一種樹(shù)木snp位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種樹(shù)木SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法包括：步驟S1.采用擴(kuò)增引物對(duì)樹(shù)木的全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度不大于500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中擴(kuò)增引物具有生物素標(biāo)記；步驟S2.對(duì)步驟S1中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈制備，得到5’端有生物素標(biāo)記的DNA單鏈，DNA單鏈包含多個(gè)待測(cè)位點(diǎn)；步驟S3.利用測(cè)序引物對(duì)步驟S2得到的DNA單鏈進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析，其中序列讀取長(zhǎng)度為20～50bp，混合酶用量為390～395μl/plate，熒光底物用量為390～395μl/plate，得到分型結(jié)果。該檢測(cè)方法延長(zhǎng)了測(cè)序長(zhǎng)度，一次測(cè)序檢測(cè)多位點(diǎn)；同時(shí)節(jié)約了1/3試劑用量，降低了成本。
【專利說(shuō)明】一種樹(shù)木SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種樹(shù)木SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 焦磷酸測(cè)序分型技術(shù)主要是利用了核酸鏈延伸時(shí)，每添加一個(gè)核苷酸殘基，就會(huì) 釋放一個(gè)焦磷酸基團(tuán)（PPi )，而PPi與腺苷酰硫酸(APS)在酶的催化下，會(huì)生成等量的ATP。 ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，釋放出強(qiáng)度與ATP量成正比的可見(jiàn)光信 號(hào)。因此，由可見(jiàn)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)弱，可以判斷該核苷酸殘基是否連接到了核酸鏈末端以 及連接的數(shù)量。所以通過(guò)分別依次向以待測(cè)序DNA單鏈為模板的引物雜交延伸體系中加入 硫代三磷酸腺苷（dATPS，替代dATP )、三磷酸鳥(niǎo)苷（dGTP )、三磷酸胞苷（dCTP )和三磷酸胸苷 (dTTP)四種中的一種，通過(guò)檢測(cè)是否有可見(jiàn)光產(chǎn)生以及可見(jiàn)光強(qiáng)度的大小，可以判斷延伸 的核苷酸殘基類型以及數(shù)量，從而達(dá)到對(duì)模板DNA單鏈進(jìn)行測(cè)序以及基因型類型檢測(cè)的目 的。
[0003] 目前，焦磷酸測(cè)序分型技術(shù)主要應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)以及動(dòng)物研究領(lǐng)域，植物領(lǐng)域極 少使用，尤其是樹(shù)木領(lǐng)域則是空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種樹(shù)木SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法，彌補(bǔ)了焦磷酸測(cè)序分型技術(shù) 在樹(shù)木領(lǐng)域的空白。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種樹(shù)木SNP位點(diǎn)基因型檢 測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括：步驟S1，采用擴(kuò)增引物對(duì)樹(shù)木的全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到長(zhǎng)度不大于500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中擴(kuò)增引物具有生物素標(biāo)記；步驟S2,對(duì)步驟Sl 中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈制備，得到5'端有生物素標(biāo)記的DNA單鏈，DNA單鏈包含 多個(gè)待測(cè)位點(diǎn)；步驟S3,利用測(cè)序引物對(duì)步驟S2得到的DNA單鏈進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析，其 中序列讀取長(zhǎng)度為20?50bp，混合酶用量為390?395 μ Ι/plate，熒光底物用量為390? 395μ Ι/plate，得到分型結(jié)果。
[0006] 進(jìn)一步地，上述擴(kuò)增引物包括正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物，且正向擴(kuò)增引物或 者反向擴(kuò)增引物具有生物素標(biāo)記。
[0007] 進(jìn)一步地，上述待測(cè)位點(diǎn)中第一個(gè)待測(cè)位點(diǎn)靠近測(cè)序引物的3'末端最后一個(gè)堿 基。
[0008] 進(jìn)一步地，上述步驟Sl中PCR擴(kuò)增的體系為25μ 1，由20ng全基因組DNA、0. 8U Taq酶、(λ 2mM dNTPs、10 X PCR緩沖液以及50ng正向引物和50ng反向引物和超純水組成。
[0009] 進(jìn)一步地，上述步驟Sl中PCR擴(kuò)增包括：步驟S11，將全基因組DNA依次在95°C 下預(yù)變性6min、95°C下變性30s，得到變性產(chǎn)物；步驟S12,將變性產(chǎn)物在50?60°C下退火 30s，得到退火產(chǎn)物；步驟S13,將退火產(chǎn)物在72°C下延伸Imin ;步驟S14,將步驟Sll至步驟 S13重復(fù)35?45次，且最后一次的步驟S13持續(xù)lOmin。
[0010] 進(jìn)一步地，上述步驟S2中DNA單鏈制備包括：步驟S21，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與結(jié)合緩 沖液、瓊脂糖珠進(jìn)行混合，形成混合物；步驟S22,將混合物進(jìn)行化學(xué)變性，得到具有生物素 標(biāo)記的DNA單鏈。
[0011] 進(jìn)一步地，上述樹(shù)木為小葉楊，待測(cè)位點(diǎn)為CBF2基因的SNPl位點(diǎn)和SNP2位點(diǎn)， SNPl位點(diǎn)位于CBF2基因的68bp處，SNP2位點(diǎn)位于CBF2基因的95bp處，其中CBF2基因的 喊基序列為SEQ ID NO :1。
[0012] 進(jìn)一步地，上述擴(kuò)增引物包括正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物，其中正向擴(kuò)增引物 的堿基序列為SEQ ID N0:2,反向擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID N0:3,且正向擴(kuò)增引物采 用生物素進(jìn)行標(biāo)記。
[0013] 進(jìn)一步地，上述測(cè)序引物的堿基序列為SEQ ID N0:4，SNP1位點(diǎn)的基因型為T和C， SNP2位點(diǎn)的基因型為A和G，且SNP2位點(diǎn)與測(cè)序引物3'末端最后一個(gè)堿基之間具有一個(gè) 喊基。
[0014] 本發(fā)明的技術(shù)方案利用了樹(shù)木基因雜合度高、DNA序列多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，將測(cè)序 長(zhǎng)度由現(xiàn)有技術(shù)中的20bp延長(zhǎng)到20?50bp，從而使得一次測(cè)序反應(yīng)得到更多的位點(diǎn)基因 型信息；同時(shí)將混合酶用量和熒光底物用量均由現(xiàn)有技術(shù)中的588 μ Ι/plate減少至390? 395yl/plate，節(jié)約了三分之一的用量，因此在保證了檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上降低了實(shí) 驗(yàn)成本。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0016] 圖1示出了實(shí)施例1的測(cè)序分型結(jié)果的基因型峰圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0018] 在本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式中，提供了一種樹(shù)木SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法，上 述檢測(cè)方法包括：步驟Sl，采用PCR擴(kuò)增引物對(duì)樹(shù)木的全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng) 度不大于500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述擴(kuò)增引物具有生物素標(biāo)記；步驟S2,對(duì)所述步驟 Sl中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈制備，得到5'端有生物素標(biāo)記的DNA單鏈，DNA單鏈包 含多個(gè)待測(cè)位點(diǎn)；步驟S3,利用測(cè)序引物對(duì)所述步驟S2得到的DNA單鏈進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分 析，其中序列讀取長(zhǎng)度為20?50bp，混合酶用量為390?395 μ Ι/plate，熒光底物用量為 390?395μ Ι/plate，得到分型結(jié)果。
[0019] 上述技術(shù)方案利用了樹(shù)木基因雜合度高、DNA序列多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，將測(cè)序長(zhǎng) 度由現(xiàn)有技術(shù)中的20bp延長(zhǎng)到20?50bp，從而使得一次測(cè)序反應(yīng)得到更多的位點(diǎn)基因型 信息；同時(shí)將混合酶用量和熒光底物用量均由現(xiàn)有技術(shù)中的588 μ Ι/plate減少至390? 395yl/plate，節(jié)約了三分之一的用量，因此在保證了檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上降低了實(shí) 驗(yàn)成本。其中的混合酶和熒光底物均為本領(lǐng)域進(jìn)行焦磷酸測(cè)序時(shí)的常規(guī)物質(zhì)，比如混合酶 為DNA聚合酶（DNA polymerase)、硫酸化酶（ATP sulfurylase)、突光素酶（Iuciferase)和 雙磷酸酶（apyrase)組成的混合酶，在此不再贅述。
[0020] 上述檢測(cè)方法中所應(yīng)用的擴(kuò)增引物包括正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物，且正向擴(kuò) 增引物或者反向擴(kuò)增引物具有生物素標(biāo)記。
[0021] 為了提高分型結(jié)果的準(zhǔn)確性以及增加待測(cè)位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，優(yōu)選上述待測(cè)位點(diǎn)中第一 個(gè)待測(cè)位點(diǎn)靠近測(cè)序引物的3'末端最后一個(gè)堿基。
[0022] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施例中，優(yōu)選上述步驟Sl中PCR擴(kuò)增的體系為25 μ 1，由 20ng全基因組DNA、0. 8U Taq酶、0· 2mM dNTPs、10XPCR緩沖液以及50ng正向引物和50ng 反向引物和超純水組成。
[0023] 在進(jìn)行步驟Sl的PCR擴(kuò)增時(shí)，為了提高所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和特異性， 優(yōu)選上述步驟Sl中PCR擴(kuò)增包括：步驟S11，將全基因組DNA依次在95°C下預(yù)變性6min、 95°C下變性30s，得到變性產(chǎn)物；步驟S12,將變性產(chǎn)物在50?60°C下退火30s，得到退火產(chǎn) 物；步驟S13,將退火產(chǎn)物在72°C下延伸Imin ;步驟S14,將步驟Sll至步驟S13重復(fù)35? 45次，優(yōu)選39至42次，且最后一次的步驟S13持續(xù)lOmin。
[0024] 在本發(fā)明的又一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述步驟S2中DNA單鏈制備包括：步驟S21， 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與結(jié)合緩沖液、瓊脂糖珠進(jìn)行混合，形成混合物；步驟S22,將混合物進(jìn)行化 學(xué)變性，得到DNA單鏈。其中，單鏈DNA制備的步驟S21中的結(jié)合緩沖液常為現(xiàn)有技術(shù)中常 用的IOmM Tris-HC1、2M NaCl、lmM EDTA和0. l%Tween20組成的緩沖液；步驟S22中化學(xué) 變性也是利用本領(lǐng)域的常規(guī)變性緩沖液，如70%乙醇、0. 2M NaOH溶液和洗滌緩沖液（IOmM Tris-Acetate)。對(duì)于以上DNA單鏈制備過(guò)程中所應(yīng)用的試劑以及實(shí)際的用量，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特性和濃度，在已有背景知識(shí)的基礎(chǔ)上，合理選擇相應(yīng)的結(jié) 合緩沖液和變性緩沖液。
[0025] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選出的具體實(shí)施例中，上述樹(shù)木為小葉楊，待測(cè)位點(diǎn)為CBF2基 因的SNPl位點(diǎn)和SNP2位點(diǎn)，SNPl位于68bp處，SNP2位于95bp處，其中CBF2基因的堿基 序列為SEQ ID NO: 1。SNPl位點(diǎn)和SNP2位點(diǎn)的距離為26bp，也就是說(shuō)即使相距26bp的位 點(diǎn)也可以采用本發(fā)明的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0026] 在對(duì)小葉楊的CBF4基因的SNP12位點(diǎn)和SNP13位點(diǎn)進(jìn)行分析時(shí)，優(yōu)選上述擴(kuò)增引 物包括正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物，其中正向擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID NO: 2，反向 擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID N0:3,且正向擴(kuò)增引物采用生物素進(jìn)行標(biāo)記。測(cè)序引物的 堿基序列為SEQ ID N0:4, SNPl位點(diǎn)的基因型為T和C，SNP2位點(diǎn)的基因型為A和G，且 SNP2位點(diǎn)與測(cè)序引物3'末端最后一個(gè)喊基之間具有一個(gè)喊基。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 從小葉楊自然分布區(qū)收集了 528株個(gè)體作為研究對(duì)象。提取每株個(gè)體的基因組 DNA后，隨機(jī)挑選了 40株個(gè)體，分別對(duì)其CBF2基因進(jìn)行克隆測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)確定候選 SNPs 位點(diǎn)為 SNPl 和 SNP2。
[0029] 針對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)的距離為26bp的SNPl位點(diǎn)和SNP2位點(diǎn)，在得到了小葉 楊CBF2基因完整序列的基礎(chǔ)之上，設(shè)計(jì)合成了正向擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID N0:2 :5' -TGCCTTCAGTTCTTGTTG-3'，反向擴(kuò)增引物的堿基序列為 SEQ ID N0:3 : 5 ' -GTTTGGTTCCCGCATCTC-3 '，其中正向擴(kuò)增引物用生物素進(jìn)行了標(biāo)記，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 280bp〇
[0030] 設(shè)計(jì)合成了一條堿基序列為SEQ ID N0:4 :5' -GCTTCTTGCCTGTCA-3'的反向測(cè)序 引物，兩個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)SNPl的基因型為T和C、SNP2的基因型為A和G，且SNP2位點(diǎn)與反 向測(cè)序引物的3'末端最后一個(gè)喊基相之間具有一個(gè)喊基。
[0031] 用上述擴(kuò)增引物，對(duì)小葉楊自然群體中單株的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終 得到了 6批次、共528個(gè)的CBF2基因部分片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增的體系為：20ng基 因組 DNA，0. 8UTaq 酶，0. 2mMdNTPs，10XPCR buffer 以及 50ng 正向引物和 50ng 反向引物， 補(bǔ)充超純水至25以1。？〇?擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性951：61^11，變性951：308，退火581：308， 延伸72°C lmin，40個(gè)循環(huán)，最后一次延伸72°C lOmin。
[0032] 在上述PCR擴(kuò)增后得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，每批次隨機(jī)選擇10個(gè)樣品，進(jìn)行抽樣 質(zhì)檢，用瓊脂糖凝膠電泳的方法，檢測(cè)其特異性和濃度，以判斷該批次全部擴(kuò)增產(chǎn)物是否可 以進(jìn)行隨后的單鏈制備和測(cè)序分型步驟隨后在每個(gè)樣品中，分別加入24μ 1的結(jié)合緩沖液 和1 μ 1的sepharose beads混合均勻，在振蕩器上震蕩15min，形成懸池混合物，其中，結(jié)合 緩沖液為 IOmM Tris-HCl, 2M NaCl, ImM EDTA 和 0. l%Tween20 組成的緩沖液。
[0033] 然后，將此懸濁混合物吸附到膜上，即依次置入70%乙醇、0. 2M NaOH溶液溶 液和IOmM Tris-Acetate的洗滌緩沖液中洗脫洗滌，最終在膜上得到生物素標(biāo)記的 正向單鏈DNA，隨后分別釋放到含有堿基序列為SEQ ID N0:3的反向測(cè)序引物的變 性退火緩沖液中，其中變性退火緩沖液為20mM Tris-Acetate和2mM Mg-Acetate組 成的緩沖液，通過(guò)焦磷酸測(cè)序分析儀進(jìn)行分型測(cè)定，測(cè)序分型參考序列設(shè)置為：TT/ CGGGCATTGAATTTGACCTCAAAGGATA/GTT。通過(guò)選取在儀器中預(yù)先設(shè)定的加樣參數(shù)方案：混合 酶注劑時(shí)間84ms，熒光底物注劑時(shí)間77ms，混合酶和熒光底物用量均為392ul/plate，最后 統(tǒng)計(jì)分型結(jié)果，峰形圖如圖1所示。
[0034] 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：SNP1位點(diǎn)的基因型分布為351株CC、102株TC和75株TT，SNP2位 點(diǎn)的基因型分布為422株GG和106株AG。由此可見(jiàn)，采用本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)相距26bp 的兩個(gè)位點(diǎn)也能在一次檢測(cè)中得到較為準(zhǔn)確的分型結(jié)果。
[0035] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0036]
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種樹(shù)木SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括： 步驟S1，采用擴(kuò)增引物對(duì)樹(shù)木的全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度不大于500bp的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述擴(kuò)增引物具有生物素標(biāo)記； 步驟S2,對(duì)所述步驟S1中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈制備，得到5'端有生物素標(biāo)記 的DNA單鏈，所述DNA單鏈包含多個(gè)待測(cè)位點(diǎn)； 步驟S3,利用測(cè)序引物對(duì)所述步驟S2得到的所述DNA單鏈進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析，其中 序列讀取長(zhǎng)度為20?50bp，混合酶用量為390?395 μ Ι/plate，熒光底物用量為390? 395μ 1/plate，得到分型結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述擴(kuò)增引物包括正向擴(kuò)增引物和 反向擴(kuò)增引物，且所述正向擴(kuò)增引物或者所述反向擴(kuò)增引物具有所述生物素標(biāo)記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)位點(diǎn)中第一個(gè)待測(cè)位點(diǎn)靠 近所述測(cè)序引物的3'末端最后一個(gè)堿基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S1中所述PCR擴(kuò)增的體系 為25μ1，由20ng全基因組DNA、0.8U Taq酶、0.2mM dNTPs、10XPCR緩沖液以及50ng正向 引物和50ng反向引物和超純水組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S1中所述PCR擴(kuò)增包括： 步驟S11，將所述全基因組DNA依次在95°C下預(yù)變性6min、95°C下變性30s，得到變性 產(chǎn)物； 步驟S12,將所述變性產(chǎn)物在50?60°C下退火30s，得到退火產(chǎn)物； 步驟S13,將所述退火產(chǎn)物在72°C下延伸lmin ; 步驟S14,將所述步驟SI 1至所述步驟S13重復(fù)35?45次，且最后一次的所述步驟S13 持續(xù)l〇min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S2中所述DNA單鏈制備包 括： 步驟S21，將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與結(jié)合緩沖液、瓊脂糖珠進(jìn)行混合，形成混合物； 步驟S22,將所述混合物進(jìn)行化學(xué)變性，得到具有所述生物素標(biāo)記的所述DNA單鏈。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述樹(shù)木為小葉楊，所 述待測(cè)位點(diǎn)為CBF2基因的SNP1位點(diǎn)和SNP2位點(diǎn)，所述SNP1位點(diǎn)位于所述CBF2基因的 68bp處，所述SNP2位點(diǎn)位于所述CBF2基因的95bp處，其中CBF2基因的堿基序列為SEQ ID NO :1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述擴(kuò)增引物包括正向擴(kuò)增引物和 反向擴(kuò)增引物，其中所述正向擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID NO: 2，所述反向擴(kuò)增引物的堿 基序列為SEQ ID N0:3,且所述正向擴(kuò)增引物采用所述生物素進(jìn)行標(biāo)記。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述測(cè)序引物的堿基序列為SEQ ID N0:4,所述SNP1位點(diǎn)的基因型為T和C，所述SNP2位點(diǎn)的基因型為A和G，且所述SNP2位 點(diǎn)與所述測(cè)序引物3'末端最后一個(gè)堿基之間具有一個(gè)堿基。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293894SQ201310298853
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】張德強(qiáng), 徐煲鏵, 杜慶章 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)