霍山石斛的葉綠體基因組及種質(zhì)鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及霍山石斛葉綠體基因組及利用其對(duì)霍山石斛近緣物種的種質(zhì)鑒定方法?；羯绞~綠體基因組序列為：Seq?ID?NO.1。基于霍山石斛葉綠體基因組對(duì)其與近緣物種的鑒定方法主要步驟為：霍山石斛及其近緣物種的DNA提取，利用基于霍山石斛葉綠體基因組特異性片段設(shè)計(jì)的引物A，B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此PCR擴(kuò)增可以特異性擴(kuò)增出霍山石斛葉綠體基因序列，具有快速鑒別霍山石斛的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】霍山石斛的葉綠體基因組及種質(zhì)鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及霍山石斛葉綠體基因組及利用其對(duì)霍山石斛近緣物種的種質(zhì)鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]霍山石斛又稱米斛，是蘭科石斛屬植物，主產(chǎn)于大別山區(qū)的安徽省霍山縣，屬于含有粘多糖為主的一種藥用石斛，最早見載于清代趙學(xué)敏《本草鋼目拾遺》，距今有200年以上歷史。該書記載稱:“霍石斛出江淮霍山，形似釵斛細(xì)小，色黃而形曲不直，有成球者，彼土人以代茶茗.，霍石斛嚼之微有漿、黏齒、味甘、微咸，形縮為真?！?br> [0003]霍山石斛以其嚼之無(wú)味，粘牙，無(wú)渣，有特殊療效，而被譽(yù)為中華仙草之最，但其資源極度匱乏，是國(guó)家瀕臨滅絕的珍惜藥材，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)長(zhǎng)期以來(lái)有價(jià)無(wú)市。然而目前對(duì)它的理論研究還較少，同時(shí)市場(chǎng)上冠以“霍山石斛”類的楓斗產(chǎn)品大多并非霍山石斛，因此對(duì)于霍山石斛的理論研究及其與近緣物種的種植鑒定成為了當(dāng)務(wù)之急。
[0004]葉綠體是植物進(jìn)行光合作用特有的細(xì)胞器，為植物提供能量的主要來(lái)源，葉綠體擁有自己的基因組。完整的葉綠體基因組一般包含四個(gè)部分，大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSR)和兩段反向重復(fù)區(qū)(IR)。葉綠體基因組的進(jìn)化速率在核基因組和線粒體基因組的進(jìn)化速率之間。早期的葉綠體基因組測(cè)序比較復(fù)雜，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為葉綠體基因組的研究提供了很大的便利。
[0005]葉綠體基因組是追溯葉綠體起源與演化歷程的重要信息來(lái)源。通過(guò)比較進(jìn)化基因組學(xué)分析，一方面，可以幫助確定葉綠體基因組與現(xiàn)在哪類藍(lán)藻的親緣關(guān)系最接近，從而推測(cè)歷史上內(nèi)共生發(fā)生的條件和可能的過(guò)程；另一方面可以確定在葉綠體演化過(guò)程中，哪些基因發(fā)生了丟失，哪些基因轉(zhuǎn)移到了核基因組，推斷基因丟失和轉(zhuǎn)移的根源。
[0006]葉綠體基因組分析是解決植物系統(tǒng)發(fā)育難題的重要途徑。葉綠體基因組可以提供基因組結(jié)構(gòu)和DNA序列兩個(gè)層次的數(shù)據(jù)用于系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)某些疑難系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題的解決提供了關(guān)鍵的證據(jù)。
[0007]葉綠體基因組還可以用來(lái)為物種鑒定提供重要理論依據(jù)。通過(guò)對(duì)相近物種的葉綠體基因組比較，尋找到變異較高的區(qū)域，設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)不同物種進(jìn)行快速鑒定。
[0008]因此，對(duì)霍山石斛葉綠體基因組的序列測(cè)定，不僅可以為其起源與演化、系統(tǒng)發(fā)育地位的研究提供幫助，還可以為霍山石斛與其近緣物種的種質(zhì)鑒定提供重要的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]珍惜中草藥霍山石斛的理論研究及其與近緣物種有效快速的種質(zhì)鑒定亟需展開，為了為其理論研究和種質(zhì)鑒定提供有利的理論依據(jù)，本發(fā)明提供了霍山石斛的葉綠體基因組及利用其對(duì)霍山石斛近緣物種的種質(zhì)鑒定方法。
[0010]本發(fā)明所涉及的有霍山石解葉綠體基因組序列Seq ID N0.1和基于葉綠體基因組對(duì)霍山石斛近緣物種的種質(zhì)鑒定方法。
[0011]霍山石斛葉綠體基因組，其序列如Seq ID N0.1所示。本發(fā)明還公開了基于上述葉綠體基因組對(duì)霍山石斛近緣物種的種質(zhì)鑒定方法，具體操作，包括以下步驟:
[0012](I)新鮮材料DNA提取:液氮充分研磨材料，利用CTAB法提取霍山石斛及其近緣物種DNA。
[0013](2)以Seq ID N0.3和4的序列為引物，利用所提取的DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增PCR擴(kuò)增；得到如Seq ID N0.2所示擴(kuò)增產(chǎn)物的，為霍山石斛。
[0014]3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系特征為:制備20ulPCR反應(yīng)體系，在200ulPCR管中加入如下量的物質(zhì)=Taq酶0.2ul，dNTP 1.4ul，Mg2+1.4ul，10XPCR Buffer2.0ul，引物 2uM 各 2ul，已提取的 DNA+水共 Ilul ；
[0015]擴(kuò)增程序條件為:95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性45秒，60°C退火I分鐘，68°C延伸4分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)25次，最后再72°C充分延伸7分鐘。
[0016]具體的PCR過(guò)程為:利用所提取的DNA為模板,在Veriti? 96-Well Thermal Cycler型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增PCR擴(kuò)增；
[0017]反應(yīng)體系特征為:制備20ulPCR反應(yīng)體系，在200ulPCR管中加入如下量的物質(zhì):Taq 酶 0.2ul, dNTP 1.4ul, Mg2+1.4ul, 10XPCR Buffer2.0ul，引物 A, B (2uM)各 2ul,已提取的DNA+水共llul。
[0018]引物A ACT AAGTGCTCTGACCATGCATCGG (Seq_ID N0.3)
[0019]引物B CATCAACGATCATTGACTGATTTATCAA (Seq_ID N0.4)
[0020]擴(kuò)增程序條件為:95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性45秒，60°C退火I分鐘，68°C延伸4分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)25次，最后再72°C充分延伸7分鐘。
[0021]此PCR擴(kuò)增可以特異性擴(kuò)增出霍山石斛葉綠體基因序列，具有快速鑒別霍山石斛的特點(diǎn)。擴(kuò)增出的序列如序列表Seq_ID N0.2所示。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)勢(shì):
[0023]霍山石斛為我國(guó)特有瀕危珍稀中藥材，霍山石斛因其質(zhì)量上乘而馳名中外，多年來(lái)市場(chǎng)上霍山石斛有名無(wú)實(shí)，有價(jià)無(wú)市，資源接近枯竭。然而目前對(duì)于霍山石斛的理論研究及保護(hù)研究仍然較少，本發(fā)明對(duì)霍山石斛葉綠體基因組的測(cè)序，可以為其起源與演化、系統(tǒng)發(fā)育地位的研究提供幫助。
[0024]現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上，凡冠以“霍山石斛”、“霍斗”或“野生金霍斛”等名稱的一些楓斗產(chǎn)品，均非用真正的霍山石斛加工而成，多數(shù)是銅皮石斛、鐵皮石斛、扁黃草石斛和鉤狀石斛的仿冒品，因此對(duì)霍山石斛的種質(zhì)鑒定顯得尤為重要。然而目前對(duì)于霍山石斛的鑒定主要停留在使用一些分子標(biāo)記或是構(gòu)建一些指紋圖譜的鑒定方法，這類方法鑒定起來(lái)速度較為緩慢。而本發(fā)明基于葉綠體基因組序列，尋找到霍山石斛葉綠體基因組中特異性片段，基于此片段設(shè)計(jì)特異性引物，可以特異性的擴(kuò)增出霍山石斛葉綠體基因組序列，從而達(dá)到快速鑒別的目的。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是霍山石斛鑒定PCR后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后結(jié)果
[0026]注:Marker為Takara公司生產(chǎn)的DL2, 000DNA Marker,從上至下片段大小依次為:2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp其中擴(kuò)增出條帶的4種石斛分別為:金釵石斛(13-15)、霍山石斛(19-21)、細(xì)莖石斛(22-24)以及鐵皮石斛(25-26)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明中對(duì)霍山石斛的鑒定。
[0028]實(shí)施例一
[0029]目前市場(chǎng)上霍山石斛的混偽品主要為霍山當(dāng)?shù)禺a(chǎn)的細(xì)莖石斛、鐵皮石斛為主，因此本實(shí)驗(yàn)主要選取霍山石斛、細(xì)莖石斛、鐵皮石斛以及其它6種石斛品種(金釵石斛、齒瓣石斛、粉花石斛、球花石斛、細(xì)葉石斛和曲莖石斛)提取DNA，并利用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性引物A、B和PCR擴(kuò)增方法對(duì)9種石斛進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0030]擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，結(jié)果如圖1所示，霍山石斛通過(guò)擴(kuò)增后跑膠其大小約為2200bp左右(測(cè)序結(jié)果為Seq_ID N0.2)，金釵石斛片段大小為750bp左右，細(xì)莖石斛片段大小為IOOObp左右，鐵皮石斛片段大小為2000bp左右。因此可以通過(guò)片段大小來(lái)鑒定是否為霍山 石斛。
【權(quán)利要求】
1.霍山石斛的葉綠體基因組，其特征在于:其序列如SeqID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的霍山石斛近緣物種的種質(zhì)鑒定方法，其特征在于: (1)提取待檢樣品的DNA:液氮充分研磨待檢的新鮮樣品，用CTAB法提取物種DNA ； (2)以SeqID N0.3和4的序列為引物，利用所提取的DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增PCR擴(kuò)增；得到如Seq ID N0.2所示擴(kuò)增產(chǎn)物的，為霍山石斛。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系特征為:制備20ulPCR反應(yīng)體系，在 200ulPCR 管中加入如下量的物質(zhì)=Taq 酶 0.2ul，dNTP 1.4ul，Mg2+1.4ul，IOXPCRBuffer2.0ul，引物 2uM 各 2ul，已提取的 DNA+水共 Ilul ； 擴(kuò)增程序條件為:95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性45秒，60°C退火I分鐘，68°C延伸4分鐘，變性、退火、延伸三 個(gè)步驟循環(huán)25次，最后再72°C充分延伸7分鐘。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468709SQ201310299386
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】丁小余, 牛志韜 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)