穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒e2蛋白的重組細(xì)胞系及其在制備豬瘟亞單位疫苗和診斷試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系及其在制備豬瘟亞單位疫苗與診斷試劑中的應(yīng)用。具體地，表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白重組細(xì)胞系為BCSFV-E2，該細(xì)胞系保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC?No.7719。采用本發(fā)明所述的重組細(xì)胞系制備得到的豬瘟亞單位疫苗安全性高，免疫效果好，容易大規(guī)模生產(chǎn)，不易受外源病毒污染或抗體影響，對豬免疫不受母源抗體影響，而且本發(fā)明的豬瘟亞單位疫苗免疫豬后能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平豬瘟病毒中和抗體。此外，本發(fā)明還公開了一種構(gòu)建重組哺乳動物細(xì)胞系的方法及制備豬瘟亞單位疫苗的方法，以及該重組細(xì)胞系表達(dá)的抗原在制備預(yù)防豬瘟疫苗及診斷試劑中的應(yīng)用。
【專利說明】穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系及其在制備豬瘟亞單位疫苗和診斷試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系及其在制備豬瘟亞單位疫苗和診斷試劑中的應(yīng)用，具體地，本發(fā)明涉及的重組細(xì)胞系是BCSFV-E2，其保藏編號為=CGMCC N0.7719。本發(fā)明還公開了制備所述重組細(xì)胞系的方法和該重組細(xì)胞系在制備預(yù)防豬瘟疫苗以及在制備診斷或檢測豬瘟病毒感染試劑中的應(yīng)用。屬于動物疫苗與獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]豬痕(Classicalswine fever, CSF)又稱豬霍亂(Hog cholera, HC)是由豬痕病毒(Hog Cholera virus, HCV 或 Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種急性熱性致死性疾病，豬瘟具有高度接觸傳染性，流行廣泛，發(fā)病與死亡率高，危害極大。國際獸疫局(OIE)以前將其定為A類傳染病，現(xiàn)將期列為通報(bào)疫病，我國將其列為一類動物疫病。
[0003]豬瘟在世界范圍內(nèi)都有發(fā)病流行，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。目前對該病的有效預(yù)防措施為疫苗免疫。其中由中國科學(xué)家研究成功的豬瘟弱毒疫苗(C株)對世界范圍內(nèi)豬瘟防控發(fā)揮了卓著貢獻(xiàn)。該疫苗目前仍被我國等多個(gè)國家使用。而且在此弱毒疫苗株的基礎(chǔ)上開發(fā)出了乳兔苗，免脾淋苗，原代細(xì)胞苗及傳代細(xì)胞苗等多種形式的弱毒疫苗。但組織苗的生產(chǎn)需要大量健康動物，生產(chǎn)過程中人工勞動強(qiáng)度大，成本高，有接種副反應(yīng)等等這些不利因素影響了此類疫苗的實(shí)際應(yīng)用。而以培養(yǎng)細(xì)胞繁殖弱毒生產(chǎn)疫苗同樣也受到諸多因素困擾，如細(xì)胞培養(yǎng)用血清中BVDV及抗體會干擾病毒生長，病毒抗原滴度難以提高，弱毒疫苗需要全程冷鏈保藏等等均導(dǎo)致弱毒疫苗的最終使用效果受到影響。而且所有弱毒疫苗在實(shí)際合用過程中均易受母源抗體影響，這也是導(dǎo)致免疫失敗的因素之一。
`[0004]CSFV為有囊膜病毒，病毒粒子大小約為40-60nm。病毒基因組為單股正鏈RNA，長約12.3kb，含一個(gè)大的開放性閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)大的多聚蛋白含3898個(gè)氨基酸殘基，分子量約為438kDa。多聚蛋白在翻譯的同時(shí)和翻譯后經(jīng)病毒和宿主細(xì)胞的蛋白酶加工成12種成熟的病毒蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白有C、E0、El和E2蛋白。E2蛋白為CSFV的一種重要的囊膜糖蛋白，又稱為gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的中和抗體，是豬瘟病毒主要的免疫保護(hù)性抗原。也是研究豬瘟基因工程疫苗是重要靶蛋白。鑒于現(xiàn)有豬瘟疫苗的種種缺陷與不足，以及隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)與細(xì)胞生物工程技術(shù)的發(fā)展，許多科研人員試圖以現(xiàn)代分子生物學(xué)手段研制出可以克服現(xiàn)有疫苗缺陷的新型豬瘟疫苗。這些新型的豬瘟疫苗有病毒活載體疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗，大腸桿菌表達(dá)蛋白的亞單位疫苗，昆蟲桿狀病毒表達(dá)的E2蛋白亞單疫苗。其中至目前得到應(yīng)用的有歐洲科研人員研制的以昆蟲桿狀病毒表達(dá)的E2蛋白亞單位疫苗，該疫苗免疫不受母源抗體影響，而且可以與病毒感染進(jìn)行抗體檢測鑒別診斷。如Hulst[Hulst, et al.Cytotechnology, 20 (1-3): 271-277]用20 μ g昆蟲細(xì)胞表達(dá)的E2雙相油包水乳劑免疫豬，能抵抗100LD50CSFV Brescia毒株強(qiáng)毒的攻擊。該疫苗已于上世紀(jì)九十年代在歐洲批準(zhǔn)上市，在歐洲國家的豬瘟根除計(jì)劃中發(fā)揮了重要作用。但該疫苗是通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的，該表達(dá)系統(tǒng)相對原核表達(dá)系統(tǒng)而言，蛋白表達(dá)后可以在一定程度上進(jìn)行翻譯后加工與修飾。但與病毒天然抗原蛋白結(jié)構(gòu)仍有一定差異，蛋白表達(dá)后折疊與修飾不如哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。而且該系統(tǒng)生產(chǎn)制備抗原時(shí)，細(xì)胞經(jīng)病毒感染后細(xì)胞會裂解與死亡，對下游純化等生產(chǎn)工藝增加難度。
[0005]本研究組在本發(fā)明中探索了不同表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白，并最終找到合適表達(dá)細(xì)胞系，克服了表達(dá)豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白對細(xì)胞毒性作用，以及建立了大規(guī)模篩選等技術(shù)。結(jié)果成功制備了表達(dá)豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E2蛋白細(xì)胞系。該細(xì)胞系表達(dá)E2蛋白表達(dá)量高，易于純化，培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白可以連續(xù)收獲，易于生產(chǎn)。表達(dá)的E2蛋白抗原能對免疫豬誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。該細(xì)胞系表達(dá)抗原所制備的疫苗可為豬瘟的預(yù)防提供新型、高效的預(yù)防制劑。對我國乃至世界范圍內(nèi)豬瘟的預(yù)防控制可以發(fā)揮重要作用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種安全，高效的豬瘟亞單位疫苗。
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供一種穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系。
[0008]本發(fā)明的目的之三是提供一種構(gòu)建上述穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系的方法。
[0009]本發(fā)明的目的之四是將所述的表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系應(yīng)用于制備疫苗以預(yù)防豬瘟，或者將其用于制備成診斷或檢測豬瘟病毒感染的試劑。
[0010]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0011]本發(fā)明的一種豬瘟亞單位疫苗，其特征在于含有經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的豬瘟病毒E2蛋白及佐劑。
[0012]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系是由以下方法構(gòu)建得到:
[0013](I)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，該真核表達(dá)質(zhì)粒包括其中插入編碼豬瘟病毒E2蛋白的基因序列；
[0014](2)將所述真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞；
[0015](3)經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以添加了 G418的培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)；
[0016](4)將經(jīng)選擇培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行稀釋克隆，收獲克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液與細(xì)胞，檢測并比較豬瘟病毒E2蛋白表達(dá)量，獲得穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系。
[0017]其中，更優(yōu)選的，所述豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述編碼豬瘟病毒E2蛋白的基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0018]按照上述方法，本發(fā)明得到了一株能夠穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系，命名為BCSFV-E2，分類命名為幼倉鼠腎細(xì)胞(Baby hamster kidney cell)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC N0.7719，保藏時(shí)間為2013年6月18日。
[0019]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的重組哺乳動物細(xì)胞系或其培養(yǎng)物在制備預(yù)防豬瘟病毒病疫苗藥物中的應(yīng)用。及
[0020]所述的重組哺乳動物細(xì)胞系或其培養(yǎng)物在制備診斷或檢測豬瘟病毒感染試劑中的應(yīng)用。
[0021]更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種制備豬瘟亞單位疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0022](I)將本發(fā)明所述的重組哺乳動物細(xì)胞系BCSFV-E2正常傳代后長至90%滿時(shí)，換血清含量為I~2%的低血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4-6d ；
[0023](2)收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液存于4°C，細(xì)胞上清液經(jīng)截留分子量為50kD超濾濃縮至E2抗原ELISA效價(jià)為1:160至1:320后，加入終濃度為0.02%硫柳汞，得到疫苗抗原液；
[0024](3)疫苗抗原液與佐劑按重量比為1:1進(jìn)行混合并充分乳化，制備水包油包水型疫苗。
[0025]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的佐劑為MONTANIDE ISA206VG。
[0026]本發(fā)明制備的穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系，容易培養(yǎng)，增殖快速，可無限擴(kuò)大，性質(zhì)穩(wěn)定，蛋白表達(dá)量高，表達(dá)蛋白與佐劑制備成疫苗后免疫豬能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)豬瘟病毒中和抗體，可抵抗豬瘟病毒感染。
[0027]本發(fā)明的有益效果如下:
[0028]1.將本發(fā)明的表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞培養(yǎng)物制備疫苗可以誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生針對CSFV的高效價(jià)中和抗體，并能夠在體內(nèi)或體外中和CSFV，阻止病毒感染動物機(jī)體。
[0029]2.本發(fā)明所選用的表達(dá)系統(tǒng)為BHK-21細(xì)胞，得到的重組細(xì)胞系BCSFV-E2具有與親本細(xì)胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的規(guī)模生產(chǎn)；重組細(xì)胞系抗原表位量高，表達(dá)蛋白在表達(dá)細(xì)胞內(nèi)能得到接近病毒蛋白的天然構(gòu)象與修飾加工，抗原性好；重組細(xì)胞可以懸浮培養(yǎng)，高密度發(fā)酵培養(yǎng)，易于大量生產(chǎn)。
[0030]3.本發(fā)明的重組表達(dá)細(xì)胞系可以利用無血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)，可以降低抗原或疫苗生產(chǎn)成本。
[0031]4.本發(fā)明對抗原蛋白基因進(jìn)行了基因密碼子優(yōu)化，有利于提高抗原表達(dá)量。
[0032]5.利用本發(fā)明的重組表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)物制備的油佐劑疫苗能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的病毒中和抗體，抗體持續(xù)時(shí)間長，能對免疫動物提供長久的有效的免疫保護(hù)。
[0033]6.利用本發(fā)明重組細(xì)胞系表達(dá)抗原制備的疫苗免疫動物不產(chǎn)生豬瘟病毒EO蛋白抗體以及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，可以利用檢測豬瘟病毒EO蛋白抗體或非結(jié)構(gòu)蛋白抗體來對疫苗免疫與病毒感染動物進(jìn)行鑒別。
[0034]7.本發(fā)明所制備的豬瘟疫苗不含病毒核酸，不能復(fù)制，無致病性，具有極高的生物安全性，疫苗免疫不受母源抗體或已經(jīng)存在抗體干擾與影響。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；
[0036]圖2為轉(zhuǎn)染后不同克隆細(xì)胞表達(dá)E2蛋白ELISA檢測；
[0037]圖3為篩選克隆細(xì)胞系不同代次細(xì)胞表達(dá)E2蛋白ELISA檢測；
[0038]圖4為重組細(xì)胞系表達(dá)CSFV E2蛋白IFA檢測；
[0039]A，克隆細(xì)胞第5代；B，克隆細(xì)胞第25代；C，正常BHK-21細(xì)胞對照；
[0040]圖5為免疫豬血清豬瘟病毒ELISA抗體檢測；[0041]圖6為重組細(xì)胞系表達(dá)E2蛋白為抗原間接ELISA檢測豬血清中豬瘟病毒抗體結(jié)果O
【具體實(shí)施方式】
[0042]下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0043]實(shí)施例1穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系的構(gòu)建及檢測
[0044]I材料與方法
[0045]1.1質(zhì)粒，菌株與細(xì)胞
[0046]真核表達(dá)載體質(zhì)粒pCAG-neo、DH5 α感受態(tài)細(xì)胞和ΒΗΚ-21細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒提取試劑盒和RNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品，DNA凝膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司，G418購自Gibco 公司，膜酶購自 Hyclone 公司，Reverse Transcriptase M-MLV , PrimeSTAR? HS DNAPolymerase、Sal I , Xho 1、BamH 1、T4DNA 連接酶購自 TaKaRa 公司，抗 CSFV E2 蛋白單克隆抗體由本研究組制備，豬痕病毒抗原ELISA檢測試劑盒為Median Diagnostics公司產(chǎn)品，豬瘟病毒E2蛋白抗體ELISA檢測試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋生物公司，F(xiàn)uGENE? IiD Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒購于Roche公司。
[0047]1.2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0048]opt1-CSFV-E2基因?yàn)榻?jīng)真核細(xì)胞偏嗜性密碼子優(yōu)化的編碼CSFV E2蛋白的基因。CSFV E2蛋白的氨基酸序列參考CSFV Shimen株(石門株)的蛋白序列(GenBank:AAC68902.2)，將該蛋白序列中E2蛋白第258位氨基酸V修改為氨基酸I，并且去除C端跨膜序列，得到的E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。在設(shè)計(jì)該基因時(shí)，在起始密碼子前加有Kozak序列與Sac I酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基；在E2蛋白基因編碼末端加有終止子與Xho I酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基。opt1-CSFV-E2基因以及該基因特異性擴(kuò)增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因opt1-CSFV-E2大小為1089bp，兩端含有Sac 1、Xho I酶切位點(diǎn)，合成基因克隆在pUC57質(zhì)粒中，序列如SEQ ID N0.2所示。真核表達(dá)載體pCAG-neo用Sac 1、Xho I雙酶切處理，然后與經(jīng)Sac I與Xho I雙切回收的opt1-CSFV-E2基因在T4DNA連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞后涂布含氨芐的LB平板，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用Sac 1、Xho I雙酶切對其進(jìn)行鑒定；酶切鑒定陽性質(zhì)粒命名為pCAGneo-opt1-CSFV-E2,同時(shí)送生物公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見圖1。
[0049]1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選
[0050]選生長狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞消化傳代至24孔板中，待BHK-21細(xì)胞長至90%滿時(shí)，按照FuGENE'? HD Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明用重組質(zhì)粒pCAGneo-opt1-CSFV-E2轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后加入含G418 (1000 μ g/m L)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行加壓培養(yǎng)，4d后將細(xì)胞用胰酶消化，以有限稀釋法傳代于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，5d后在倒置顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞的克隆數(shù)目。挑選含有I個(gè)細(xì)胞集落(即I個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊)的孔相繼在24孔板、6孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)對各細(xì)胞進(jìn)行IFA鑒定以及對表達(dá)蛋白進(jìn)行ELISA檢測。篩選IFA信號較強(qiáng)及表達(dá)抗原量高的細(xì)胞克隆。
[0051]1.4克隆細(xì)胞表達(dá)E2蛋白的ELISA檢測
[0052]克隆細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)48h后，收集上清液，以未轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)上清液為對照，用CSFV抗原檢測試劑盒檢測克隆細(xì)胞上清培養(yǎng)液中E2蛋白，ELISA檢測按試劑盒說明進(jìn)行，測定0D450值，對各細(xì)胞克隆表達(dá)抗原進(jìn)行相對定量比較篩選。
[0053]1.5間接免疫熒光試驗(yàn)檢測目的蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)
[0054]將克隆細(xì)胞接種至24孔或12孔板中，24h后去除培養(yǎng)液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，用含0.l%Triton XlOO的PBS作用細(xì)胞lOmin，PBS洗3次，用含4%BSA的PBS封閉2h，PBS洗I次，加入1:500稀釋的抗E2蛋白單克隆抗體，4°C孵育過夜，PBS洗3次，加入按1:200稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育2h，PBS洗3次，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
[0055]1.6克隆細(xì)胞的RT-PCR鑒定
[0056]用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，取10 μ L進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入Oligo dT I μ L，RNase 抑制劑 I μ L, M-MLV5 X Buffer5 μ L, M-MLV 轉(zhuǎn)錄酶 I μ L, dNTP (IOm Μ) 2.5 μ L,補(bǔ)加雙蒸水至25 μ L，混合，42°C加熱60min，95°C 5min終止反應(yīng)。然后利用opt1-CSFV_E2基因特異性引物，PCR擴(kuò)增目的基因。
[0057]1.7重組細(xì)胞系表達(dá)穩(wěn)定性檢測
[0058]為了檢測重組細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性與表達(dá)抗原的穩(wěn)定性。將經(jīng)比較篩選出的細(xì)胞克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取不同代次細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)E2蛋白的ELISA檢測。同時(shí)對第5代與第25代細(xì)胞進(jìn)行E2蛋白特異性單克隆抗體免疫熒光染色，輔以細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡下觀察陽性性細(xì)胞的比例。
[0059]2 結(jié)果
[0060]2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0061]構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGneo-opt1-CSFV_E2的結(jié)構(gòu)圖見圖1。提取的重組質(zhì)粒經(jīng)Xho 1、SacI雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)有兩條帶，酶切產(chǎn)物電泳帶型與預(yù)期結(jié)果一致，同時(shí)測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中Sac 1、XhoI酶切位點(diǎn)間的序列和設(shè)計(jì)的編碼E2蛋白的基因完全一致。
[0062]2.2E2基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立
[0063]2.2.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選
[0064]細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，加入G418選擇培養(yǎng)基，以有限稀釋法傳代于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，7d后在倒置顯微鏡下挑選出含單個(gè)細(xì)胞集落的克隆并經(jīng)IFA鑒定，篩選出5個(gè)陽性細(xì)胞克隆。
[0065]2.2.2克隆細(xì)胞的RT-PCR鑒定
[0066]利用RT-PCR對IFA鑒定陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增后，結(jié)果表明，對所篩選出的細(xì)胞克隆的不同代次的細(xì)胞均能擴(kuò)增出與理論大小一致的目的條帶。表明目的基因已穩(wěn)定融合于細(xì)胞基因組中，且遺傳穩(wěn)定。
[0067]2.3.3表達(dá)細(xì)胞系的ELISA檢測篩選[0068]根據(jù)免疫熒光檢測的信號強(qiáng)弱以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)E2抗原的ELISA檢測結(jié)果，初步選出15個(gè)克隆細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步比較培養(yǎng)上清液中CSFV E2蛋白抗原ELISA檢測，結(jié)果表明經(jīng)IFA篩選出的15個(gè)克隆中12號克隆所測得的OD值最高(圖2)，選取12號細(xì)胞克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)與進(jìn)一步特性分析。12號克隆細(xì)胞經(jīng)過不同代次傳代后對培養(yǎng)上清液進(jìn)行CSFV E2蛋白ELISA檢測，結(jié)果表明篩選出的克隆細(xì)胞系在多次傳代后仍保持很好的蛋白表達(dá)水平(圖3)。結(jié)果表明構(gòu)建的重組細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)目的基因。
[0069]將得到的能夠穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的12號克隆，命名為BCSFV-E2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為:CGMCCN0.7719，保藏時(shí)間為2012年6月18日。
[0070]2.3.4間接免疫熒光試驗(yàn)檢測E2蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)
[0071]間接免疫熒光試驗(yàn)顯示，細(xì)胞克隆在克隆后第一代即能呈現(xiàn)較強(qiáng)的黃綠色熒光信號，而對照細(xì)胞不呈現(xiàn)熒光信號。且該細(xì)胞克隆經(jīng)傳代至第25代時(shí)，仍能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白(圖4)。如圖4所示，第5代細(xì)胞以及第25代細(xì)胞經(jīng)IFA檢測后，在可見視野范圍內(nèi)陽性細(xì)胞率為100%，表明所構(gòu)建篩選出的細(xì)胞系遺傳穩(wěn)定。
[0072]實(shí)施例2細(xì)胞系表達(dá)重組蛋白對豬的免疫保護(hù)試驗(yàn)
[0073]疫苗制備:將實(shí)施例1所構(gòu)建篩選的重組哺乳動物細(xì)胞系BCSFV-E2細(xì)胞(CGMCCN0.7719)正常傳代后長至90%滿時(shí)，換低血清培養(yǎng)基(血清含量為I~2%)繼續(xù)培養(yǎng)4_6d，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液存于4°C，細(xì)胞上清液經(jīng)截留分子量為50kD超濾濃縮至E2抗原ELISA效價(jià)為1:160至1:320后加入終濃度為0.02%硫柳汞后為疫苗抗原液。疫苗抗原液與MONTANIDE ISA206VG佐劑按重量比為1:1進(jìn)行混合并充分乳化，制備水包油包水型疫苗。對照組弱毒疫苗為市場 銷售的豬瘟細(xì)胞苗(牛睪丸原代細(xì)胞源)產(chǎn)品。
[0074]動物分組與免疫:實(shí)驗(yàn)用豬在免疫前均進(jìn)行采血分離血清進(jìn)行CSFV抗體檢測為陰性。選取日齡相近斷奶長白仔豬15頭，隨機(jī)分為3組:第一組豬5只為弱毒疫苗免疫對照組，免疫CSFV弱毒苗5頭份/豬，只免疫一次(弱毒疫苗組);第二組豬5只為重組哺乳動物細(xì)胞系BCSFV-E2 (CGMCC N0.7719)表達(dá)E2抗原制備的疫苗組，免疫疫苗2ml，第一次免疫四周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次(重組亞單位疫苗組);第三組豬5只為空白對照組，進(jìn)行PBS注射對照(PBS對照組)。
[0075]血清中和抗體檢測:實(shí)驗(yàn)豬在免疫前采血一次，經(jīng)ELISA檢測所有豬血清為CSFV抗體陰性。在一免后四周油苗免疫組進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次。在第一次免疫后2周和4周分別采血分離血清。在二次免疫后第2、4、8、12、16、20、24、28周采血分離血清。實(shí)驗(yàn)動物豬血清均進(jìn)行CSFV病毒中和抗體檢測，檢測中和抗體方法為OIE手冊推薦的NPLA法。具體方法為:各組豬血清56°C滅活30min后，在96孔細(xì)胞板中開始用DMEM進(jìn)行10倍稀釋，以后再依次進(jìn)行2倍稀釋。將稀釋好的血清50 μ L與等體積CSFV病毒(Shimen株，200TCID5(i/0.1ml)混合。37°C孵育lh，然后加IOOyL PK-15細(xì)胞，37°C培養(yǎng)3d后將細(xì)胞用20%丙酮PBS固定。以抗CSFV E2蛋白單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠酶標(biāo)記抗體為二抗，用ACE進(jìn)行顯色。每個(gè)血清樣品進(jìn)行3次重復(fù)。同時(shí)設(shè)立空白對照。細(xì)胞板經(jīng)顯色后于光鏡下觀察判定結(jié)果。以減少50%以上感染的最大血清稀釋倍數(shù)為血清的中和效價(jià)。
[0076]血清ELISA抗體檢測:免疫前后所采集豬血清以IDEXX豬瘟抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法按試劑盒說明進(jìn)行。分別按說明書方法計(jì)算抗體阻斷率。將血清進(jìn)行倍比稀釋后檢測血清抗體效價(jià)(抗體阻斷率大于40%的血清最高稀釋倍數(shù))。
[0077]免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn):于疫苗免疫32周后對實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行病毒攻擊保護(hù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法為對所有三組實(shí)驗(yàn)豬在相同條件下分別在頸部皮下注射豬瘟石門株血毒lmL(106TCID50)，接毒后每日觀察試驗(yàn)豬的精神狀態(tài)，食欲與體溫等指標(biāo)。持續(xù)觀察14天。
[0078]結(jié)果:血清中和抗體檢測結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建制備的表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白重組BHK細(xì)胞系BCSFV-E2所表達(dá)的抗原制備的疫苗免疫豬后能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生CSFV病毒中和抗體。二免后二周(初免后6周)中和抗體最高能達(dá)20480，達(dá)到中和抗體峰值，其值明顯高于弱毒疫苗免疫組中和抗體水平。二免后四周(初免后8周)重組亞單位疫苗能誘導(dǎo)中和抗體效價(jià)為10240。以后中和抗體呈緩慢下降趨勢，但依然保持高水平中和抗體。至免疫后7個(gè)月(28周)，本發(fā)明制備的疫苗免疫組病毒中和抗體水平仍達(dá)640，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于能對豬提供免疫保護(hù)所需的病毒中和抗體水平(40~50)。而實(shí)驗(yàn)中未免疫對照豬在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間其病毒中和抗體水平都為小于10。具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示。
[0079]阻斷ELISA檢測抗體結(jié)果顯示，采用本發(fā)明的重組亞單位疫苗免疫豬后2周可誘導(dǎo)產(chǎn)生豬瘟特異性抗體(抗體阻斷率大于40%)，隨后抗體水平逐漸升高，在免疫后第6-8周達(dá)峰值。在抗體持續(xù)期間，重組亞單位疫苗免疫組抗體水平均高于弱毒疫苗組抗體水平。這種高水平抗體在免疫后觀察32周期始終存在(圖5)。
[0080]豬的病毒攻擊免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明的重組亞單位疫苗與弱毒疫苗免疫組豬在接毒后在整個(gè)觀察期內(nèi)精神狀態(tài)正常，食欲良好，體溫正常(無超過41.(TC),實(shí)驗(yàn)豬無發(fā)病，全部存活。而未免疫對照組豬在接毒后約3天開始出現(xiàn)精神萎靡，嗜睡，食欲減退等癥狀。體溫升高(全部出現(xiàn)高于41.(TC)。于接毒后第9-11天未免疫組豬全部死亡。對死亡豬進(jìn)行剖檢，在脾臟，腎臟，膀胱及扁桃體等器官均出現(xiàn)了典型的豬瘟病理變化。而重組亞單位苗組與弱毒疫苗免疫組豬剖檢后于相就器官均未發(fā)現(xiàn)病變。
[0081]表1重組亞單位疫`苗免疫豬血清病毒中和抗體檢測結(jié)果
[0082]
【權(quán)利要求】
1.一種豬瘟亞單位疫苗，其特征在于含有經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的豬瘟病毒E2蛋白及佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟亞單位疫苗，其特征在于所述的穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系是由以下方法構(gòu)建得到: (1)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，該真核表達(dá)質(zhì)粒包括其中插入編碼豬瘟病毒E2蛋白的基因序列； (2)將所述真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞； (3)經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以添加了G418的培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)； (4)將經(jīng)選擇培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行稀釋克隆，收獲克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液與細(xì)胞，檢測并比較豬瘟病毒E2蛋白表達(dá)量，獲得穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬瘟亞單位疫苗，其特征在于所述豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬瘟亞單位疫苗，其特征在于所述編碼豬瘟病毒E2蛋白的基因序列如SEQ ID N0.2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的豬瘟亞單位疫苗，其特征在于穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系為BCSFV-E2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMC`C N0.7719。
6.穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組哺乳動物細(xì)胞系，命名為BCSFV-E2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為:CGMCCN0.7719。
7.權(quán)利要求6所述的重組哺乳動物細(xì)胞系或其培養(yǎng)物在制備預(yù)防豬瘟病毒病疫苗藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求6所述的重組哺乳動物細(xì)胞系或其培養(yǎng)物在制備診斷或檢測豬瘟病毒感染試劑中的應(yīng)用。
9.一種制備豬瘟亞單位疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)權(quán)利要求6所述的重組哺乳動物細(xì)胞系BCSFV-E2正常傳代后長至90%滿時(shí)，換血清含量為I~2%的低血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4-6d ； (2)收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液存于4°C，細(xì)胞上清液經(jīng)截留分子量為50kD超濾濃縮至E2抗原ELISA效價(jià)為1:160至1:320后，加入終濃度為0.02%硫柳汞，得到疫苗抗原液； (3)疫苗抗原液與佐劑按重量比為1:1進(jìn)行混合并充分乳化，制備水包油包水型疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述的佐劑為MONTANIDEISA206VG。
【文檔編號】C12N5/10GK103751774SQ201310300549
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月17日
【發(fā)明者】華榮虹, 步志高 申請人:哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司, 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所