一種受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子a及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A及其重組表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明的受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的用于黃嘌呤誘導(dǎo)的DNA片段，包括上述受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A、調(diào)控蛋白HucR的編碼基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgfU的編碼基因、驅(qū)動(dòng)調(diào)控蛋白HucR的編碼基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgfU的編碼基因表達(dá)的啟動(dòng)子CP6以及紅色熒光蛋白基因，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明通過(guò)改造大腸桿菌lac啟動(dòng)子-35區(qū)和-10區(qū)，得到一個(gè)新的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可在調(diào)控蛋白HucR和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgfU的配合下，利用黃嘌呤誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。
【專利說(shuō)明】-種受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A 及其重組表達(dá)載體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在合成生物學(xué)蓬勃發(fā)展的今天，研發(fā)受不同類型誘導(dǎo)物開(kāi)啟的調(diào)控元件，靈敏、 實(shí)時(shí)地調(diào)節(jié)代謝流，有助于設(shè)計(jì)合理有效的代謝通路，對(duì)最終目的產(chǎn)物的高效合成具有重 要意義。如Keasling等人通過(guò)設(shè)計(jì)大腸桿菌脂肪酸代謝中間關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元 件而構(gòu)建的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)感應(yīng)系統(tǒng)（Dynamic sensor-regulator system, DSRS)，最終將脂肪 酸轉(zhuǎn)化生成生物柴油的生產(chǎn)能力提高了 3倍（Design of a dynamic sensor-regulator system for production of chemicals and fuels derived from fatty acids， Nature Biotechnology，2012)。
[0003] 大腸桿菌的乳糖操縱子作為經(jīng)典的啟動(dòng)子元件已被深入研究。許多啟動(dòng)子的構(gòu)建 都是在乳糖操縱系統(tǒng)的功能元件上改造而成。如tac啟動(dòng)子和trc啟動(dòng)子，均由色氨酸啟 動(dòng)子的-35區(qū)和Iac啟動(dòng)子的-10區(qū)組合拼接而成，改造后的啟動(dòng)子較之Iac啟動(dòng)子具有 更高的表達(dá)效率。而T7啟動(dòng)子則利用安慰誘導(dǎo)物異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG) 來(lái)調(diào)控T7RNA聚合酶的表達(dá)，進(jìn)而開(kāi)啟Τ7啟動(dòng)子系統(tǒng)表達(dá)下游重組蛋白；這一技術(shù)已被 Novagen等公司研發(fā)出系列商業(yè)化載體，作為異源蛋白的高表達(dá)載體。
[0004] 具強(qiáng)耐福射特性的極端微生物耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的基因組 分析揭示了該菌抗逆特性相關(guān)的部分功能組件。其中，對(duì)編碼區(qū)drll59編碼的調(diào)控蛋白 (hypothetical uricase regulator, HucR)的研究顯示，HucR可通過(guò)形成蛋白二聚體的形 式，既能結(jié)合于其自身編碼序列的啟動(dòng)子區(qū)域，也能結(jié)合于與其自身編碼序列方向相反的 尿酸酶編碼序列的啟動(dòng)子區(qū)域（hucO);當(dāng)與尿酸或黃嘌呤結(jié)合后，HucR蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化， 從DNA結(jié)合位點(diǎn)解離，從而開(kāi)啟下游基因的表達(dá)；因此，HucR調(diào)控系統(tǒng)成為耐輻射球菌根據(jù) 環(huán)境情況變化，有效調(diào)控HucR蛋白本身及改善外界脅迫環(huán)境的系統(tǒng)。其中，黃嘌呤是嘌呤 代謝、咖啡因等生物堿代謝及微生物應(yīng)對(duì)外界脅迫環(huán)境的中間代謝產(chǎn)物的節(jié)點(diǎn)。因此，設(shè)計(jì) 對(duì)黃嘌呤含量有效靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)有助于設(shè)計(jì)生物合成(尤其是微生物合成）嘌呤類藥物、 生物堿等代謝通路，有助于構(gòu)建上述代謝通路中關(guān)鍵酶的高通量篩選方法，有助于微生物 快速靈敏的對(duì)外界脅迫環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于黃嘌呤誘導(dǎo)的DNA片段。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供一種用于黃嘌呤誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的重組表達(dá)載體。
[0008] 本發(fā)明的再一目的是提供包括上述重組表達(dá)載體的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是提供一種受黃嘌呤誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0010] 本發(fā)明的再一目的是提供上述啟動(dòng)子A、DNA片段、重組表達(dá)載體、重組菌株或轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞系的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示：
[0012] tttacatagg tagacatcta agtatatgtt gtgtggaacc gatttaataa aacaattt 58
[0013] 本發(fā)明的用于黃嘌呤誘導(dǎo)的DNA片段，其中，所述DNA片段包括權(quán)利要求1所述的 受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A、調(diào)控蛋白HucR的編碼基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgfU的編碼基因、驅(qū)動(dòng)調(diào)控 蛋白HucR的編碼基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgfU的編碼基因表達(dá)的啟動(dòng)子CP6以及紅色熒光蛋白基 因，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A，其特征在于，所述啟動(dòng)子A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種用于黃嘌呤誘導(dǎo)的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包括權(quán)利要求1所述的 受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A、調(diào)控蛋白HucR的編碼基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgfU的編碼基因、驅(qū)動(dòng)調(diào)控 蛋白HucR的編碼基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgfU的編碼基因表達(dá)的啟動(dòng)子CP6以及紅色熒光蛋白基 因，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -種用于黃嘌呤誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的重組表達(dá)載體，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述 的啟動(dòng)子A。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒SHY，包括 權(quán)利要求2所述的DNA片段，所述質(zhì)粒SHY的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
5. 包含權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體的重組菌株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌。
7. -種受黃嘌呤誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的 受黃嘌呤調(diào)控的啟動(dòng)子A。
8. -種受黃嘌呤誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的方法，包括以下步驟： 1) 將目的蛋白的編碼基因通過(guò)權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，得 到重組菌； 2) 在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中發(fā)酵上述重組菌，實(shí)現(xiàn)黃嘌呤誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。
9. 權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子A在黃嘌呤誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)或黃嘌呤生物型檢測(cè)中的應(yīng) 用。
10. 權(quán)利要求2所述DNA片段在黃嘌呤誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)或黃嘌呤生物型檢測(cè)中的應(yīng) 用。
11. 權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體在黃嘌呤誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)或黃嘌呤生物型檢 測(cè)中的應(yīng)用。
12. 權(quán)利要求5或6所述重組菌株在黃嘌呤誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)或黃嘌呤生物型檢測(cè)中 的應(yīng)用。
13. 權(quán)利要求7所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在黃嘌呤誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)或黃嘌呤生物型檢測(cè)中 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104278031SQ201310300305
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】梁朝寧, 邢建民 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所