Snp位點(diǎn)基因型分型的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種SNP位點(diǎn)基因型分型的方法。該方法包括以下步驟：S1，對(duì)目標(biāo)區(qū)域的DNA序列進(jìn)行克隆測(cè)序和多重比對(duì)，確定待測(cè)SNP位點(diǎn)；S2，針對(duì)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引物的3'末端對(duì)應(yīng)待測(cè)SNP位點(diǎn)，將對(duì)應(yīng)待測(cè)SNP位點(diǎn)的3'末端上的核苷酸進(jìn)行LNA修飾；S3，采用PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中目的條帶的有無確定待測(cè)樣本的SNP位點(diǎn)基因型。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，采用鎖核酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以確定SNP位點(diǎn)的基因型，不僅增加了檢測(cè)結(jié)果的精確性和可靠性，而且極大地提高了實(shí)驗(yàn)的靈活性，簡(jiǎn)化了配套條件并顯著地降低了實(shí)驗(yàn)成本。
【專利說明】SNP位點(diǎn)基因型分型的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種SNP位點(diǎn)基因型分型的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 鎖核酸（Locked nucleic acid, LNA)是指核苷酸糖環(huán)上的2' -〇與4' -C由亞甲 基橋相連的一類RNA衍生物，可以與DNA或RNA按照一般的堿基配對(duì)原則進(jìn)行配對(duì)。這 種橋連結(jié)構(gòu)增加了核酸骨架的穩(wěn)定性，提高了退火溫度，增強(qiáng)了堿基配對(duì)的特異性，極 大的降低了錯(cuò)配發(fā)生的概率。因此鎖核酸在基因芯片、RNA干擾等許多領(lǐng)域得到了廣泛 的應(yīng)用（Braasch, D. A. and D. R. Corey, Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chemistry&biology, 2001. 8(I):p. 1-7. )〇
[0003] 理論上，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR)的順利進(jìn)行是以模 板單鏈與引物鏈按照堿基配對(duì)原則正確配對(duì)為前提。所以，在包含堿基差異的區(qū)域，設(shè)計(jì)一 組只有單堿基差異的PCR引物，利用常見的PCR擴(kuò)增儀，進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)是否有符合設(shè)計(jì)片 段長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，可以判斷目標(biāo)區(qū)域靶位點(diǎn)的堿基類型。但在使用常規(guī)PCR引物時(shí)， 即使存在單堿基的錯(cuò)配，PCR反應(yīng)有時(shí)也可以正常進(jìn)行，得到與目的片段長(zhǎng)度相同的擴(kuò)增產(chǎn) 物。因而使用常規(guī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分型時(shí)，無法排除假陽性結(jié)果，進(jìn)而可能會(huì)得到錯(cuò)誤的 基因型分型結(jié)果。
[0004] 目前，常用的SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)方法主要有測(cè)序法、芯片法以及質(zhì)譜法等，其中 測(cè)序法價(jià)格比較昂貴，而芯片法和質(zhì)譜法只有在同時(shí)測(cè)定多個(gè)位點(diǎn)或研究大群體樣品時(shí)較 有優(yōu)勢(shì)，且這三種方法都必須以相關(guān)的大型儀器平臺(tái)作為支撐，存在多種局限。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種SNP位點(diǎn)基因型分型的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中SNP位點(diǎn)基 因型分型技術(shù)假陽性高或復(fù)雜、價(jià)格昂貴的技術(shù)問題。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種SNP位點(diǎn)基因型分型的 方法。該方法包括以下步驟：S1，對(duì)目標(biāo)區(qū)域的DNA序列進(jìn)行克隆測(cè)序和多重比對(duì)，確定待 測(cè)SNP位點(diǎn)；S2，針對(duì)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引物的 3'末端對(duì)應(yīng)待測(cè)SNP位點(diǎn)，對(duì)對(duì)應(yīng)待測(cè)SNP位點(diǎn)的3'末端上的核苷酸進(jìn)行LNA修飾；S3， 采用PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中目的條帶的有無確定待 測(cè)樣本的SNP位點(diǎn)基因型。
[0007] 優(yōu)選地，步驟S3中采用PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增是在通過梯度實(shí) 驗(yàn)得到的最佳PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行的。
[0008] 優(yōu)選地，對(duì)PCR擴(kuò)增引物中的與模板雜交親和程度高的引物3'末端進(jìn)行LNA修 飾。
[0009] 優(yōu)選地，PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引物的3'末端倒數(shù)第一個(gè)或倒數(shù)第二 個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)待測(cè)SNP位點(diǎn)。
[0010] 優(yōu)選地，待測(cè)樣本為毛白楊，待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維素合酶基因5上，PCR擴(kuò)增引 物的堿基序列為 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 3 ;SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO: 2 的3'末端上的倒數(shù)第一個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。
[0011] 優(yōu)選地，待測(cè)樣本為毛白楊，待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維素合酶基因5上，PCR擴(kuò)增引 物的堿基序列為 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 ;SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 的3'末端上的倒數(shù)第一個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。
[0012] 優(yōu)選地，待測(cè)樣本為毛白楊，待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維素合酶基因8上，PCR擴(kuò)增引 物的堿基序列為 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 ;SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 的3'末端上的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。
[0013] 優(yōu)選地，PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性95°C 5min，變性95°C 30s，退火58?65°C 30s 或20s，延伸72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C 10min。
[0014] 優(yōu)選地，PCR 擴(kuò)增的體系為：20ng 基因組 DNA，0.8UTaq 酶，0.2mMdNTPs，10XPCR buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物，補(bǔ)充水至25 μ 1。
[0015] 由于錯(cuò)配現(xiàn)象的存在，普通的PCR擴(kuò)增引物與模板DNA鏈無法進(jìn)行完全正確的雜 交結(jié)合，也就意味著無法通過檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的有無來判斷靶位點(diǎn)的核苷酸類型。為了 解決這一技術(shù)問題，應(yīng)用鎖核酸修飾的技術(shù)手段，對(duì)引物組中的單堿基差異核苷酸進(jìn)行修 飾，在最佳的退火溫度和PCR反應(yīng)條件下，可以顯著地提高PCR擴(kuò)增引物與模板DNA鏈集合 的特異性，使其完全正確的遵循堿基配對(duì)原則進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以達(dá)到通過檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的 有無來判斷靶位點(diǎn)核苷酸類型的目的，實(shí)現(xiàn)待檢測(cè)SNP位點(diǎn)的基因型分型。也就是說，應(yīng)用 本發(fā)明的技術(shù)方案，采用鎖核酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以確定SNP位點(diǎn)的基因型，不僅增加了檢 測(cè)結(jié)果的精確性和可靠性，而且極大地提高了實(shí)驗(yàn)的靈活性，簡(jiǎn)化了配套條件并顯著地降 低了實(shí)驗(yàn)成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說明書附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0017] 圖1示出了實(shí)施例1中退火溫度梯度PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖，G :使用正向引物 C5SNP1GF和反向引物C5SNP1R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣泳道，T :使用正向引物C5SNP1TF和反 向引物C5SNP1R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣泳道。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0019] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中SNP位點(diǎn)基因型分型技術(shù)假陽性高或復(fù)雜、價(jià)格昂貴的技術(shù)問 題，本發(fā)明的發(fā)明人利用鎖核酸的特性改進(jìn)了 SNP位點(diǎn)基因型分型方法，對(duì)引物組中的引 物，僅在差異位點(diǎn)以相應(yīng)的鎖核酸取代對(duì)應(yīng)的普通核苷酸，合成特殊的鎖核酸引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)目的長(zhǎng)度片段是否存在來推斷差異位點(diǎn)的基因型類型，來取得可信的SNP 基因型檢測(cè)結(jié)果。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種SNP位點(diǎn)基因型分型的方法。該方法 包括以下步驟：S1，對(duì)目標(biāo)區(qū)域的DNA序列進(jìn)行克隆測(cè)序和多重比對(duì)，確定待測(cè)SNP位點(diǎn)； S2，針對(duì)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引物的3'末端對(duì)應(yīng) 待測(cè)SNP位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)待測(cè)SNP位點(diǎn)的3'末端上的核苷酸進(jìn)行LNA修飾；S3,采用PCR擴(kuò)增引 物對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中目的條帶的有無確定待測(cè)樣本的SNP位 點(diǎn)基因型。
[0021] 本發(fā)明的技術(shù)方案，可直接應(yīng)用于植物和微生物等個(gè)體或群體的SNP位點(diǎn)的基因 型檢測(cè)，而且理論方法清晰，研究群體位點(diǎn)數(shù)量不限，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作易 于掌握，過程方便快捷，結(jié)果精確可靠，價(jià)格優(yōu)勢(shì)明顯。
[0022] 在本發(fā)明的一種典型實(shí)施方式中，上述步驟S2具體包括，設(shè)計(jì)一組PCR引物，使其 中正向引物(或反向引物)的3'末端倒數(shù)第一個(gè)或倒數(shù)第二個(gè)堿基與待檢測(cè)SNP位點(diǎn)配對(duì)， 并在進(jìn)行引物合成時(shí)將此堿基所在的核苷酸的糖環(huán)進(jìn)行鎖核酸橋聯(lián)修飾（LNA修飾)。由于 待檢測(cè)位點(diǎn)一般有兩種基因型，所以要同時(shí)合成兩條LNA修飾的單堿基差異正向引物(或 反向引物）與相應(yīng)的基因型對(duì)應(yīng)，即引物中只有待檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的核苷酸有差異，其余核苷 酸序列不變。另一條反向引物(或正向引物）可依據(jù)常規(guī)引物設(shè)計(jì)法則進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，作為 共用引物與正向引物(或反向引物)搭配使用。由于進(jìn)行LNA修飾的那條引物的位置相對(duì)固 定，所以在確定是對(duì)正向引物還是對(duì)反向引物進(jìn)行LNA修飾時(shí)，可參考引物設(shè)計(jì)法則，選擇 最容易與DNA鏈雜交結(jié)合的一條引物進(jìn)行LNA修飾。一組引物中可以共有三條引物：兩條 LNA修飾的單堿基差異正向引物(或反向引物)，一條共用的常規(guī)反向引物(或正向引物)，可 以最多擴(kuò)增出兩條長(zhǎng)度相等的目的條帶。當(dāng)然，如果SNP位點(diǎn)有多種基因型，引物的設(shè)計(jì)也 隨之增多。
[0023] 優(yōu)選地，步驟S3中采用PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增是在通過梯度實(shí) 驗(yàn)得到的最佳PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行的，這樣可以提高基因型檢測(cè)的準(zhǔn)確度。
[0024] 在實(shí)際操作中，由于在發(fā)現(xiàn)和確定候選SNP位點(diǎn)時(shí)，部分個(gè)體的待檢測(cè)位點(diǎn)基因 型類型已經(jīng)明確，所以可在其中選擇幾個(gè)個(gè)體的DNA，作為梯度實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)PCR擴(kuò)增的模板 DNA，更好的找出最佳PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系。
[0025] 使用PCR擴(kuò)增引物對(duì)模板DNA進(jìn)行退火溫度梯度PCR擴(kuò)增，全部引物對(duì)與全部模 板DNA兩兩搭配，形成一個(gè)"反應(yīng)組合"，使用相同退火溫度，其中每個(gè)搭配(包含兩個(gè)相似 的PCR擴(kuò)增）都是一個(gè)"反應(yīng)單元"。退火溫度梯度數(shù)量與"反應(yīng)組合"數(shù)量相同。溫度范 圍的確定根據(jù)PCR擴(kuò)增儀的不同略有不同。其遵循的一般原則是以該組引物對(duì)應(yīng)的非LNA 修飾引物的退火溫度為最低溫度，向上以〇. 5°C或1°C為一個(gè)單位逐級(jí)遞增，上限一般不超 過72°C。其它PCR反應(yīng)條件暫時(shí)設(shè)定為常規(guī)PCR反應(yīng)的條件，當(dāng)擴(kuò)增結(jié)果不理想時(shí)再進(jìn)行 調(diào)整。
[0026] 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，每個(gè)"反應(yīng)單元"的兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物在相鄰的 泳道進(jìn)行點(diǎn)樣，以方便后續(xù)的亮度比較和結(jié)果統(tǒng)計(jì)，有目的條帶產(chǎn)生的反應(yīng)表示該LNA修 飾引物配對(duì)成功，即表示其所對(duì)應(yīng)的堿基類型存在；沒有目的條帶產(chǎn)生，即表示其所對(duì)應(yīng)的 堿基類型不存在。一個(gè)"反應(yīng)單元"（即使用一組引物)可以確定一個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。 其中，有兩條相同亮度的目的條帶出現(xiàn)表示該位點(diǎn)為雜合型，一條泳道中出現(xiàn)清晰明亮的 目的條帶而另一條泳道中沒有出現(xiàn)目的條帶表示該位點(diǎn)為純合型，并且可以根據(jù)目的條帶 所在的位置確定顯隱性純合類型。
[0027] 如果整個(gè)退火溫度梯度PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果都不理想，特別是純合基因類型的 電泳結(jié)果出現(xiàn)跳躍性，無法產(chǎn)生"一亮一無"的最佳結(jié)果，此時(shí)應(yīng)該縮小退火溫度梯度范圍， 在拐點(diǎn)結(jié)果所對(duì)應(yīng)的退火溫度周圍設(shè)定溫度梯度，并適當(dāng)減小單位變化溫度，重新進(jìn)行退 火溫度梯度PCR擴(kuò)增，直到確定出最佳退火溫度。在某些情況下，縮小溫度變化范圍和減 小單位變化溫度，依然得不到最佳的結(jié)果，在退火溫度較低時(shí)，純合基因型所對(duì)應(yīng)"反映單 元"的擴(kuò)增產(chǎn)物中，會(huì)出現(xiàn)一明一暗兩條目的條帶(暗條帶的出現(xiàn)會(huì)干擾結(jié)果的統(tǒng)計(jì))，而相 鄰的較高退火溫度的"反應(yīng)單元"中，兩條目的條帶都沒有出現(xiàn)(表明退火溫度已過高)。此 時(shí)，可以采取縮短退火步驟時(shí)間和（或）減少PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的措施，重新進(jìn)行退火溫度梯 度PCR擴(kuò)增，直到確定出最佳退火溫度。如果根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果依然無法確定最佳PCR擴(kuò)增條 件，就在結(jié)果相對(duì)理想的PCR擴(kuò)增條件基礎(chǔ)之上，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系（降低試劑和DNA模板 濃度)，使用touchdown PCR，并增加熱啟動(dòng)步驟等。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明一典型的實(shí)施方式，對(duì)PCR擴(kuò)增引物中的與模板雜交親和程度高的引 物3'末端進(jìn)行LNA修飾，以提高引物與模板結(jié)合的特異性，使其正確地按照堿基配對(duì)原則 進(jìn)行雜交擴(kuò)增。優(yōu)選地，PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引物的3'末端倒數(shù)第一個(gè)或倒 數(shù)第二個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)待測(cè)SNP位點(diǎn)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明一典型的實(shí)施方式，待測(cè)樣本為毛白楊，待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維素合 酶基因 5 上，PCR 擴(kuò)增引物的堿基序列為 SEQ ID N0:1 (C5SNP1TF:5'-CGTCTTTCTCACTACCTC CTT-3'），SEQIDN0:2(C5SNP1GF:5'-GTCTTTCTCACTACCTCCTG-3'^PSEQIDN0:3(C5SNP 1R:5'-AGCTTCTCTCTAACTCTCCACTT-3'）。SEQIDN0:1和SEQIDN0:2的3'末端上的倒數(shù) 第一個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性95°C 5min，變性95°C 30s，退火 62°C 30s，延伸72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C lOmin。PCR擴(kuò)增的體系為：20ng基因 組 DNA，0· 8UTaq 酶，0· 2mMdNTPs，10 XPCR buffer 以及 50ng 正向引物和 50ng 反向引物，補(bǔ) 充水至25 μ 1。
[0030] 在本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式中，待測(cè)樣本為毛白楊，待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維 素合酶基因5上，PCR擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID N0:4 (C5SNP14F:5'-GGACGAGGGGAA GATTCTG-3'）、SEQ ID N0:5 (C5SNP14GR:5'-ACACGAGAACGAGGGATGC-3，）和 SEQ ID N0:6 (C5SNP14AR:5'-ACACGAGGACGAGGGATGT-3'）。SEQIDN0:5和SEQIDN0:6的3'末端上的 倒數(shù)第一個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性95°C 5min，變性95°C 30s，退 火60°C 20s，延伸72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C lOmin。PCR擴(kuò)增的體系為：20ng基 因組 DNA，0. 8UTaq 酶，0. 2mMdNTPs，10XPCR buffer 以及 50ng 正向引物和 50ng 反向引物， 補(bǔ)充水至25 μ 1。
[0031] 在本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式中，待測(cè)樣本為毛白楊，待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維素 合酶基因8上，PCR擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID N0:7 (C8SNP13R:5' -TCATGGGCTTCACCTG CGC-3'）、SEQ ID N0:8 (C8SNP13CF:5'-GGTTGAGAGTTAGAGAAGCCG-3，）和 SEQ ID N0:9 (C8S NP13TF:5'-GGTTGAGAGTTAGAGAAGCTG-3'）。SEQIDN0:8和SEQIDN0:9的3'末端上的倒 數(shù)第二個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性95°C 5min，變性95°C 30s，退火 59°C 20s，延伸72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C lOmin。PCR擴(kuò)增的體系為：20ng基因 組 DNA，0. 8UTaq 酶，0· 2mMdNTPs，10XPCR buffer 以及 50ng 正向引物和 50ng 反向引物，補(bǔ) 充水至25 μ 1。
[0032] 下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 使用LNA修飾引物PCR擴(kuò)增的SNP分型技術(shù)，對(duì)毛白楊自然群體纖維素合酶基因5 中的SNPl (SNPl是指纖維素合酶基因5基因全長(zhǎng)的第23bp處，其所在區(qū)域的基因序列如 下：ATCGTCTTTCTCACTACCTCCTICAATCCACACTCTCTTTCTTTCTCTGT，斜體"Γ' 為 SNP 位點(diǎn)）位點(diǎn) 進(jìn)行基因型檢測(cè)。
[0035] 材料取自山東冠縣毛白楊基因庫(全國(guó)毛白楊種質(zhì)資源庫）中460株個(gè)體。
[0036] S1，提取每株個(gè)體的DNA后，按照地域分布，隨機(jī)挑選40株個(gè)體，逐一對(duì)其纖維素 合酶基因5進(jìn)行克隆測(cè)序，確定候選SNP位點(diǎn)。
[0037] S2,針對(duì)SNPl位點(diǎn)（黑體下劃線標(biāo)注)，整個(gè)自然群體包含兩種類型的DNA模板鏈， 其中模板鏈 1:3' -GCAGAAAGAGTGATGGAGGAANNNNNNNNNNNN-5'，模板鏈 II: 3' -GCAGAAAGAGTG ATGGAGGA￡NNNNNNNNNNNN-5'。對(duì)應(yīng)的基因型分別為T和G。選擇基因型分別為TT、TG和GG 的三株個(gè)體進(jìn)行退火溫度梯度PCR擴(kuò)增，以確定基因型檢測(cè)最佳PCR擴(kuò)增條件。
[0038] 設(shè)計(jì)合成兩條3'末端核苷酸LNA修飾（3'末端倒數(shù)第一個(gè)核苷酸）的正向引物： SEQ ID N0:1 (C5SNP1TF:5'-CGTCTTTCTCACTACCTCCTT-3'），SEQ ID N0:2 (C5SNP1GF:5'-GT CTTTCTCACTACCTCCTG-3'），一條常規(guī)反向引物 SEQ ID N0:3(C5SNP1R:5'-AGCTTCTCTCTAACT CTCCACTT-3'）。兩條LNA修飾正向引物分別與常規(guī)反向引物搭配使用，組成一組引物組。擴(kuò) 增產(chǎn)物目的片段長(zhǎng)度為396bp。
[0039] S3,將S2中所述三株個(gè)體的基因組DNA模板與所設(shè)計(jì)合成的引物組分別組合， 進(jìn)行退火溫度梯度PCR擴(kuò)增，退火溫度范圍設(shè)定為從58°C到65°C，單位變化溫度為TC。 其它反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C 5min，變性95°C 30s，退火30s，延伸72°C lmin，30個(gè)循環(huán)， 最后延伸72°C 10min，10°C保存。25μ 1反應(yīng)體系中包括：20ng基因組DNA，0.8UTaq酶， 0· 2mMdNTPs，IOxPCR buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物。
[0040] 將退火溫度梯度PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，每?jī)蓷l泳道檢測(cè)一株 個(gè)體的基因型，其中退火溫度為62°C時(shí)結(jié)果最佳(如圖1所示)。圖1中點(diǎn)樣孔上方，字母G 表示該泳道為使用正向引物C5SNP1GF和反向引物C5SNP1R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣泳道，字母 T表示該泳道為使用正向引物C5SNP1TF和反向引物C5SNP1R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣泳道，最 右側(cè)為DL2000Marker。根據(jù)目的片段的有無，可以確定三株個(gè)體的基因型分別為GG，GT和 TT，與已知結(jié)果一致?？梢詫?2°C作為最佳退火溫度，并結(jié)合5中所述其它反應(yīng)條件和反應(yīng) 體系，采用常規(guī)PCR擴(kuò)增的方法，使用4中所述LNA修飾引物組，對(duì)整個(gè)毛白楊自然群體進(jìn) 行SNP1位點(diǎn)的基因型檢測(cè)。
[0041] 在取自山東冠縣毛白楊基因庫中460株個(gè)體中，有187株個(gè)體基因型為GT，有229 株個(gè)體基因型為TT，有44株個(gè)體基因型為GG。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 使用LNA修飾引物PCR擴(kuò)增的SNP分型技術(shù)，對(duì)實(shí)施實(shí)例1中毛白楊自然群體纖維 素合酶基因5中的SNP14 (SNP14是纖維素合酶基因5基因全長(zhǎng)的第977bp處，其所在區(qū)域 的基因序列如下：CATAGGCTCAAAAGCATTGTCTCCCTATATGCTCTATTCAATGTCAGAAA，斜體"A" 為 SNP)位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)。
[0044] 實(shí)驗(yàn)材料及步驟參考實(shí)施實(shí)例1。
[0045] 根據(jù)待檢測(cè)位點(diǎn)和DNA模板鏈的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成一條常規(guī)正向引物：SEQ ID N0:4 (C5SNP14F:5'-GGACGAGGGGAAGATTCTG-3'），兩條 3' 末端核苷酸 LNA 修飾（3' 末端倒 數(shù)第一個(gè)核苷酸）的反向引物：SEQ ID N0:5 (C5SNP14GR:5'-ACACGAGAACGAGGGATGC-3'）， SEQ ID N0:6 (C5SNP14AR:5'-ACACGAGGACGAGGGATGT-3，），分別檢測(cè)基因型 G 和 A。擴(kuò)增產(chǎn) 物目的片段長(zhǎng)度為304bp。
[0046] 通過退火溫度梯度PCR擴(kuò)增，確定最佳退火溫度為60°C，退火步驟時(shí)間為20s，其 它條件與實(shí)施實(shí)例1中反應(yīng)條件和反應(yīng)體系一致。
[0047] 對(duì)毛白楊自然群體纖維素合酶基因5中的SNP14位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果為：有347 株個(gè)體基因型為AG，有89株個(gè)體基因型為AA，有24株個(gè)體基因型為GG。
[0048] 實(shí)施例3
[0049] 使用LNA修飾引物PCR擴(kuò)增的SNP分型技術(shù)，對(duì)實(shí)施實(shí)例1中毛白楊自然群 體纖維素合酶基因8中的SNP13 (SNP13是纖維素合酶基因8基因全長(zhǎng)的第546bp處， 其所在區(qū)域的基因序列如下：GATAAGAGGTTGCTTCTGAGGTTGAGAGTTAGAGAAGCIGACGCTTCGA TGCTCTCTGTATGATTAGGG，斜體"I"為SNP)位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)。
[0050] 實(shí)驗(yàn)材料及步驟參考實(shí)施實(shí)例1。
[0051] 根據(jù)待檢測(cè)位點(diǎn)和DNA模板鏈的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成一條常規(guī)反向引物：SEQ ID N0:7 (C8SNP13R:5'-TCATGGGCTTCACCTGCGC-3'），兩條 3' 末端核苷酸 LNA 修飾（3' 末端倒 數(shù)第二個(gè)核苷酸)的正向引物：SEQ ID N0:8(C8SNP13CF:5'-GGTTGAGAGTTAGAGAAGCCG-3'）， SEQIDN0:9(C8SNP13TF:5'-GGTTGAGAGTTAGAGAAGCTG-3'），分別檢測(cè)基因型C和T。擴(kuò)增 產(chǎn)物目的片段長(zhǎng)度為390bp。
[0052] 通過退火溫度梯度PCR擴(kuò)增，確定最佳退火溫度為59°C，退火步驟時(shí)間為20s，其 它條件與實(shí)施實(shí)例1中反應(yīng)條件和反應(yīng)體系一致。
[0053] 對(duì)毛白楊自然群體纖維素合酶基因8中的SNP13位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果為：有237 株個(gè)體基因型為CT，有136株個(gè)體基因型為CC，有107株個(gè)體基因型為TT。
[0054] 從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明的技術(shù)方案：首先，設(shè)計(jì)一組正反向PCR引物， 使待檢測(cè)SNP位點(diǎn)與此對(duì)引物中的正向引物或反向引物的3'末端(倒數(shù)第一個(gè)或倒數(shù)第二 個(gè)堿基)配對(duì)，并將該3'末端核苷酸用鎖核酸替換(鎖核酸橋聯(lián)修飾)。然后，使用此對(duì)鎖核 酸引物，對(duì)所研究群體中已確定待檢測(cè)位點(diǎn)基因型的個(gè)體進(jìn)行退火溫度梯度PCR，并確定退 火溫度、退火時(shí)間、循環(huán)數(shù)等其它PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。然后選擇與已知基因型結(jié)果一 致的反應(yīng)條件對(duì)整個(gè)群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳檢查并統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以確 定群體中所有個(gè)體的基因型類型。
[0055] 應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，采用鎖核酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以確定SNP位點(diǎn)的基因型， 不僅增加了檢測(cè)結(jié)果的精確性和可靠性，而且極大地提高了實(shí)驗(yàn)的靈活性，簡(jiǎn)化了配套條 件并顯著地降低了實(shí)驗(yàn)成本。
[0056] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0057]
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種SNP位點(diǎn)基因型分型的方法，其特征在于，包括以下步驟： S1，對(duì)目標(biāo)區(qū)域的DNA序列進(jìn)行克隆測(cè)序和多重比對(duì)，確定待測(cè)SNP位點(diǎn)； S2，針對(duì)所述SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，所述PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引物 的3'末端對(duì)應(yīng)所述待測(cè)SNP位點(diǎn)，將對(duì)應(yīng)所述待測(cè)SNP位點(diǎn)的所述3'末端上的核苷酸進(jìn) 行LNA修飾； S3,采用所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中目的條帶的 有無確定所述待測(cè)樣本的SNP位點(diǎn)基因型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中采用所述PCR擴(kuò)增引物對(duì) 待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增是在通過梯度實(shí)驗(yàn)得到的最佳PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行 的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)PCR擴(kuò)增引物中的與模板雜交親和程度 高的引物3'末端進(jìn)行LNA修飾。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引 物的3'末端倒數(shù)第一個(gè)或倒數(shù)第二個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)所述待測(cè)SNP位點(diǎn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本為毛白楊，所述待測(cè)SNP位 點(diǎn)位于纖維素合酶基因5上，所述PCR擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 和SEQ ID NO:3,所述SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的3'末端上的倒數(shù)第一個(gè)核苷酸進(jìn)行 LNA修飾。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本為毛白楊，所述待測(cè)SNP位 點(diǎn)位于纖維素合酶基因5上，所述PCR擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5 和SEQ ID NO:6;所述SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6的3'末端上的倒數(shù)第一個(gè)核苷酸進(jìn)行 LNA修飾。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本為毛白楊，所述待測(cè)SNP位 點(diǎn)位于纖維素合酶基因8上，所述PCR擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 和SEQ ID N0:9;所述SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9的3'末端上的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸進(jìn)行 LNA修飾。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù) 變性95°C 5min，變性95°C 30s，退火58?65°C 30s或20s，延伸72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后 延伸 72°C lOmin。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的體系為： 20ng 基因組 DNA，0.8UTaq 酶，0.2mM dNTPs，10XPCR buffer 以及 50ng 正向引物和 50ng 反 向引物，補(bǔ)充水至25 μ 1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293896SQ201310298870
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】張德強(qiáng), 徐煲鏵, 杜慶章 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)