一種分離培養(yǎng)家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分離培養(yǎng)家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟：采集外周血、分離收集得到單個(gè)核細(xì)胞、加入培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、用貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞的混合物進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，可從家禽外周血中分離培養(yǎng)出大量EPCs。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種分罔培養(yǎng)家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及家禽組織與細(xì)胞培養(yǎng)工程領(lǐng)域，特別是一種分離培養(yǎng)家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一類(lèi)具有分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，不僅參與胚胎期血管發(fā)生，也參與出生后血管新生和血管內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過(guò)程。當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)，體循環(huán)中的EPCs在多種因子的作用下遷移到特定的位點(diǎn)進(jìn)行分化增生，促進(jìn)血管修復(fù)。EPCs的血管修復(fù)作用及定向遷移作用使其在心血管疾病治療領(lǐng)域及基因靶向治療領(lǐng)域顯示出了廣泛的應(yīng)用前景，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
[0003]目前，家禽已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一類(lèi)重要試驗(yàn)動(dòng)物，相關(guān)研究為醫(yī)學(xué)研究提供了重要的比較醫(yī)學(xué)知識(shí)。目前已有從家禽骨髓細(xì)胞中分離培養(yǎng)EPCs的報(bào)道，但最新的科學(xué)研究表明，從骨髓細(xì)胞中分離培養(yǎng)的疑似EPCs的細(xì)胞并不是真正意義上的EPCs。
[0004]對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞可獲得EPCs。目前常用的方法是:利用淋巴細(xì)胞分離液富集外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含有胎牛血清和多種生長(zhǎng)因子的EGM-2或EGM-2MV培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，24h后徹底去除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)后可獲得EPCs。也有研究表明培養(yǎng)非貼壁細(xì)胞可獲得EPCs。但經(jīng)我們多次探索后發(fā)現(xiàn)，單純培養(yǎng)貼壁細(xì)胞或非貼壁細(xì)胞均難以成功獲得家禽EPCs，表明分離培養(yǎng)哺乳動(dòng)物EPCs的方法并不適用于分離培養(yǎng)家禽EPCs。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供`一種分離培養(yǎng)家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法。
[0006]一種分離培養(yǎng)家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)選取20日齡健康肉雞，翅下靜脈采集外周血；
(2)用L-DMEM培養(yǎng)基按體積比1:1稀釋外周血后，再按體積比1:1緩慢滴加到雞淋巴細(xì)胞分離液中，2000 rpm離心15min后棄上清液,收集得到單個(gè)核細(xì)胞；
(3)將收集到的單個(gè)核細(xì)胞用L-DMEM培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，收集細(xì)胞，用EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；所述EGM-2培養(yǎng)基含有體積百分比為10%的胎牛血清、100 IU/mL雙抗以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 ;
(4)分別將單個(gè)核細(xì)胞按5X IO7個(gè)/孔、I X IO7個(gè)/孔和I X IO6個(gè)/孔的量種植于用50 u g/ml濃度的鼠尾膠原蛋白預(yù)先包被過(guò)的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置39°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)；每24h半量換液一次；5天后每24 h換液一次,7天后每48h換液一次直到傳代。
[0007]本發(fā)明對(duì)家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化等過(guò)程，和培養(yǎng)液的成分進(jìn)行了改進(jìn)。根據(jù)本發(fā)明家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，用貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞的混合物進(jìn)行培養(yǎng)，可從家禽外周血中分離培養(yǎng)出大量EPCs。所建立的家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞模型可用于家禽血管修復(fù)機(jī)制、細(xì)胞的發(fā)育與代謝等相關(guān)研究，并為這些研究提供了便利。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1是單個(gè)核細(xì)胞初始接種量對(duì)分離培養(yǎng)EPCs的影響示意圖。其中，A.5X IO7個(gè) / 孔(200X); B.1XlO7 個(gè) / 孔(100X) ; C.1XlO6 個(gè) / 孔(200X)。
[0009]圖2是EPCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖。其中A.3d后細(xì)胞大部分貼壁并開(kāi)始出現(xiàn)梭形細(xì)胞(100X) ; B.細(xì)胞呈克隆性生長(zhǎng)(100X) ; C.7 d后出現(xiàn)大量梭狀細(xì)胞(100X) ; D.10 d后細(xì)胞呈現(xiàn)典型鋪路石樣外觀(100X)。
[0010]圖3是EPCs細(xì)胞雙熒光染色結(jié)果圖。A.陰性對(duì)照；B.Dil-ac-LDL陽(yáng)性細(xì)胞；C.FITC-UEA-1 陽(yáng)性細(xì)胞；D.Dil-ac-LDL 和 FITC-UEA-1 雙陽(yáng)性細(xì)胞(B 和 C 疊加)。
[0011]圖4是EPCs表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果圖。A: CD31、CD133和VEGFR-2 mRNA的表達(dá)；B: CD34 mRNA 的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0013]實(shí)施例1 I材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
20日齡健康A(chǔ)A肉雞。
`[0014]細(xì)胞培養(yǎng)板的處理
實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)板用50 y g/ml濃度的鼠尾膠原蛋白進(jìn)行包被，對(duì)照組培養(yǎng)板不經(jīng)過(guò)包被直接使用。
[0015]外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離
于肉雞翅下靜脈采集外周血20ml，EDTA抗凝，用L-DMEM培養(yǎng)基按體積比1:1稀釋后，再按1:1體積比緩慢疊加到雞淋巴細(xì)胞分離液上層。2000 rpm離心15min后,收集單個(gè)核細(xì)胞。
[0016]誘導(dǎo)生長(zhǎng)及初始種植細(xì)胞濃度對(duì)EPCs生長(zhǎng)的影響
將收集到的單個(gè)核細(xì)胞用L-DMEM培養(yǎng)基離心洗滌1-2次(1500rpm、每次5min)。收集細(xì)胞，用含有10% (v/v)胎牛血清、100 IU/mL雙抗(100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-KIGF-1)的EGM-2培養(yǎng)基(EGM-2 BulletKit ;生產(chǎn)廠家:美國(guó)Lonza公司，產(chǎn)品貨號(hào):CC-3162)重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。
[0017]分別將單個(gè)核細(xì)胞按5 X IO7個(gè)/孔、I X IO7個(gè)/孔和I X IO6個(gè)/孔的量種植于預(yù)先處理好的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置39°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。每24h半量換液一次，換液時(shí)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，靜置3~5min后,用移液器小心移除培養(yǎng)基上層1/2的液體，以保留未貼壁細(xì)胞。5d后每24 h換液一次，7d后每48h換液一次直到傳代。
[0018]鑒定
1.5.1形態(tài)學(xué)觀察分別于培養(yǎng)后第3、7、10和14d，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。
[0019]和FITC-UEA-1 攝取試驗(yàn)
EPCs 具有攝取 Dil acetylated low density lipoprotein (Dil-ac-LDL)和 FlTOOxytropislectin I (FITC-UEA-1)的能力，根據(jù)這一特性可鑒定EPCs。取第2代細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后重新種植于24孔板，待細(xì)胞貼壁后棄掉培養(yǎng)基，加入10 u g/ml Dil-ac-LDL于39°C下孵育4h。棄掉液體，用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定15min。棄掉液體，用PBS洗3次，加入IOii g/ml FITC-UEA-1常溫下孵育lh，熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照。
[0020]表面標(biāo)志物檢測(cè)
目前認(rèn)為，CD34、CD133和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體_2 (VEGFR-2)可作為鑒定EPCs的表面標(biāo)志。CD31是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志，這一標(biāo)志也常用于鑒定EPCs。本實(shí)驗(yàn)觀察了培養(yǎng)細(xì)胞是否表達(dá)上述表面標(biāo)志。收集第2代細(xì)胞，采用Trizol試劑提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板擴(kuò)增CD31、CD34、CD133和VEGFR-2基因(引物序列見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)總體積為20iU，反應(yīng)體系為:10XPCR Buffer 2W、dNTP Mix(IOmM) 0.5耵、MgCl (25mM) 1.2耵、ddH20 13.叫1、上下游引物各 0.5耵、cDNA 模板 1耵、0.5UM Taq 酶 0.4W。反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s ;55~58°C退火 30s ；72°C延伸30s ；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min ;4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用Tanon凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。
[0021]表1.PCR引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種分離培養(yǎng)家禽內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)選取20日齡健康肉雞，翅下靜脈采集外周血； (2)用L-DMEM培養(yǎng)基按體積比1:1稀釋外周血后，再按體積比1:1緩慢滴加到雞淋巴細(xì)胞分離液中，2000 rpm離心15min后棄上清液,收集得到單個(gè)核細(xì)胞； (3)將收集到的單個(gè)核細(xì)胞用L-DMEM培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，收集細(xì)胞，用EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；所述EGM-2培養(yǎng)基含有體積百分比為10%的胎牛血清、100 IU/mL雙抗以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 ; (4)分別將單個(gè)核細(xì)胞按5 X IO7個(gè)/孔、I X IO7個(gè)/孔和I X IO6個(gè)/孔的量種植于用，50 u g/ml濃度的鼠尾膠原蛋白預(yù)先包被過(guò)的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置39°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)；每24h半量換液一次；5天后每24 h換液一次,7天后每48h換液一次直到傳代。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103484423SQ201310308919
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】譚勛, 畢師誠(chéng) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)