以楊樹纖維素合酶基因?yàn)榘谢虻奈鍌€(gè)microRNA基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了以楊樹纖維素合酶基因?yàn)榘谢虻奈鍌€(gè)microRNA基因及應(yīng)用。本發(fā)明的miRNA為具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5所示序列的miRNA；miRNA在植物中具有特定的表達(dá)部位，影響植物特定部位的纖維素合成；將miRNA的前體基因或者成熟miRNA直接放入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化至植物后可在植物體內(nèi)形成有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的前體，然后被加工修飾形成成熟miRNAs，進(jìn)而抑制或影響基因的表達(dá)，達(dá)到對(duì)基因進(jìn)行修飾的目標(biāo)。
【專利說明】以楊樹纖維素合酶基因?yàn)榘谢虻奈鍌€(gè)microRNA基因及 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及以楊樹纖維素合酶基因?yàn)榘谢虻奈?個(gè)microRNA基因及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNAs (miRNAs)是近年來在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控作用 的非編碼RNA，其核苷酸大小長約20?25。miRNA在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用，是 一類重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，通過不完全堿基互補(bǔ)的方式與mRNA相應(yīng)的區(qū)域結(jié)合，從而 抑制蛋白質(zhì)的翻譯；在植物中，其還可以降解mRNA，對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后起反向調(diào)控作用。隨著 miRNA調(diào)控基因表達(dá)研究的逐步深入，有助于理解1?等真核生物基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的 基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
[0003] 木材是自然界最為重要的可再生資源，通過生物轉(zhuǎn)化成乙醇，可替代石油做液體 燃料，同時(shí)也是紙漿造紙的重要原料。并且具有重要的生態(tài)價(jià)值，它是大氣碳元素長期的 沉淀池，是實(shí)現(xiàn)生物圈各種物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。木材形成是一個(gè)關(guān)鍵的發(fā)育過程，具有 重要的科學(xué)研究意義與應(yīng)用價(jià)值。隨著各種新的基因組技術(shù)在林木研究中的應(yīng)用，以及模 式植物的基因組序列公布后，對(duì)木材形成的分子和遺傳調(diào)控機(jī)理已有了較廣泛的認(rèn)識(shí)。近 年來，一系列與木材形成相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)部分功能也得到揭示。研究人員通過直接 克隆鑒定、miRNA芯片分析和測序技術(shù)等方法發(fā)現(xiàn)和次生細(xì)胞壁形成、木材形成過程及組 織特異性表達(dá)的 miRNAs。Lu 等（Lu S，Sun YH，Shi R，Clark C，Li L，Chiang VL(2005a) Novel and mechanical stress-responsive MicroRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis.Plant Celll7:2186_2203)通過應(yīng)力木系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了與木 材形成相關(guān)的多個(gè)miRNAs，其中miR160、miR167和miR408在應(yīng)力木木材形成過程中發(fā) 揮重要作用，證實(shí)了 miRNA在木材形成過程中起著重要作用。并且還有研究發(fā)現(xiàn)miR159 可通過靶向調(diào)節(jié)與赤霉素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)的GAMYB5家族的MYB33和MYB65在內(nèi)的多個(gè)靶 基因調(diào)節(jié)赤霉素通路（Achard P，Herr A，Baulcombe DC，Harberd NP(2004)Modulation of floral development by a gibbere11 in-regulated microRNA. Development131:335 7-3365;Jover-Gil SjCandela HjPonce MR(2005)Plant microRNAs and development. The International journal of developmental biology49:733-744)，而赤霉素在植物 莖的伸長和木材形成過程中起重要作用，這樣miR159是否通過赤霉素及其相關(guān)基因調(diào)節(jié) 木材形成過程值得深入研究。而miR408在應(yīng)拉木形成過程中顯著差異表達(dá)，可能抑制木 質(zhì)素的分布繼而影響應(yīng)力木的形成。miR166已經(jīng)被證明通過抑制調(diào)節(jié)HD-ZIP III轉(zhuǎn)錄 因子在木材形成過程中起調(diào)節(jié)作用（Ko JH，Prassinos C，Han KH(2006)Developmental and seasonal expression of PtaHBlj a Populus gene encoding a class III HD-Zip protein, is closely associated with secondary growth and inversely correlated with the level of microRNA(miR166). The New phytologistl69:469-478;Lu SjSun YH, Shi R, Clark C, Li L,Chiang VL(2005a)Novel and mechanical stress-responsive MicroRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis. Plant Celll7: 2186-2203)，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Ptr-miR397a能夠負(fù)調(diào)控漆酶來調(diào)控楊樹木質(zhì)素生物合成 (Lu S, Li Q, Wei H, et al.Ptr-miR397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2013)〇
[0004] 多項(xiàng)研究表明miRNAs在木材形成過程中起著重要調(diào)節(jié)作用，雖然在楊樹中多個(gè) miRNA陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和鑒定，但其確切功能和調(diào)控機(jī)制還未被闡釋清楚，仍然值得深入研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供以楊樹纖維素合酶基因?yàn)榘谢虻奈鍌€(gè)microRNA基因及應(yīng)用， 明確了纖維素生物合成過程中miRNA調(diào)控機(jī)制。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離的miRNA，該miRNA 選自：
[0007] ⑴miRNA是：SEQIDN0:l所示序列的miRNA;SEQIDN0:2所示序列的miRNA ;SEQ ID N0:3所示序列的miRNA;SEQ ID N0:4所示序列的miRNA;或者SEQ ID N0:5所示序列的 miRNA ；
[0008] (ii)與⑴限定的任一序列互補(bǔ)的miRNA ;或
[0009] (iii)與（i)或（ii)限定的任一序列有0?5個(gè)堿基差異的miRNA。
[0010] 進(jìn)一步地，上述miRNA分離自楊柳科植物。
[0011] 進(jìn)一步地,上述楊柳科植物是毛白楊。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA，該前體 miRNA能在植物細(xì)胞內(nèi)剪切并表達(dá)成上述的miRNA;表達(dá)成SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA 的前體miRNA具有SEQ ID N0:6所示序列；表達(dá)成SEQ ID N0:2所示序列的miRNA的前體 miRNA具有SEQ ID NO: 7所示序列；表達(dá)成SEQ ID NO: 3所示序列的miRNA的前體miRNA具 有SEQ ID N0:8所示序列；表達(dá)成SEQ ID N0:4所示序列的miRNA的前體miRNA具有SEQ ID N0:9所示序列；表達(dá)成SEQ ID N0:5所示序列的miRNA的前體miRNA具有SEQ ID N0:10 所示序列。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種分離的纖維素合酶基因，該纖維素合酶基因 是上述miRNA的靶基因，其中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的 序列為SEQ ID NO: 11;對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:2所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為 SEQ ID NO: 12;對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:3所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為SEQ ID NO: 13;對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:4所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為SEQ ID NO: 12; 對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:5所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO:15。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種分離的或人工構(gòu)建的多核苷酸，該多核苷酸 的序列是上述前體miRNA序列的DNA序列。
[0015] 進(jìn)一步地，上述多核苷酸的結(jié)構(gòu)如式I所示：Seqirt-X-Seqi^S I，其中，Seq1向?yàn)?在植物細(xì)胞中表達(dá)成權(quán)利要求1的miRNA的核苷酸序列，Seq &@為與Seq正向基本上互補(bǔ) 的核苷酸序列；或者Seq&@為在植物細(xì)胞中表達(dá)成權(quán)利要求1的miRNA的核苷酸序列，Seq I向?yàn)榕c基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；X為位于間的間隔序列，并且 間隔序列與Seq1^1和S eq&@不互補(bǔ)；且式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，形成式II所示 的二級(jí)結(jié)構(gòu)：

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的miRNA，其特征在于，所述miRNA是： SEQ ID N0:1所示序列的miRNA ; SEQ ID N0:2所示序列的miRNA; SEQ ID N0:3所示序列的miRNA; SEQ ID N0:4所示序列的miRNA;或者 SEQ ID N0:5所示序列的miRNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA分離自楊柳科植物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的miRNA，其特征在于，所述楊柳科植物是毛白楊。
4. 一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA，其特征在于，所述前體miRNA能在植物細(xì)胞內(nèi) 剪切并表達(dá)成權(quán)利要求1所述的miRNA ; 表達(dá)成所述SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA的所述前體miRNA具有SEQ ID NO:6所示 序列； 表達(dá)成所述SEQ ID NO: 2所示序列的miRNA的所述前體miRNA具有SEQ ID NO: 7所示 序列； 表達(dá)成所述SEQ ID NO: 3所示序列的miRNA的所述前體miRNA具有SEQ ID NO: 8所示 序列； 表達(dá)成所述SEQ ID NO: 4所示序列的miRNA的所述前體miRNA具有SEQ ID NO: 9所示 序列； 表達(dá)成所述SEQ ID NO: 5所示序列的miRNA的所述前體miRNA具有SEQ ID NO: 10所 示序列。
5. -種分離的纖維素合酶基因，其特征在于，所述纖維素合酶基因是權(quán)利要求1所述 的miRNA的靶基因，其中， 對(duì)應(yīng)于所述SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為SEQ ID NO:11 ； 對(duì)應(yīng)于所述SEQ ID N0:2所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為SEQ ID NO:12 ； 對(duì)應(yīng)于所述SEQ ID N0:3所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為SEQ ID NO:13 ； 對(duì)應(yīng)于所述SEQ ID N0:4所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為SEQ ID NO:12 ； 對(duì)應(yīng)于所述SEQ ID N0:5所示序列的miRNA的纖維素合酶基因的序列為SEQ ID NO: 14 或 SEQ ID NO:15。
6. -種分離的或人工構(gòu)建的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列是權(quán)利要求 4所述的前體miRNA序列的DNA序列。
7. 如權(quán)利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的結(jié)構(gòu)如式I所示： Seq正向-X-Seq反向式I，其中， 所述Seqj^為在植物細(xì)胞中表達(dá)成權(quán)利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，所述Seq& @為與所述Seq正向基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；或者 所述Seq&@為在植物細(xì)胞中表達(dá)成權(quán)利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，所述SeqE @為所述與seq&@基本上互補(bǔ)的核苷酸序列； X為位于所述Seqtt和所述5叫_之間的間隔序列，并且所述間隔序列與所述Seqtt 和所述Seq&@F互補(bǔ)；且 所述式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，形成式Π所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)：
Seq^fispSeq^iii]和X的定義如上述，| |表不在Seq^fji]和Seq&t；i)之間的基本互補(bǔ)的關(guān)系。
8. -種抑制目的基因表達(dá)的方法，其特征在于，所述方法包括步驟： 將權(quán)利要求6所述的多核苷酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞中； 通過剪切目的基因或者抑制基因翻譯的方式來抑制所述目的基因的表達(dá)。
9. 一種用于制備抑制或者調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)的組合物，其特征在于，所述組合物包括 權(quán)利要求1所述的miRNA。
10. -種載體，其特征在于，所述載體包括權(quán)利要求1所述的miRNA或權(quán)利要求6所述 的多核苷酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104293784SQ201310298637
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】張德強(qiáng), 陳金輝, 王博文 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)