一種抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法，包括以下步驟：（1）PUMA-/-(PUMA基因敲除)小鼠或PUMA-/+小鼠成纖維細(xì)胞MEF的制備、傳代、凍存；（2）DH5α大腸桿菌株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4，并進(jìn)行質(zhì)粒小提和質(zhì)粒大提；（3）逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝、滴度測定與凍存；（4）PUMA基因敲除小鼠或PUMA-/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF的重編程；（5）敲降PUMA功能的人成纖維細(xì)胞的重編程。本發(fā)明的有益效果是通過在體細(xì)胞重編程步驟中抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效，同時(shí)能夠保護(hù)iPS細(xì)胞基因組穩(wěn)定性。
【專利說明】—種抑制PUMA功能改善i PS細(xì)胞建立功效的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞領(lǐng)域，尤其是涉及一種抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]將0CT4、S0X2、 KLF4和c_Myc四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，可重編程形成類似于胚胎干細(xì)胞的一類新型細(xì)胞，被稱為iPS細(xì)胞。2007年，iPSCs技術(shù)在人的體細(xì)胞上取得成功，iPS細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的多向分化能力，是各類疾病發(fā)病機(jī)制研究和藥物篩選的最佳材料；也是一些退行性疾病將來治療的新希望。但大量研究表明，iPS細(xì)胞在重編程中誘發(fā)了相當(dāng)數(shù)量的DNA損傷以及染色體結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致iPS細(xì)胞具有潛在的致癌性，并且效率很低。所以在將iPS細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療之前，安全性和有效性成為該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。
[0003]p53，一種重要的腫瘤抑制蛋白，可通過觸發(fā)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期及加速細(xì)胞衰老方式抑制腫瘤發(fā)生。在大多數(shù)腫瘤中P53處于失活狀態(tài)。研究證實(shí)沉默p53可顯著地增加iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率，不僅對病毒載體誘導(dǎo)技術(shù)有用，對用質(zhì)?；虻鞍渍T導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)同樣有用。Marion等表示缺乏p53的iPS細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，而且不能有效地發(fā)育成嵌合體小鼠[1]，Utikal等證實(shí)暫時(shí)性而不是永久性抑制p53可促進(jìn)重編程的效率[2]。但沉默P53同樣會增加基因組不穩(wěn)定性和腫瘤的發(fā)生性，其分子機(jī)制與其下游的p21有關(guān)。這正好驗(yàn)證了 iPS產(chǎn)生具有細(xì)胞周期依賴和非細(xì)胞周期依賴兩種模式。但目前的研究均忽略了在重編程過程中細(xì)胞凋亡因素。而P53也是通過調(diào)節(jié)PUMA的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞凋亡。
[0004]2001年，Yu [3]和Nakano等[4]兩個(gè)獨(dú)立的研究小組分別從結(jié)直腸癌細(xì)胞系和人類成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中分離出新的可被P53快速誘導(dǎo)并具有強(qiáng)大促凋亡作用的p53靶基因，后被鑒定為同一基因，并命名為PUMA。PUMA直接或間接地與抗凋亡Bcl-2蛋白發(fā)生相互作用，解除Bcl-2/Bcl-xL對Bax/Bak的抑制作用，Bax/Bak構(gòu)象改變后在線粒體膜上形成寡聚物，使膜通透性增加、外膜電勢降低、釋放細(xì)胞色素C入胞質(zhì)，啟動(dòng)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。生理狀況下PUMA表達(dá)量較低，但在DNA損傷藥物、血清饑餓和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等刺激誘導(dǎo)下可顯著升高。本實(shí)驗(yàn)室和其他實(shí)驗(yàn)室研究表明失去PUMA可以在高劑量照射條件下，通過減少凋亡保護(hù)造血干細(xì)胞和小腸干細(xì)胞等成體干細(xì)胞[5-9]。并且在很多疾病模型中未發(fā)現(xiàn)失去PUMA可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[5-8，10-11]。我們初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲除PUMA和p53 —樣具有促進(jìn)iPS產(chǎn)生的作用，但根據(jù)以往報(bào)道中PUMA和p53對腫瘤發(fā)生的作用相反，其對iPS細(xì)胞重編程中基因組穩(wěn)定性和致癌性的作用機(jī)制很是令人期待。PUMA作為P53下游凋亡通路的重要分子，抑制或敲除PUMA在成體干細(xì)胞中具有明顯的抗放射和抑制腫瘤形成的作用，但其對iPS的產(chǎn)生和基因組穩(wěn)定性的作用以及分子機(jī)制還不是很清
λ.Μ
/E.ο
[0005]參考文獻(xiàn)
[0006]1.Marion RMj Strati K, Li H, Murga M，Blanco R，et al.(2009) A p53_mediatedDNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity.Nature460:1149-1153.[0007]2.Utikal Jj Polo JM，Stadtfeld Mj Maherali Nj Kulalert Wj et al.(2009)Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPScells.Nature460:1145-1148.[0008]3.Yu J，Zhang Lj Hwang PM, Kinzler KWj Vogelstein B (2001) PUMA induces therapid apoptosis of colorectal cancer cells.Mol Cell7:673-682.[0009]4.Nakano Kj Vousden KH(2001)PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced byp53.Mol Cell7:683-694.[0010]5.Labi Vj Erlacher Mj Krumschnabel Gj Manzl Cj Tzankov A，et al.(2010)Apoptosis of leukocytes triggered by acute DNA damage promotes lymphomaformation.Genes Dev24:1602-1607.[0011]6.Michalak EMj Vandenberg CJj Delbridge AR, Wu L，Scott CL, et al.(2010)Apoptosis-promoted tumori genes i s:gamma-1rradiat ion-1nduced thymiclymphomagenesis requires Puma-driven leukocyte death.Genes Dev24:1608-1613.[0012]7.Yu H，Shen H，Yuan Y，XuFeng R，Hu X，et al.(2010)Deletion of Pumaprotects hematopoietic stem cells and confers long-term survival in response tohigh-dose gamma-1rradiation.Bloodl15:3472-3480.[0013]8.Shao L，Sun Y，Zhang Z，F(xiàn)eng Wj Gao Y，et al.(2010) Deletion ofproapoptotic Puma selectively protects hematopoietic stem and progenitor cellsagainst high-dose radiation.Blood 115:4707-4714.[0014]9.Qiu Wj Carson-Walter EBj Liu Hj Epperly Mj Greenberger JSj et al.(2008)PUMA regulates intestinal progenitor cell radiosensitivity and gastrointestinalsyndrome.Cell Stem Cell2:576-583.[0015]10.Jeffers JRj Parganas E，Lee Y，Yang Cj Wang J，et al.(2003) Puma is anessential mediator of p53_dependent and-1ndependent apoptotic pathways.CancerCell4:321-328.[0016]11.Villunger A，Michalak EM，Coultas Lj Mullauer F，Bock G，et al.(2003)p53_and drug-1nduced apoptotic responses mediated by BH3_only proteins puma andnoxa.Science302:1036-1038.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的目的是通過在體細(xì)胞重編程步驟中抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效，同時(shí)能夠保護(hù)iPS細(xì)胞基因組穩(wěn)定性。
[0018]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法，包括以下步驟:
[0019](l)PUMA^(PUMA基因敲除)或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF的制備、傳代、凍存；
[0020](2) DH5 α 大腸桿菌株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和 PMX-KLF4，并進(jìn)行質(zhì)粒小提和質(zhì)粒大提；
[0021](3)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝、滴度測定與凍存:將攜帶有PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒引入包裝細(xì)胞Plat-E細(xì)胞中，回收在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并進(jìn)行滴度測定與凍存；
[0022](4) PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF的重編程
[0023]將步驟(3)中的攜帶有PMX-0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和 PMX-KLF44 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染步驟(1)得到的PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF，并用飼養(yǎng)層細(xì)胞支持培養(yǎng)感染的PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF，連續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)的克隆為PUMA+或PUMA_/+小鼠iPS細(xì)胞；
[0024](5)敲降PUMA功能的人成纖維細(xì)胞的重編程
[0025]將人PUMA shRNA (載體 Plk0.1)和攜帶有人 PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒引入包裝細(xì)胞Plat-E中，回收在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的病毒載體，并將回收的病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，并用飼養(yǎng)層細(xì)胞支持培養(yǎng)感染的人成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)7天后，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)的克隆為敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞。
[0026]進(jìn)一步，所述步驟(1)中的具體步驟為:取8-10周的PUMA+或PUMA_/+小鼠，按2:1的雌雄比例合籠，處死孕期為13.5天的孕鼠，將小鼠胚胎從子宮中剝離，去除頭和內(nèi)臟組織，將單個(gè)胚胎的軀干，剪碎至糊狀，胰酶消化，F(xiàn)M重懸，培養(yǎng)24-48h后，將MEF細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行傳代，2 XFM凍存液凍存PO代、Pl或P2代細(xì)胞。
[0027]進(jìn)一步,所述步驟(3)的具體步驟為:每IOOmm皿接種8x106_1x107個(gè)Plat-E細(xì)胞，融合度達(dá)到90%時(shí)，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液換成5ml新鮮DMEM+10%FBS，制備質(zhì)粒和lipofectamine2000 混合液，10 μ I lipofectamine2000 與 500 μ I OPT1-MEM 混合，室溫放置 5min，攜帶有 PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和 PMX-KLF44 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒各 10 μ g與500 μ I OPT1-MEM混合，室溫放置5min，將上述兩種液體輕輕混合，室溫靜置20min，將混合液逐滴加入IOOmm皿中，Iml/皿，混勻，培養(yǎng)6_8h后換新鮮的DMEM+10%FBS分別在培養(yǎng)后48h和72h收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清并濃縮，收集的部分逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行滴度測定。
[0028]進(jìn)一步，所述步驟(4)的具體步驟為:將PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF，種在IOOmm的皿中，第2天，根據(jù)所測病毒滴度，計(jì)算病毒載體所用的量，將步驟(3)中得到的攜帶有PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體加入到IOOmm皿中，并加入polybrene至終濃度為6 μ g/ml或加入5ml逆轉(zhuǎn)錄病毒載體+Iml FBS+6 μ I的8 μ g/ml的polybrene，感染12h后，換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿后，將感染的PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF細(xì)胞，按常規(guī)方法消化傳代至鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為IxlO5/孔，培養(yǎng)基為小鼠ES培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)的克隆為PUMA+或PUMA+小鼠iPS細(xì)胞。
[0029]進(jìn)一步，所述步驟(5)的具體步驟為^fAPUMA shRNA (載體Plk0.1)和攜帶有人PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒引入包裝細(xì)胞Plat-E中，回收在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的病毒載體，并將回收的病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基為EMDM+10%FBS，連續(xù)兩天，兩次病毒轉(zhuǎn)染，感染第三天后更換為人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞長滿后，轉(zhuǎn)移至鋪好飼養(yǎng)層細(xì)胞的IOOmm培養(yǎng)皿中，利用人成纖維培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)天后換為人ES培養(yǎng)基:人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基=1:1的混合培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)天換為完全的人ES培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天后，加條件培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基為用人ES培養(yǎng)基培養(yǎng)飼養(yǎng)層細(xì)胞一天的培養(yǎng)基，20天左右出現(xiàn)的克隆為敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞。
[0030]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:由于采用上述技術(shù)方案，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明敲除或敲降PUMA基因，均能提高體細(xì)胞重編程效率，與野生型的iPS細(xì)胞的形成率相比具有顯著性差異，P < 0.05，并且敲除或敲降PUMA基因的iPS細(xì)胞的基因組是穩(wěn)定的，與野生型iPS細(xì)胞相比無顯著性差異，而敲除p53和p21基因后，相應(yīng)的iPS細(xì)胞的染色體的突變率與野生型iPS細(xì)胞相比有顯著性差異，P < 0.05 ；抑制PUMA功能，在重編程過程中能提高誘導(dǎo)效率和保護(hù)基因組穩(wěn)定性，為揭開iPS細(xì)胞在重編程過程中產(chǎn)生的基因組不穩(wěn)定性問題提供一個(gè)新的突破口，并為探尋保持iPS細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的方法提供理論依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】[0031]圖1小鼠iPS細(xì)胞的堿性磷酸酶染色照片，縮小5倍；
[0032]圖2小鼠iPS細(xì)胞形成率的柱狀圖；
[0033]圖3PUMA+小鼠iPS細(xì)胞表達(dá)ES標(biāo)記基因的熒光顯微鏡圖；在10倍鏡下觀察結(jié)果，放大倍數(shù):100倍；
[0034]圖4畸胎瘤三個(gè)胚層的組織H.E.染色顯微鏡圖；在10倍鏡下觀察結(jié)果，放大倍數(shù):100倍；
[0035]圖5嵌合鼠照片圖；
[0036]圖6染色體突變率的柱狀圖；
[0037]圖7敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞的PUMA蛋白表達(dá)的蛋白印跡圖；
[0038]圖8敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞形成率的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但并不限定本發(fā)明。
[0040]實(shí)施例1PUMA+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF的制備、傳代、凍存
[0041](I)取8-10周的PUMA+小鼠，傍晚按2:1的雌雄比例合籠，次日早上發(fā)現(xiàn)有陰道栓的雌鼠單籠飼養(yǎng)，中午胚胎發(fā)育0.5天記為E0.5或0.5dpc ;取小鼠胚胎前一天高壓滅菌鑷子和剪刀。
[0042](2)處死孕期為13.5天(E13.5)的孕鼠,將小鼠放到75%的酒精中浸泡后,放于無菌超凈臺中，將處死的孕鼠，用大剪刀剪開腹腔，取出兩側(cè)子宮，并將子宮放于無菌的IOOmm塑料有蓋培養(yǎng)皿中。
[0043](3)將取出的子宮放到無菌的PBS中，計(jì)胚胎數(shù)。
[0044](4)將小鼠胚胎一步一步從子宮中剝離出來:先去子宮，再去卵黃膜、胎盤和羊膜，每一步都用PBS洗一遍。
[0045](5)將剝離出來的胚胎，放到新的PBS中，去除頭和內(nèi)臟組織。
[0046](6)將單個(gè)胚胎的軀干移到一個(gè)加入少量PBS的培養(yǎng)皿中，用小剪刀將所有的軀干剪碎至糊狀。
[0047](7)將剪碎的組織移到一個(gè)新的15ml離心管中，加0.05%胰酶5ml，放37°C水浴鍋，晃動(dòng)5min,消化30min。加入IOml的FM中和，F(xiàn)M指DMEM+10%FBS的混合液，1000rpm,離心5min。[0048](8)棄掉上清，用FM重懸細(xì)胞，按I個(gè)胚胎種一個(gè)IOOmm的培養(yǎng)皿，每皿加FMlOml，放37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，記為PO。
[0049](9) 24-48h后細(xì)胞生長密度接近100%后，將上述MEF細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行傳代，吸掉細(xì)胞上清，用PBS洗一遍，加入0.05%胰酶Iml覆蓋皿即可，37°C消化3min。加入兩倍體積的FM中和胰酶后，用槍反復(fù)吹打，直至所有的貼壁細(xì)胞都脫落。
[0050](10) 1000rpm,離心5min,棄掉上清,用FM重懸后，按1:3傳至100_細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿的培養(yǎng)基為10ml，此時(shí)記為Pl。
[0051](11) 24-36h后，MEF細(xì)胞生長密度再次達(dá)到100%后，按步驟(9)、(10)傳代，記為P2。
[0052](12)將PO代、Pl或P2代的細(xì)胞按常規(guī)方法消化，離心。棄掉上清，用少量FM重懸成單細(xì)胞后，計(jì)數(shù)。
[0053](13)每2X106個(gè)細(xì)胞加入0.5ml FM，根據(jù)FM量，緩慢加入預(yù)先配制的等量的2 X FM凍存液混勻。
[0054](14)按每管Iml的量加入凍存管內(nèi)，擰緊蓋子，標(biāo)記細(xì)胞代數(shù)，標(biāo)號及凍存日期。
[0055](15)放入凍存盒中_80°C過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。
[0056]實(shí)施例2DH5 α 大腸桿菌株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc, PMX-KLF4，并進(jìn)行質(zhì)粒小提和質(zhì)粒大提
[0057]LB培養(yǎng)基:酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaC110g，溶于900ml H2O中，調(diào)整pH至
7.2-7.4，加水補(bǔ)齊至1L，高溫高壓滅菌保存。
[0058]LB固體培養(yǎng)基:酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCllOgjI^ 15g，加水至1L，高溫高壓滅菌，溫度降至50°C左右，加抗生素，倒入IOOmm皿，20ml/皿，冷卻凝固后4°C保存。
[0059]抗生素:氨芐青霉素配置成lOOmg/mL (1000X )氨芐青霉素(Amp)溶液，-20°C保存。
[0060]DH5 α大腸桿菌株,購自Takara。
[0061]質(zhì)粒:PMX— 0ct4、PMX — Sox2、PMX — c_Myc、PMX — KLF4 購自 addgene。
[0062]2.1細(xì)菌轉(zhuǎn)化步驟
[0063](I)高壓后的LB培養(yǎng)基待冷卻至50°C左右加入Amp溶液，終濃度為100 μ g/mL。
[0064](2)從_80°C中取出DH5a大腸桿菌株，至于冰上，將之前準(zhǔn)備好的連接體系8 μ L(一般加入的連接體系不大于感受態(tài)的1/10)，加入感受態(tài)中，輕彈幾下，使之混合均勻，靜置與冰上30min。將感受態(tài)置于42°C水浴90s,而后再置于冰上靜置5min。加入ImLLB37°C 180rmp/min搖lh。將體系離心去上清，90 μ L LB培養(yǎng)基重懸。
[0065](3)將DH5 α大腸桿菌涂布于Amp抗性LB平板，在37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，觀察克隆。2.2質(zhì)粒小提(參考TIANprep Mini Plasmid Kit說明書)
[0066](I)細(xì)菌活化:吸取凍存的菌液8 μ I或挑取菌落置于5ml無菌LB培養(yǎng)基中(加抗生素Amp)，37°C搖床中(200rpm)活化8h。
[0067](2)柱平衡步驟:向吸附柱CP3中加入500 μ I平衡液BL, 12, OOOrpm離心Imin,倒
掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。[0068](3)取l-5ml活化的菌液，加入離心管中，12，OOOrpm離心lmin，盡量吸盡上清。
[0069](4)向留有菌體沉淀的離心管中加入250μ I溶液Ρ1，用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。
[0070](5)向離心管中加入250 μ I溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)8次使菌體充分裂解。
[0071](6)向離心管中加入350 μ I溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12，OOOrpm離心lOmin，離心管底部形成沉淀。
[0072](7)將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，注意盡量不要吸出沉淀。12，OOOrpm離心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
[0073](8)向吸附柱CP3中加入600 μ I漂洗液PW，12，OOOrpm離心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
[0074]( 9 )重復(fù)上述步驟(8 )。
[0075](10)將吸附柱CP3放回收集管中，12，OOOrpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的
漂洗液去除。
[0076](11)將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加80μ I去離子水(70°C)，室溫放置2min，12，OOOrpm離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
[0077](12)用 Nanodrop 測 定 OD 值(0D26(l/0D28(l 比值應(yīng)在 1.8-2.0)。
[0078](13)-20 O 保存。
[0079]2.3 質(zhì)粒大提(參考 Qiagen Plasmid Maxi Kit 說明書)
[0080](I)細(xì)菌活化:吸取凍存的菌液8 μ I或挑取菌落置于5ml無菌LB培養(yǎng)基中(加抗生素Amp)，37°C搖床中(200rpm)活化8h。
[0081](2)取500 μ 1-1ml活化的菌液加入到400ml新鮮菌液中，37°C搖床中(200rpm)培養(yǎng) 16h。
[0082](3)收集菌液,放置于250ml離心杯中，4°C 6, OOOXg離心15min。
[0083](4)用IOml Pl重懸菌沉淀。
[0084](5)加入IOml P2，混勻，室溫放置5min。
[0085](6)加入預(yù)冷的IOml P3，立即混勻，冰上靜置20min。
[0086](7)4°C 20，000\8離心3011^11，收集上清。
[0087](8) 4°C 20，OOOXg 離心 15min,收集上清。
[0088](9)用 IOml QBT 潤柱子(QIAGEN-tipSOO)。
[0089](10)將上清液加入到QIAGEN-tip上，通過重力作用流盡。
[0090](11)加入 QC30ml。
[0091](12)用15ml QF洗脫DNA (QF最好加熱至65°C，提高洗脫效率)。
[0092](13)在洗脫的DNA中加入10.5ml異丙醇，混勻，4°C 20，OOOXg離心30min。
[0093](14)去除上清，加入5ml70%的乙醇清洗沉淀，4°C 20, OOOXg離心lOmin。
[0094](15)去除乙醇，室溫晾干5min (沉淀從白色變成透明)，用無菌去離子水溶解DNA沉淀。
[0095](16)用 Nanodrop 測定 OD 值。
[0096](17)-20 ℃ 保存。
[0097]實(shí)施例3逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝、滴度測定與凍存[0098]3.1逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生
[0099](I )40°C水浴復(fù)蘇Plat-E細(xì)胞，復(fù)蘇后，將細(xì)胞置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)匯合度達(dá)到70-80%時(shí)，1:3傳代。
[0100](2)消化對數(shù)生長期的Plat-E細(xì)胞，計(jì)數(shù)。(當(dāng)一個(gè)T75培養(yǎng)瓶中的Plat-E細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90%時(shí)，可以傳到2個(gè)IOOmm皿中)。
[0101](3)按每 IOOmm 皿 8xl06_lxl07 接種細(xì)胞。
[0102](4) 17-20h左右，觀察細(xì)胞匯合度是否到90%。
[0103](5)將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液換成5ml新鮮DMEM+10%FBS。
[0104](6)配備質(zhì)粒和lipofectamine2000混合液(每IOOmm皿)比例如下:
[0105]a) 10 μ I lipofectamine2000+500 μ I ΟΡΤΙ-ΜΕΜ，室溫放置 5min ；
[0106]b)目的質(zhì)粒 10 μ g (PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和 PMX-KLF4)+500 μ IOPT1-MEM,室溫放置5min ;將上述兩種液體a和b輕輕混合，室溫靜置20min。
[0107](7)將混合液逐滴加入IOOmm皿中，Iml/皿，混勻，37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0108](8)培養(yǎng)8h后換新鮮的DMEM+10%FBS，37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0109](9)分別在培養(yǎng)后48h和 72h收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，用0.45 μ m的小濾器過濾。直接用于實(shí)驗(yàn)或按需要濃縮凍存。
[0110](10)濃縮:使用 Amicon Ultra_15centrifugal filter devices (100K NMWL)進(jìn)行濃縮。4，000rpm4°C離心40min，濃縮100倍。吸取濃縮液，直接用于實(shí)驗(yàn)或分裝凍存于-80°C。
[0111]3.2病毒滴度(TU)測定:
[0112](I)在6孔板中鋪293T細(xì)胞，IxlO5/孔。
[0113](2)第2天，按(原液，1:10,1:100,1 =1000,1: 10000)的方案對病毒進(jìn)行稀釋，將病毒加入孔中，并加入polybrene (聚凝胺)至終濃度為6 μ g/ml。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0114](3)感染后48h，收集感染的細(xì)胞，用流式檢測GFP陽性率。按如下公式進(jìn)行計(jì)算梯度:GFP+細(xì)胞％XDayl接種的293T細(xì)胞數(shù)X稀釋倍數(shù)X病毒原液體積(ml)計(jì)算病毒滴度(TU/ml)。例如:如果1:1000孔中的GFP陽性率為10%，而病毒原液體積為100μ 1，則病毒滴度為:10%xl05xl000x0.l=106TU/mlo MOI=病毒滴度/病毒液體積/感染細(xì)胞數(shù)。
[0115](4)根據(jù)滴度及Μ0Ι，確定是否要濃縮病毒。一般情況下，若感染常規(guī)細(xì)胞系(或較容易感染的細(xì)胞)，MOI為5-10 ;若感染造血祖細(xì)胞，MOI為10-20 ;若感染造血干細(xì)胞(較難感染的細(xì)胞)，MOI為20-50。做iPS時(shí)一般采用MOI為5_10。
[0116]實(shí)施例4PUMA+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF的重編程
[0117](I)將P2代PUMA+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF細(xì)胞解凍IXlO6種在IOOmm的皿中，第2天，觀察細(xì)胞，根據(jù)所測病毒滴度(一般按MOI為10)，計(jì)算每一個(gè)病毒所用的量，根據(jù)用量復(fù)蘇病毒。將復(fù)蘇的攜帶有PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒加入到IOOmm皿中，并加入polybrene至終濃度為6 μ g/ml。
[0118](2)病毒感染12h后，進(jìn)行換液，換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基。
[0119](3)感染48h后，復(fù)蘇飼養(yǎng)層細(xì)胞。
[0120](4)第3天時(shí)，將感染的MEF細(xì)胞，按常規(guī)方法消化傳代至鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的IOOmm皿中，細(xì)胞密度為IxlO5/孔，培養(yǎng)基為小鼠ES培養(yǎng)基。[0121](5)以后每3天換液一次。
[0122](6)第12天時(shí)，開始出現(xiàn)PUMA+小鼠iPS克隆，支持克隆的生長。
[0123](7)第15天，將克隆挑出。
[0124](8)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞放37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天換液，大約3天擴(kuò)增傳代一次。P3代以后可以凍存。
[0125]實(shí)施例5PUMA+小鼠iPS細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代與凍存
[0126]5.1PUMA+小鼠iPS細(xì)胞的培養(yǎng)
[0127](I)將滅菌的0.l%Gelatin (明膠)鋪于35mm皿中(Gelatin的量為覆蓋培養(yǎng)皿底部即可)，0.5h后吸出Gelatin。
[0128](2)復(fù)蘇凍存的飼養(yǎng)層細(xì)胞，將凍存的飼養(yǎng)層細(xì)胞快速放入39°C的水浴鍋內(nèi)快速融化。
[0129](3)加入DMEM培養(yǎng)基，1000rpm離心5min,棄掉上清。
[0130](4)加入DMEM+10%FBS培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞，用臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，飼養(yǎng)層細(xì)胞的接種密度為2-4X 104/cm2,復(fù)蘇后過夜。
[0131](5)第二天，復(fù)蘇PUMA+小鼠iPS細(xì)胞:復(fù)蘇時(shí)加入小鼠ES培養(yǎng)基，lOOOrpm，離心5min,棄掉上清。
[0132](6)重新加入小鼠ES培養(yǎng)基，用2ml的吸管，輕輕吹打，放入預(yù)先鋪上飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。
[0133](7)第三天給復(fù)蘇的PUMA+小鼠iPS細(xì)胞換液，隔一天PUMA+小鼠iPS細(xì)胞長的足夠大時(shí)，傳代。
[0134]5.2PUMA+小鼠iPS細(xì)胞的傳代
[0135](I)吸出培養(yǎng)基，加PBS洗一遍，加適量0.025%胰酶(量不用太多，覆蓋培養(yǎng)皿底部即可)消化3min。
[0136](2)顯微鏡下觀察，見飼養(yǎng)層細(xì)胞已經(jīng)開始松動(dòng)，加入兩倍體積的PBS。
[0137](3)將所有的液體吸出，加入少量小鼠ES培養(yǎng)基，用移液管或槍尖吹下細(xì)胞，放入離心管中，1000rpm離心5min。
[0138](4)棄上清，用小鼠ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，傳至預(yù)先鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，傳代的數(shù)量根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量為1:3-1:12。
[0139]5.3PUMA+小鼠iPS細(xì)胞的凍存
[0140](I)細(xì)胞長到足夠大以及出現(xiàn)未分化細(xì)胞時(shí)，可通過胰酶的方法將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來。
[0141](2)放入離心管中，1000rpm離心5min。
[0142](3)棄掉上清，加入小鼠ES細(xì)胞凍存液重懸，放入2ml凍存管中，放入程序性降溫凍存盒中，放入_80°C，隔天放入液氮中。細(xì)胞凍存的數(shù)量，由細(xì)胞數(shù)量確定。
[0143]實(shí)施例6敲降PUMA功能的人成纖維細(xì)胞的重編程
[0144]針對PUMA的shRNA的PUMA shRNA的序列如下:
[0145]克隆編號01:TTGGCTCATTTGCTCTTCACG(SEQ ID NO:1)；
[0146]克隆編號02:ATGAGATTGTACAGGACCCTC(SEQ ID NO:2)；
[0147]克隆編號03:AGTCCCATGATGAGATTGTAC(SEQ ID NO:3)；[0148]克隆編號04:TCTCTAAACCTATGCAATG(SEQ ID NO:4)；
[0149]克隆編號05:TGTCTCCGCCGCTCGTACT(SEQ ID NO:5)；
[0150]克隆編號06:TGAGGTCGTCCGCCATCCG(SEQ ID NO:6)；
[0151]克隆編號07:AATTGGGCTCCATCTCGGG(SEQ ID NO:7) ? [0152]其中附圖7和附圖8中的shPUMA#l代表PUMA shRNA的克隆編號01，序列為:TTGGCTCATTTGCTCTTCACG;shPUMA#2 代表 PUMA shRNA 的克隆編號 02，序列為:ATGAGATTGTACAGGACCCTC。PUMA shRNA 和 siRNA 購自 open biosystem。
[0153]具體步驟為:
[0154](I)人 PUMA shRNA (載體 Plk0.1)和人 PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc、PMX_KLF轉(zhuǎn)錄因子的病毒載體包裝步驟如以上所述實(shí)施例3逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝步驟所述。
[0155](2)人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基為EMDM+10%FBS，培養(yǎng)和傳代參照PUMA+小鼠的MEF細(xì)胞。
[0156](3)將步驟(1)中的四種逆轉(zhuǎn)錄病毒和人PUMA shRNA (載體Plk0.1)慢病毒一起轉(zhuǎn)入人成纖維細(xì)胞，連續(xù)兩天，兩次病毒轉(zhuǎn)染。
[0157](4)第三天洗掉病毒培養(yǎng)液，換為人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0158]( 5)第四天，接種飼養(yǎng)層細(xì)胞于培養(yǎng)皿中。
[0159](6)第五天，將誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在鋪好的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，利用人成纖維培
養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0160](7)第六天將培養(yǎng)基換為人ES培養(yǎng)基:人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基=1:1的混合培養(yǎng)基。
[0161](8)第七天換為完全的人ES培養(yǎng)基。
[0162](9 )在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)7天后，加條件培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基為用人ES培養(yǎng)基培養(yǎng)飼養(yǎng)層細(xì)胞一天的培養(yǎng)基。隔天換液一次。
[0163](10)在20天左右出現(xiàn)敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞克隆，記為第一代敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞。
[0164](11) 25天左右用機(jī)械方法將克隆挑出；
[0165](12)第一代-第三代敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞代利用機(jī)械方法傳代，之后可換為lmg/ml的dispase(分散酶)化學(xué)消化傳代，冷凍。
[0166]試驗(yàn)例I小鼠iPS細(xì)胞堿性磷酸酶染色試驗(yàn)
[0167](I)重編程14天時(shí)，將已經(jīng)有克隆的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液洗掉，用PBS洗兩次。在2%多聚甲醛中固定2min，用PBS洗2次。
[0168](2)加入顯色液避光顯色15min。
[0169](3)再用 PBS 洗 2 次。
[0170](4)計(jì)數(shù)紫色克隆數(shù)，克隆效率就是克隆數(shù)除以轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)。
[0171]顯色液來自StemTAG?Alkaline Phosphatase Activity AssayKit (Colorimetric),主要成分是 p-Nitrophenol (對硝基苯酌0。
[0172]如圖1和圖2所示，WT代表野生型，p53+、p21+、PUMA+分別代表敲除相應(yīng)基因形成的iPS細(xì)胞。從圖中可以看出，敲除p53+、p21+、PUMA+都能提高iPS細(xì)胞形成率，但與野生型的iPS細(xì)胞相比，PUMA+小鼠iPS細(xì)胞形成率最高。
[0173]試驗(yàn)例2PUMA+小鼠iPS細(xì)胞的多能性基因鑒定[0174]4%多聚甲醛PFA配制:1)稱取4g PFA(有毒，注意防護(hù))，置于三角燒瓶或燒杯中。2)加入50-80ml DPBS (杜氏磷酸緩沖液)，加熱至60°C左右，磁力攪拌使粉末完全溶解。3)通常加入幾滴IN NaOH可以使溶液清亮。4)最后補(bǔ)足PBS于100ml，充分混勻。
[0175](I)第一天，按常規(guī)方法將凍存的飼養(yǎng)層細(xì)胞，放入39°C的水浴鍋中，快速解凍，按上述細(xì)胞密度接種于鋪有0.1%的Gelatin (明膠)的12孔板中。
[0176](2)第二天將培養(yǎng)的PUMA+小鼠iPS細(xì)胞按人ES細(xì)胞方法進(jìn)行傳代，將消化好的細(xì)胞傳至預(yù)先鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的12孔板中。
[0177](3)細(xì)胞大約3天時(shí)狀態(tài)比較好(分化細(xì)胞較少，細(xì)胞足夠大)，將長好的PUMA+小鼠iPS細(xì)胞用PBS洗滌2次，每次5min。
[0178](4) 4%多聚甲醒室溫固定15min。
[0179](5)?83洗滌3次，每次511^11。
[0180](6)用含 0.1% 的 Triton-X-1OO 透膜 IOmin0
[0181](7)卩85浸泡511^11。
[0182](8)將幾個(gè)孔中加入山羊血清工作液，室溫封閉15min。
[0183](9)吸出山羊血清工作液后，每孔分別加入稀釋好的anti_Sox2 (1:300)，ant1-SSEA-l (1:500), ant1-Nanog(1:100), anti_0ct4 (1:200)抗體工作液 50 μ 1,4 °C 過夜。
[0184](10)吸出液體，然后用PBS洗滌3次，每次5min。
[0185](11)每孔再加入相對應(yīng)的二抗 Alexa FLuor488Donkeny Ant1-rabbit IgG 或Alexa555-conjugated goat ant1-mouse IgM/IgG (1:1000),室溫避光孵育 lh。
[0186](12)吸出液體，PBS洗滌3次，每次5min。
[0187](13) DAPI 復(fù)染,5min。
[0188](14) PBS洗滌兩次，然后用蒸餾水沖洗后晾干。
[0189](15)熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。
[0190]如圖3所不，圖Al標(biāo)記的是0ct4基因，圖A2標(biāo)記的是Nanog基因，圖A3標(biāo)記的是Sox2基因，圖A4標(biāo)記的是SSEA-1基因，PUMA+小鼠iPS細(xì)胞能像ES細(xì)胞一樣表達(dá)4個(gè)標(biāo)記基因。
[0191]試驗(yàn)例3畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)
[0192](I)選取核型鑒定為正常染色體的PUMA+小鼠iPS細(xì)胞，核型鑒定正常染色體的比例大于80%為可用的PUMA+小鼠iPS細(xì)胞，傳代培養(yǎng)擴(kuò)增核型鑒定合格的PUMA+小鼠iPS細(xì)胞，擴(kuò)增至約兩個(gè)IOOmm皿。
[0193](2)用trypsin (胰蛋白酶)消化細(xì)胞。
[0194](3)將消化好的PUMA+小鼠iPS細(xì)胞收集到15ml離心管中，1000rpm離心5min,
棄掉上清。
[0195](5)加入Knockout DMEM重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，調(diào)至終濃度為2χ106/100 μ I左右。
[0196](7)用Iml注射器吸取100 μ I細(xì)胞懸液，注射到SCID小鼠腹股溝皮下。
[0197](8)1個(gè)月左右可見SCID小鼠皮下形成畸胎瘤。
[0198](9)將長畸胎瘤的小鼠處死后，用剪刀小心的在腫瘤四周將腫瘤剝離下來(注意不要碰到腫瘤組織，以免破壞腫瘤的結(jié)構(gòu))。[0199](10)將切下的腫瘤組織，放入10%甲醛溶液中固定24h后，進(jìn)行石蠟包埋和組織切片。
[0200](11)將組織切片進(jìn)行H.E染色來確定腫瘤的組織形態(tài)。
[0201]如圖4所示，圖4A為外胚層，圖4B為中胚層，圖4C為內(nèi)胚層，PUMA+小鼠iPS細(xì)胞能使小鼠形成正常的畸胎瘤。
[0202]試驗(yàn)例4嵌合體小鼠形成試驗(yàn)
[0203](I)第一天下午5點(diǎn)左右給8-10周的雌性BDFl小鼠腹腔注射IOU PMSG催卵。
[0204](2)48h后給予打過PMSG的母鼠繼續(xù)打IOU HCG,并立刻將打過的母鼠置于公鼠籠內(nèi)進(jìn)行交配。同時(shí)將ICR母鼠置于結(jié)扎的公鼠籠內(nèi)，進(jìn)行交配。
[0205](3)第四天上午去檢查母鼠陰道口是否有陰道栓，并將具有陰道栓的小鼠收集，備用。
[0206](4)第五天檢查ICR母鼠陰道口是否有陰道栓，然后將具有陰道栓的母鼠視為代孕母鼠取出備用。
[0207](5)取3.5天的囊胚:用C02猝死方法殺死具有陰道栓的BDFl母鼠，取出子宮后將0.5ml囊胚培養(yǎng)基(H-CZB)用Iml針筒注射入子宮腔內(nèi)沖出囊胚，并移入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0208](6)準(zhǔn)備iPS細(xì)胞進(jìn)行囊胚注射:細(xì)胞狀態(tài)最好的時(shí)候，消化貼壁離心，去除飼養(yǎng)層細(xì)胞并吹打成單細(xì)胞后，用 少量DMEM重懸，放于冰上備用。
[0209](7)10-15個(gè)多功能干細(xì)胞被注射到擴(kuò)張的E3.5囊胚(來自BDFl XBDFl)中，體外恢復(fù)5min之后，放入37° C，5%C02的培養(yǎng)箱中恢復(fù)3h。
[0210](8)將恢復(fù)后的好的囊胚移植到假孕見栓2.5天的小鼠(ICR)子宮內(nèi)，每側(cè)子宮移植15個(gè)左右的胚胎。
[0211](9)移植后19天時(shí)，假孕小鼠會生下嵌合體小鼠(毛色黑白相間)，如圖5所示，通過毛色對比觀察小鼠的嵌合率，從而確定iPS的多能性。因?yàn)閕PS細(xì)胞來自C57背景(毛色為黑色)，而囊胚來自ICR小鼠(毛色為白色)，如果嵌合體黑色比例較高，說明iPS嵌合率較高，即iPS分化的細(xì)胞類型更多。
[0212]試驗(yàn)例5細(xì)胞核型鑒定
[0213]準(zhǔn)備配置:1)低滲液配制:0.4%氯化鉀用時(shí)放入37°C水中預(yù)熱。2)固定液配制:甲醇:冰醋酸=3:1，現(xiàn)用現(xiàn)配。3)G顯帶消化液配制:胰酶(Sigma G4507-5G) 30mg，加入
0.9% 生理鹽水(or D-Hanks) 50ml 中，用時(shí) 37°C水浴 30min。
[0214]具體步驟為:
[0215](I)當(dāng)iPS細(xì)胞大小合適時(shí)，約傳代2天時(shí)，加入0.25g/ml的秋水仙素處理細(xì)胞
3.5h。
[0216](2)配低滲液:0.4%氯化鉀現(xiàn)用現(xiàn)配，每個(gè)細(xì)胞系用5mL，并在水浴鍋中預(yù)熱胰酶(每個(gè)細(xì)胞系約500 μ I胰酶)和低滲液。
[0217](3)加入0.025%的胰酶消化，加入小鼠干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行中和，將中和后的細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞，800rpm離心5min后，棄上清，收獲細(xì)胞。
[0218](4)將收獲的細(xì)胞中加入預(yù)熱的低滲液51ml，37°C中，低滲5min，同時(shí)配固定液:甲醇與冰醋酸按3:1配，現(xiàn)用現(xiàn)配，每個(gè)細(xì)胞系為7mL。[0219](5)預(yù)固定，加固定液7滴，輕輕以氣泡沖勻，800rpm離心5min。
[0220](6)固定:去上清，加入固定液4ml,輕輕以氣泡沖勻，固定40min,800rpm離心5min,去上清,加固定液2ml,第二次固定20min (這兩步固定都可以4°C或室溫過夜)。
[0221](7)滴片:800離心5min，去上清，加入新鮮固定液4滴，氣泡沖勻，即可進(jìn)行滴片2-3 張。
[0222](8)滴片時(shí)將細(xì)胞懸液1-2滴，滴到預(yù)先遇冷過的4°C冰水或干燥的潔凈玻片上，晾干。
[0223](9)放入65°C烤箱中烘烤過夜。 [0224](10)染色:第二天取出烤干的載玻片加入I滴Giemsa原液，15s后，加入2滴稀釋后的磷酸緩沖液(磷酸緩沖液的稀釋為:1份磷酸緩沖液原液加上9份等體積的蒸餾水)，并用吸耳球吹打均勻后，進(jìn)行染色，染色時(shí)間為室溫IOmin, IOmin后用流水輕輕清洗,室溫晾干后進(jìn)行核型分析，在一組實(shí)驗(yàn)中，我們隨機(jī)選擇20個(gè)以上的細(xì)胞中期分裂相進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)核型的正確率，核型正確率大于80%的為核型正?？捎玫募?xì)胞。
[0225](11)核型顯帶:將配好的消化液放入37°C水浴中30min,并加入3%Trisl.5ml(PH=7.6)。
[0226](12)放入烤后的片子，30s-50s (每個(gè)地方條件不一樣，較干燥的地方時(shí)間較短)后，取出片子迅速放入干凈清水中洗掉胰酶，用Giemsa染液室溫lOmin。然后用流水輕輕清洗，室溫晾干后就可以進(jìn)行核型分析，結(jié)果如圖6所示，PUMA+小鼠iPS細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性與野生型的iPS細(xì)胞相比無顯著性差異P < 0.05，p53+和p21+的iPS細(xì)胞的基因組的穩(wěn)定性和野生型的iPS細(xì)胞相比有顯著性差異P < 0.05，試驗(yàn)結(jié)果說明，敲除PUMA基因能夠保護(hù)小鼠iPS細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性。
[0227]試驗(yàn)例6人iPS細(xì)胞形成率的測定
[0228](I)稀釋抗體:TRA-1-60 抗體(1:300)和 Alexa Fluor555_conjugated 二抗(1:500)稀釋到人ES培養(yǎng)基里。
[0229](2)含有克隆的6孔板中，吸掉培養(yǎng)基，PBS洗一遍，每孔加入0.5ml含有抗體的人ES培養(yǎng)基，37° C，5%C02培養(yǎng)箱中孵育lh。
[0230](3)吸掉培養(yǎng)基，每孔加入Iml PBS洗一遍。
[0231](4)每孔加入Iml人ES培養(yǎng)基，在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)陽性克隆數(shù)。iPS形成效率就是將克隆數(shù)除以電轉(zhuǎn)細(xì)胞數(shù)。
[0232]如圖7所示，慢病毒shPUMA#l和shPUMA#2能敲降人iPS細(xì)胞的PUMA基因的表達(dá)，如圖8所示，將慢病毒shPUMA#l和shPUMA#2敲降人PUMA基因后，能夠提高人iPS細(xì)胞的形成率，且人iPS細(xì)胞的形成率與人PUMA功能的抑制程度成正比。
[0233]用慢病毒shRNA抑制人PUMA的表達(dá)但對基因組的穩(wěn)定性沒有影響，敲降PUMA功能在小鼠iPS細(xì)胞核型鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表明其對iPS細(xì)胞基因組穩(wěn)定性具有很好的保護(hù)作用。以上對本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)PUMA+(PUMA基因敲除)或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF的制備、傳代、凍存； (2)DH5 α 大腸桿菌株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 PMX-0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和 PMX-KLF4，并進(jìn)行質(zhì)粒小提和質(zhì)粒大提； (3 )逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝、滴度測定與凍存:將攜帶有PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒引入包裝細(xì)胞Plat-E細(xì)胞中，回收在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并進(jìn)行滴度測定與凍存； (4)PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF的重編程 將步驟(3)中的攜帶有PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染步驟(1)得到的PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF，并用飼養(yǎng)層細(xì)胞支持培養(yǎng)感染的PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF，連續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)的克隆為PUMA+ 或 PUMA_/+ 小鼠 iPS 細(xì)胞； (5)敲降PUMA功能的人成纖維細(xì)胞的重編程 將人 PUMA shRNA (載體 Plk0.1)和攜帶有人 PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒引入包裝細(xì)胞Plat-E中，回收在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的病毒載體，并將回收的病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，并用飼養(yǎng)層細(xì)胞支持培養(yǎng)感染的人成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)7天后，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)的克隆為敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法，其特征在于:所述步驟(1)中的具體步驟為:取8-10周的PUMA+或PUMA_/+小鼠，按2:1的雌雄比例合籠，處死孕期為13.5天的孕鼠，將小鼠胚胎從子宮中剝離，去除頭和內(nèi)臟組織，將單個(gè)胚胎的軀干，剪碎至糊狀，胰酶消化，F(xiàn)M重懸，培養(yǎng)24-48h后，將MEF細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行傳代，2 XFM凍存液凍存PO代、Pl或P2代細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法，其特征在于:所述步驟(3)的具體步驟為:每IOOmm皿接種8xl06_lxl07個(gè)Plat-E細(xì)胞，融合度達(dá)到90%時(shí)，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液換成5ml新鮮DMEM+10%FBS，制備質(zhì)粒和lipofectamine2000 混合液，10 μ I lipofectamine2000 與 500 μ I OPT1-MEM 混合，室溫放置 5min，攜帶有 PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和 PMX-KLF44 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒各 10 μ g與500 μ I OPT1-MEM混合，室溫放置5min，將上述兩種液體輕輕混合，室溫靜置20min，將混合液逐滴加入IOOmm皿中，Iml/皿，混勻，培養(yǎng)6_8h后換新鮮的DMEM+10%FBS分別在培養(yǎng)后48h和72h收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清并濃縮，收集的部分逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行滴度測定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法，其特征在于:所述步驟(4)的具體步驟為:將PUMA-/_*PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF，種在IOOmm的皿中，第2天，根據(jù)所測病毒滴度，計(jì)算病毒載體所用的量，將步驟(3)中得到的攜帶有PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體加入到IOOmm皿中，并加入polybrene至終濃度為6 μ g/ml或加入5ml逆轉(zhuǎn)錄病毒載體+ImlFBS+6 μ I的8 μ g/ml的polybrene，感染12h后，換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿后，將感染的PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF細(xì)胞，按常規(guī)方法消化傳代至鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為IxlO5/孔，培養(yǎng)基為小鼠ES培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)的克隆為PUMA+或PUMA_/+小鼠iPS細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抑制PUMA功能改善iPS細(xì)胞建立功效的方法，其特征在于:所述步驟(5)的具體步驟為^fAPUMA shRNA(載體Plk0.1)和攜帶有人PMX_0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒引入包裝細(xì)胞Plat-E中，回收在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的病毒載體，并將回收的病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基為EMDM+10%FBS，連續(xù)兩天，兩次病毒轉(zhuǎn)染，感染第三天后更換為人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞長滿后，轉(zhuǎn)移至鋪好飼養(yǎng)層細(xì)胞的IOOmm培養(yǎng)皿中，利用人成纖維培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)天后換為人ES培養(yǎng)基:人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基=1:1的混合培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)天換為完全的人ES培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天后，加條件培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基為用人ES培養(yǎng)基培養(yǎng)飼養(yǎng)層細(xì)胞一天的培養(yǎng)基，20天左右出現(xiàn)的克隆為 敲降PUMA功能的人iPS細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/867GK103571794SQ201310306002
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】程濤, 李彥欣 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）