一種特異性水解亞麻籽木酯素的葡萄糖苷酶的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特異性水解亞麻籽木酯索的葡萄糖苷酶的制備方法及應(yīng)用。其特征是選擇亞麻籽作為飼料喂養(yǎng)大鼠，取大鼠盲腸部位的微生物菌群，構(gòu)建基因組文庫，從中篩選出葡糖苷酶，特異性底物復(fù)篩出目的基因菌株，構(gòu)建特異性水解異落葉松樹脂酚二糖苷(SDG)、羅漢松樹脂酚苷(MAS)的工程菌株。該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)中能直接水解轉(zhuǎn)換目的底物、或純化制備菌株中的重組酶水解目的底物。本發(fā)明采用微生物法或酶法制備異落葉松樹脂酚(SECO)、羅漢松樹脂酚(MAT)，具有成本低、效率高、低污染的優(yōu)點，容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
【專利說明】一種特異性水解亞麻籽木酯素的葡萄糖苷酶的制備及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)計發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用及醫(yī)藥前體制備領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來，木酯素作為植物雌激素，因其具有抗氧化、抗癌、抗衰老及抗更年期綜合癥等功能，而引起大家的廣泛關(guān)注。植物界中，亞麻籽木酯素含量最豐富，主要有異落葉松樹脂酚二糖苷(SDG)、羅漢松樹脂酚苷(MAS)等。這些物質(zhì)要進入體內(nèi)需要轉(zhuǎn)換成腸二醇(END)、腸內(nèi)酯(ENL)才能發(fā)揮作用。目前主要以END、ENL的前體物開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO)和羅漢松樹脂酚(MAT)作為藥物和保健藥物應(yīng)用。而這些前體物的生產(chǎn)主要采用工業(yè)化的方法提取SDG和MAS，然后酸水解得到。該法成本高、污染嚴(yán)重，因此開展微生物酶法水解獲得END、ENL前體物具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]SDG在葡糖糖苷水解酶的作用下脫糖基生成SECO ；MAS脫糖基生成MAT。此過程由體內(nèi)益生菌群完成，因此我們通過培養(yǎng)體內(nèi)益生菌群，利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得了糖苷水解酶的基因序列，并轉(zhuǎn)化到工程菌中獲得大量表達重組酶的菌株?；钚詼y定表明該菌能夠快速水解SDG、MAS生成SECO和MAT，達到了應(yīng)用價值。同時提取和純化的重組酶，可以進行工業(yè)生產(chǎn)具有重大的經(jīng)濟效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0004]實驗例I 葡萄糖苷酶的基因及蛋白氨基酸序列獲取
[0005]1.1大鼠腸道微生物基因組文庫構(gòu)建
[0006]采集大鼠腸道新鮮內(nèi)含物分離腸道微生物細(xì)胞懸浮液，通過低熔點瓊脂糖包埋裂解制備基因組DNA，獲得的DNA用Hind III進行酶切，回收50?150kb的DNA片段，并與BAC載體連接，構(gòu)建大鼠腸道微生物基因組文庫。
[0007]1.2 葡萄糖苷酶陽性克隆的篩選
[0008]將構(gòu)建好的文庫復(fù)制到含有0.1%七葉苷和0.2%檸檬酸鐵銨的LB固體平板上，37°C倒置培養(yǎng)20hr，菌落周圍顯黑色的初步確定為陽性克隆。
[0009]1.3SDG特異性β -葡萄糖苷酶陽性克隆篩選及全基因測序
[0010]陽性克隆質(zhì)粒通過Sau3A I酶切，回收2?5kb片段，并與pUC19DNA/BamH I載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5a。重新涂布SDG篩選平板，菌落周圍顯黑色的再用DNS顯色法篩選后確定為SDG特異性β-葡萄糖苷酶基因陽性克隆。得到的陽性克隆全基因測序，得到SDG特異性β -葡萄糖苷酶核酸(命名為DG β 2012)序列如下:
[0011 ] ATGAAGGACCTGACCCTGGAGGAGAAGGCCAGCCTGACCAGCGGCGGCGACGCCTGGCACCTGCAGGGCGTGGAGAGCAAGGGCATCCCCG
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[0032]1.4 SDG特異性β -葡萄糖苷酶DG β 2012氨基酸序列如下:
[0033]MKDLTLEEKASLTSGGDAWHLQGVESKGIPGYMITDGPHGLRKSLASSAGETDLDDSVPATCFPPAAGLSSSWNPELIHKVGEAMAEECIQ
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[0037]DTLAERGIKADFAPGFTLDLEPADPALESEAVETAKNADVVLMFLGLPEAAESEGFDRDTLDMPAKQITLLEQVAAANKNVVVVLSNGSVI
[0038]TVAPWAKNAKGILESWLLGQSGGPALADVIFGQVSPSGKLAQSIPLDINDDPSMLNWPGEEGHVDYGEGVFVGYRYYDTYGKAVDYPFGYG
[0039]LSYATFEITGVAVAKTGADTATVLATPTNTSDVDAGETVQVYVAPGKDDVKRPKHELYGFTKVALKEGESKTVTLDLAERASAYffSEN
[0040]實驗例2基因重組β -葡萄糖苷酶工程菌的構(gòu)建
[0041]2.1 葡萄糖苷酶DG β 2012基因的克隆
[0042]為了構(gòu)建葡萄糖苷酶(DG β2012)工程菌，根據(jù)已獲得的基因測序結(jié)果設(shè)計特異性引物DG 3 2012F以及DG β 2012R，并在引物兩端分別添加HindIII和Xho I酶切位點。引物序列分別為:
[0043]F:5/ -TAATAAGCTTATGAAGGACCTGACCCTGGA-3’ (下劃線處標(biāo)記 Hind III 酶切位點)；R:
[0044]5’ -ATATCTCGAGGTTCTCGCTCCAGTAGGCG-3’ (下劃線處標(biāo)記 Xho I 酶切位點)。以β -葡萄糖苷酶陽性克隆為模板進行PCR擴增。
[0045]PCR擴增結(jié)果如圖1:
[0046]圖1PCR擴增β -葡萄糖苷酶DG β 2012基因
[0047]1.核酸 Marker (DL2000) ;2.PCR 產(chǎn)物
[0048]2.2原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選及鑒定
[0049]PCR產(chǎn)物膠回收后，Hind III與Xho I雙酶切PCR產(chǎn)物與原核表達載體pET22b (+)(圖2)，T4 Iiagse連接后轉(zhuǎn)入E.coli DH5 α中，涂平板挑取陽性克隆后測序結(jié)果符合預(yù)期。
[0050]圖2重組酶原核表達載體構(gòu)建
[0051]1.核酸 Marker ；2.PCR 產(chǎn)物雙酶切；3.pET22b (+)雙酶切
[0052]2.3重組酶的表達及純化
[0053]將測序正確的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21后，不同溫度(16°C、30°C和37°C )、不同時間(lhr、3hr和過夜)和不同IPTG濃度(0.lmM、0.5mM和ImM)確定重組酶的最適表達條件。確定其最適溫度為37°C、最適時間為3hr及最適IPTG濃度為0.5mM。重組酶在此條件下誘導(dǎo)表達后收集菌體，超聲破碎后SDS-PAGE鑒定(圖3)。
[0054]圖3重組酶的表達
[0055]1.蛋白Marker ;2.誘導(dǎo)前樣品；3.誘導(dǎo)后樣品
[0056]離心收集菌體沉淀，超聲破碎后12，OOOrpm離心30min后收集上清，利用N1-NTA親和層析柱純化蛋白，純化過程參照Novagen使用說明書，純化的蛋白SDS-PAGE鑒定(圖4)。
[0057]圖4重組酶的純化
[0058]1.蛋白Marker ;2.純化后蛋白
[0059]2.4重組酶催化反應(yīng)的最適PH和pH穩(wěn)定性
[0060]以50mmol/L檸檬酸鈉為緩沖體系，測得DG β 2012的最適pH為7.0 (圖5Α)。在PH4.0?10.0范圍內(nèi)均能檢測到酶活性；在pH6.0?8.0范圍內(nèi)，能檢測到80%以上的殘余酶活力且酶的穩(wěn)定性較好；在PH7.0時酶有最好的保藏穩(wěn)定性。
[0061]圖5重組酶催化反應(yīng)的最適PH和pH穩(wěn)定性測定
[0062]A.最適pH測定；B.pH穩(wěn)定性測定
[0063]2.5重組酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性
[0064]在最適反應(yīng)pH條件下測得DG β 2012酶催化水解SDG反應(yīng)的最適溫度為40°C (圖6A)。酶在35-45°C的環(huán)境中有較好的的穩(wěn)定性，高于60°C則酶的活力驟減(圖6B)。
[0065]圖6重組酶催化反應(yīng)的最適溫度和溫度穩(wěn)定性測定
[0066]A.最適溫度測定；B.溫度穩(wěn)定性測定
[0067]2.6底物特異性測定
[0068]分別使用SDG、MAS、乳糖、蔗糖、麥芽糖以及CMC為底物，測定DG β 2012的底物特異性。在最適反應(yīng)條件下，以SDG為底物時，DG β 2012酶活達到54.5U/mg, Km和Vmax分別為 0.23mmol/L、42.5 μ mol/min。以 MAS 為底物時，DG β 2012 酶活達到 49.5U/mg, Km 和Vmax分別為0.21mmol/L、35.5 μ mol/min。SDG和MAS是DG β 2012的有效且特異性的作用底物。DG β 2012酶不能催化轉(zhuǎn)化蔗糖、乳糖、麥芽糖以及CMC。

【具體實施方式】
[0069]實施例3
[0070]對含有DG β 2012酶的BL21工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入10%亞麻籽粉，在37°C下、IPTG為0.5mM誘導(dǎo)3hr，回收培養(yǎng)液，提取SECO和MAT。測定水解轉(zhuǎn)化效率達到73%。
[0071]實施例4
[0072]對含有DG β 2012酶的BL21工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入10%亞麻籽粗提物，在37°C下、IPTG為0.5mM誘導(dǎo)3hr，回收培養(yǎng)液，提取SECO和MAT。測定水解轉(zhuǎn)化效率達到91%。
[0073]實施例5
[0074]取純化后的DG β 2012酶10mg，體外反應(yīng)條件如實施例2，加入SDG或MAS，測定水解轉(zhuǎn)化效率達到82%。
【權(quán)利要求】
1.一種葡萄糖苷酶的制備，其特征在于能特異性水解亞麻籽木酯素，核酸序列和氨基酸序列如附錄。
2.如權(quán)利要求1所述亞麻籽木酯素包含異落葉松樹脂酚二糖苷、羅漢松樹脂酚苷。
3.如權(quán)利要求1或2所述水解亞麻籽木酯索所生成的產(chǎn)物是異落葉松樹脂酚或羅漢松樹脂酚。
4.如權(quán)利要求1所述的葡萄糖苷酶核酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化或突變包括點突變、移碼突變序列。
5.如權(quán)利要求1所述的葡萄糖苷酶氨基酸序列部分突變、缺失、重組。
6.如權(quán)利要求1所述的葡萄糖苷酶來源于哺乳動物或人腸道微生物菌群。
7.如權(quán)利要求2所述的亞麻籽木酯素在工程菌發(fā)酵中被水解或體外酶法水解。
【文檔編號】C12N15/56GK104293745SQ201310305761
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】姬丹陽, 周衛(wèi)東, 王月華 申請人:上海鼎國生物技術(shù)有限公司