文庫了；根據(jù)RNA建立cDNA文庫的方法已經(jīng) 為常規(guī)技術(shù)方法，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，構(gòu)建cDNA文庫的具體方法包括：S1031，純 化雌花總RNA或雄花總RNA，可采用15%PAGE電泳分離的方法進(jìn)行RNA的純化工作；S1032， 收集小于30bp的small RNA片段，并經(jīng)過T4RNA連接酶加上人工接頭，該步驟需要加上一致 序列的人工接頭，其目的在于為接下來邊合成邊測序過程所需要的引物提供序列信息。，因 為該人工接頭方式為第二代高通量測序技術(shù)的常規(guī)技術(shù)手段，在此就不再贅述；S1033,將 步驟S1032處理后的RNA片段反轉(zhuǎn)錄成cDNA,具體而言可采用Super-Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)方法實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄；S1034,對(duì) cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，就可以得到雌花cDNA文庫和雄花cDNA文庫了。
[0040] 關(guān)于S104,對(duì)雌花CDNA文庫和雌花CDNA文庫進(jìn)行測序；該測序方法為常規(guī)測序 方法，【具體實(shí)施方式】為現(xiàn)有技術(shù)，在此將不再贅述。
[0041] 關(guān)于S105,根據(jù)測序結(jié)果及microRNA評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，判斷雌花cDNA文庫和雌花cDNA 文庫所對(duì)應(yīng)的microRNA種類及數(shù)量。具體而言，包括：
[0042] 第一，可根據(jù)測序reads數(shù)量估算microRNA表達(dá)量；
[0043] 第二，可根據(jù)miRNA評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)(Meyers等，2008)對(duì)非保守miRNA進(jìn)行鑒定。鑒定 具體標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0044] UmiRNA前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)為典型的莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)；
[0045] 2、莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中的堿基錯(cuò)配數(shù)蘭4nt ;
[0046] 3、miRNA成熟序列中間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)不能超過2個(gè)，并且單個(gè)莖環(huán)內(nèi)部堿基數(shù)不能 大于2個(gè)；
[0047] 4、miRNA*序列結(jié)構(gòu)同樣遵循第2,第3條標(biāo)準(zhǔn)；
[0048] 5、miRNA的環(huán)臂長度在10至IOOnt之間；
[0049] 6、整個(gè)前體長度在幾十到300nt之間；
[0050] 7、miRNA成熟序列長度在20-23nt之間；
[0051] 8、自由能（MFE)小于 _20kcal/mol。
[0052] 上述非保守miRNA的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)具體出處為Meyers2008年論文：Criteria for annotation of plant MicroRNAs. Plant Cell, 200820(12) :3186-3190.非保守miRNA判斷 可使用 Mireap 軟件（http://sourceforge. net/projects/mireap/)進(jìn)行篩選；
[0053] 第三，保守miRNA則是通過對(duì)上述miRNA候選序列對(duì)判別分析之后，與mirbase數(shù) 據(jù)庫19. 0進(jìn)行BLAST就可以篩選得到保守miRNA序列。mirbase數(shù)據(jù)庫19. 0是公開數(shù)據(jù) 庫，可通過WWW. mirbase. org網(wǎng)址免費(fèi)使用。
[0054] 根據(jù)上述具體判斷步驟，篩選人員就可以判斷出雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫 所對(duì)應(yīng)的microRNA種類及數(shù)量。
[0055] 因此，根據(jù)步驟S105結(jié)果，可實(shí)施步驟S106。即根據(jù)microRNA的種類及數(shù)量，篩 選出雌性花器官與雄性花器官差異表達(dá)的microRNA。進(jìn)而根據(jù)所得差異表達(dá)的microRNA, 可進(jìn)行雌雄異株中雌雄花器官差異表達(dá)分析，預(yù)測microRNA作用的靶基因以及性別特異 遺傳標(biāo)記開發(fā)等后續(xù)研究。
[0056] 以下將以楊樹的雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA的篩選過程為例，進(jìn)一步說明 本發(fā)明所提供的篩選方法。
[0057] 實(shí)施例1
[0058] 原料的獲得：毛白楊雄全同株個(gè)體（Populus tomentosa '2-14'）來源于全國毛白 楊種質(zhì)資源庫；
[0059] CTAB法中采用的各種試劑均為市售產(chǎn)品；
[0060] 采用Mireap軟件系統(tǒng)進(jìn)行microRNA評(píng)估。
[0061] 具體操作步驟如下：
[0062] 步驟S101,選擇毛白楊雄全同株個(gè)體（Populus tomentosa '2-14'）產(chǎn)生的混合 性別的花序。圖3示出了該雄全同株個(gè)體產(chǎn)生的混合性別的花器官的電鏡掃描圖。這兩幅 圖都是兩性花器官，左邊的是雄全同株，右邊的是雌全同株。Pi代表Pistil (雌蕊），St代 表Staman(雄蕊），為了保證RNA不被降解，對(duì)兩性花器官的分離是在液氮環(huán)境（_196°C) 中進(jìn)行的，利用槍型鑷和解剖針將兩性花器官分離，由于在低溫下植物材料易碎，整個(gè)過 程需要緩慢仔細(xì)進(jìn)行，以防止植物材料破碎。
[0063] 步驟S102,利用改良的CTAB法對(duì)微量的花序樣品的總RNA進(jìn)行提取。具體方法 如下：
[0064] 步驟S1021，在0. Ig左右的植物組織加上等量PVPP(聚丙烯吡咯烷酮)，液氮研磨， 收集50ml離心管中；
[0065] 步驟 S1022,加入 15ml (W:V=1:5)65°C預(yù)熱的 CTAB 提取液（CTAB2%，PVP4%，EDTA2 5mM, Nacl2. OmM, Tris-HCllOOmM, ρΗ8· 0)，并加入 300 μ L β -巰基乙醇，渦旋混勻，65°C水浴 IOmin;
[0066] 步驟S1023,加入等體積的氯仿：異戊醇（V :V=24:1)，輕輕混勻抽提 IOmin, 4°C 12000rpm 離心 10min。取上清液，加入 1/5 體積的 12MLicl, 4°C沉淀 2h;
[0067] 步驟S1024,在4°C 12000rpm離心20min。棄上清液，加入800 μ LSSTE緩沖液溶 解沉淀。將溶解RNA后的緩沖液轉(zhuǎn)移到2ml離心管中；
[0068] 步驟S1025,加入等體積氯仿：異戊醇，輕輕混勻抽提5min，4°C 12000rpm離心 10min。取上清液，重復(fù)抽提2次；
[0069] 步驟S1026,取上清液，加入1/10體積的3M NaAC(ρΗ5· 2)與2. 5倍體積的無水乙 醇，混勻后，_20°C靜置2h沉淀RNA。4°C 12000rpm離心20min，棄上清液，收集沉淀；
[0070] 步驟S1027,利用DNA消化酶去除DNA(溶于水的RNAl μ g，IOXDNase反應(yīng)緩沖液 10 μ L，DNaselO μ L，RNase-free 水補(bǔ)至 50 μ L) 37°C水浴 30min。加入等體積的 24:1 (氯 仿：異戊醇）上下顛倒混勻后12000轉(zhuǎn)10min，離心；
[0071] 步驟S1028,將上清液分裝到I. 5ml的離心管中，然后加入3倍體積的無水乙醇和 1/3 體積的 10mol/L 的 NaAC，混勻后，-20°C靜置 2h 沉淀 RNA。4°C 12000rpm 離心 20min,棄 上清液，收集沉淀，得到總RNA提取物。
[0072] 最后可以檢測以下提取得到RNA的純度、總量和完整性，具體而言，以RNsae-free 水為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)分別測定各RNA樣品的A230、A260與A280值，判定RNA樣 品的純度并計(jì)算其總量。通過凝膠電泳判斷RNA樣品的完整性。
[0073] 然后實(shí)施步驟S103,根據(jù)提取出的雌花總RNA建立雌花cDNA文庫，根據(jù)提取出的 雄花總RNA建立雄花cDNA文庫。將總RNA經(jīng)15%PAGE電泳分離純化后，切割回收小于30bp 的small RNA片段，然后經(jīng)過T4RNA連接酶加上人工接口，再經(jīng)Super-Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，最后 PCR 擴(kuò)增，回收 cDNA 文庫。
[0074] 實(shí)施步驟S104,將cDNA文庫送至上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。
[0075] 實(shí)施步驟S105,根據(jù)測序結(jié)果及microRNA評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，判斷雌花cDNA文庫和雌花 cDNA文庫所對(duì)應(yīng)的microRNA種類及數(shù)量。
[0076] 根據(jù)reads數(shù)估算microRNA表達(dá)量，根據(jù)植物非保守microRNA評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行保 守RNA和非保守RNA的預(yù)測。具體結(jié)果如表1至表4所示：
[0077] 表1雄全同株毛白楊雌雄花器官差異表達(dá)保守miRNA
[0078]

【權(quán)利要求】
1. 一種雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達(dá)的microRNA的篩選方法，其特征在于，所 述方法包括： S101，選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官； S102,分別從所述雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA，得到雌花總RNA和雄花總 RNA ； S103，根據(jù)提取出的所述雌花總RNA建立雌花cDNA文庫，根據(jù)提取出的所述雄花總RNA 建立雄花cDNA文庫； 5104, 分別對(duì)所述雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫進(jìn)行測序； 5105, 根據(jù)測序結(jié)果及microRNA評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，判斷所述雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫 所對(duì)應(yīng)的microRNA種類及數(shù)量；以及 5106, 根據(jù)microRNA種類及數(shù)量，篩選出雌性花器官與雄性花器官差異表達(dá)的 microRNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，在所述步驟S101中，所述相同基因型 的雌性花器官和雄性花器官是通過從雌雄異株植物的雄全同株個(gè)體或者雌全同株個(gè)體產(chǎn) 生的兩性花器官中分離得到的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟S101是在超低溫條件下實(shí) 施的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟S102中采用CTAB法從所述 雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟S102采用的CTAB法包括： S1021，取雌性花器官或雄性花器官加上等量的聚丙烯吡咯烷酮，液氮研磨，收集到離 心管中； 51022, 將預(yù)熱的CTAB提取液以及β -巰基乙醇加入所述離心管中，混勻，65°C水??； 51023, 加入氯仿和異戊醇，混勻抽提，在4°C下離心分離，取上清液，加入1/3至1/5體 積的12M Licl，在4°C下沉淀； 51024, 在4°C下繼續(xù)離心分離，棄上清液，加入緩沖液溶解沉淀，將溶解RNA后的緩沖 液轉(zhuǎn)移到另一離心管中； 51025, 加入氯仿和異戊醇，混勻抽提，在4°C下離心，取上清液，重復(fù)抽提多次； 51026, 取所述S1025得到的所述上清液，加入1/10體積的3M NaAC與2. 5倍體積的無 水乙醇，混勻后，-20°C靜置沉淀RNA，在4°C下離心，棄上清液，收集沉淀物； 51027, 將步驟S1026得到的所述沉淀物溶于RNase-free水中，并利用DNA消化酶去除 DNA，在37°C溫度下水浴，加入等體積的氯仿和異戊醇，混勻后離心分離； 51028, 將步驟S1027得到的所述上清液分裝到1. 5ml的離心管中，然后加入無水乙醇 和NaAC，混勻后，-20°C靜置并沉淀，在4°C下離心分離，棄上清液，收集沉淀物，分離得到所 述總RNA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟S1021中，所述雌性花器官 或雄性花器官的用量為0. lg，所述步驟S1023中，12M Licl的加入量為上清液總體積的1/5 體積。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選方法，其特征在于，在所述步驟S1028之后，進(jìn)一步包括 步驟S1029 : 以RNsae - free水為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)分別測定各RNA樣品的A230、A260與 A280值，判定RNA樣品的純度并計(jì)算其總量； 通過凝膠電泳判斷RNA樣品的完整性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟S103包括： S1031，純化所述雌花總RNA或雄花總RNA ; 51032, 收集小于30bp的small RNA片段，并經(jīng)過T4RNA連接酶加上人工接口； 51033, 將所述步驟S1032處理后的RNA片段反轉(zhuǎn)錄成cDNA ; 51034, 對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所述雌花cDNA文庫或雄花cDNA文庫。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述雌雄異株植物為楊樹。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293889SQ201310298603
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】張德強(qiáng), 宋躍朋 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)