基于lamp的桃內(nèi)標準基因快速檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測試劑及方法，具體是針對桃內(nèi)標準基因葉綠素a/b結(jié)合蛋白（Lhcb2）基因設(shè)計LAMP引物，成功篩選出了一套LAMP引物，將該套引物用于LAMP定性檢測和基于SYBR?Green?I的LAMP定量方法檢測，同時提供了相應(yīng)技術(shù)的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒由引物、反應(yīng)液、Bst?DNA聚合酶、顯色劑等組成，檢測方法包括基因組的提取、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增以及顯色反應(yīng)，操作簡便、靈敏度高、反應(yīng)快速、肉眼判定結(jié)果等優(yōu)點，為桃內(nèi)標檢測提供了有效、快速的檢測方法。結(jié)果表明，該引物檢測桃內(nèi)標準基因的靈敏度可達到10pg。定量結(jié)果標準曲線線性關(guān)系良好。該發(fā)明將為果汁摻假檢測提供技術(shù)支持。
【專利說明】基于LAMP的桃內(nèi)標準基因快速檢測試劑盒及其檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測試劑及方法，具體是指基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)鑒定桃內(nèi)標準基因的定性和定量方法的建立。

【背景技術(shù)】
[0002]LAMP技術(shù)是2000年Notomi T等發(fā)明的一種新的體外恒溫核酸擴增方法。LAMP方法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4-6條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase, large fragment)在恒溫條件(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)，由于針對靶基因6個獨立區(qū)域設(shè)計引物，可以在Ih之內(nèi)，將靶DNA片段擴增109至1010倍。如果設(shè)計環(huán)引物，將其用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)中，擴增速率大大加快，時間可縮短至15_30mino
[0003]本發(fā)明以桃作為對象，對已經(jīng)確定的桃內(nèi)標準基因葉綠素a/b結(jié)合蛋白(Lhcb2)基因(EF127291.1)設(shè)計環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物，建立桃內(nèi)標準基因等溫擴增方法，為水果源成分的分子生物學(xué)檢測提供一種快速簡便的方法。由于果汁及其飲料屬于深加工產(chǎn)品，樣品中的DNA經(jīng)過一系列的加工步驟以及物理化學(xué)處理過程，易發(fā)生大量斷裂、降解甚至破壞，提取的DNA模板片段會比較小，LAMP方法的擴增區(qū)域為200bp左右，由于LAMP方法使用4條引物識別靶序列的6個區(qū)域，具有較高的特異性，因而LAMP方法非常適于果汁等加工品的檢測。該發(fā)明可為今后水果源成分的鑒定提供技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了建立了一種檢測桃內(nèi)標準基因的新型、快速的方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法，本發(fā)明提供了一套定性和定量檢測均具有較高的靈敏度的引物。根據(jù)上述引物建立了完整的檢測方法，同時提供了相應(yīng)的試劑盒。該方法具有靈敏度高、操作簡單、快速、準確等優(yōu)點，使用普通的定量PCR儀、水浴鍋及恒溫培養(yǎng)箱等即可在Ih內(nèi)完成檢測?？蔀楣瓝郊贆z測提供技術(shù)支持。
[0005]本發(fā)明提供的用于桃內(nèi)標準基因檢測的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的引物。根據(jù)桃葉綠體a/b結(jié)合蛋白(Lhcb2) (EF127291.1)基因使用日本榮巖株式會社環(huán)介導(dǎo)引物在線設(shè)計軟件 LAMP primer designing software primerexplorer V4.0 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html )設(shè)計并篩選出了 I套引物，包括兩條外引物(peach863_F3/peach863_B3)、兩條內(nèi)引物(peach-FIP/peach-BIP)，該引物組對于檢測桃內(nèi)標準基因具有特異性。
[0006]上述引物的核苷酸序列分別為: peach-F3:ATTGCACCAATTTGCCAG peach-B3:TGACTATGCTCTCCTGTTC peach-FIP:CACATCAGCAACATTCTATTGGTTC- ACCTCTCTCTCACTAGAACApeach-BIP:ATCCACAACATCTTCACATTCCC_
GGCCTAATGAGATGCCTTG
根據(jù)上述引物設(shè)計的檢測方法，采用以下技術(shù)方案:
1、樣品的制備和模板的提取:將樣品在液氮中磨成粉末，稱20mg± Img樣品，用CTAB方法提取基因組。
[0007]2、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增:配置反應(yīng)體系，總體積25 μ L，包括:1.4-2.0mM dNTP、2_8mMMgS04、0.6-1.0M 甜菜喊，1.6 μ M 外引物(peach -F3, peach _Β3)、0.2μΜ 內(nèi)引物(peach-FIP, peach _ΒΙΡ)、3.2-8.0U Bst DNA 聚合酶、Ix Thermopol buffer (包含:20mMTris-HCl (pH 8.8 i 25°C )，10 mM KCl, 1mM (NH4) 2S04, 2 mM MgS04, 0.1%.TritonX-100)。進行擴增反應(yīng)。
[0008]3、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物的檢測:
3.1電泳法:將LAMP擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如電泳圖呈現(xiàn)LAMP典型的階梯狀條帶，則樣品中有目的基因，若電泳圖無任何條帶則為陰性。
[0009]3.2染色法:W；VSYBR Green I，觀察顏色變化:在反應(yīng)管中加入I μ L SYBR Green
I(1000X),混勻后觀察顏色變化，若顏色變?yōu)榫G色，則樣品中有目的基因，若顏色仍保持SYBR Green I的橙色，則為陰性。
[0010]本發(fā)明的第三個目的提供了快速診斷試劑盒，包括所述的引物組、上述檢測方法的反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶以及一張陽性定量標準曲線。
[0011]其中引物組由體積比為1:1:8:8的上下游外引物和上下游內(nèi)引物組成。反應(yīng)液是由體積比為 5:8:1:8 的 Ix Thermopol buffer、1.4-2.2mM dNTP、3_9mM MgS04、0.4-1.0M 甜菜堿組成。Bst DNA聚合酶每微升含3-8個活性單位。還有20X SYBR GREEN I熒光染料，稀釋到1000X后可作為顯色劑。以及一份定量標準曲線圖
本發(fā)明所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測含桃樣品具有以下優(yōu)點:
1、反應(yīng)快速，一般情況下在15-30min即可有大量的擴增產(chǎn)物生產(chǎn)，為了保證檢測的準確度，本發(fā)明選擇反應(yīng)時長為40min，在此時間內(nèi)即可將模板擴增109倍，該方法操作簡便，適于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速檢測。
[0012]2、特異性好，該技術(shù)對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計引物，引物具有更高的特異性。
[0013]3、靈敏度高，該技術(shù)反應(yīng)速度快，對于痕量目的基因可以達到很好的檢測效果，靈敏度比PCR方法高一到兩個數(shù)量級，該技術(shù)為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)督檢測提供了技術(shù)支持。
[0014]4、操作簡單，適于基層使用。本發(fā)明設(shè)計了檢測桃內(nèi)標的試劑盒，操作簡單，不需要專業(yè)人員操作，結(jié)果易于觀察，非常適于基層檢測使用。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1引物驗證與引物酶切驗證圖，A從左至右分別為泳道1-3:產(chǎn)物酶切條帶；泳道4:10 倍稀釋產(chǎn)物；M: DNA marker DL2000。
[0016]圖2LAMP定性靈敏度試驗電泳圖，從左至右分別為105，104，103，102，10 pg基因組。
[0017]圖3LAMP定量靈敏度試驗-擴增曲線。
[0018]圖4LAMP定量靈敏度試驗-標準曲線。

【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0020]實施例1桃內(nèi)標檢測方法的建立
1.實驗材料收集自市場的桃葉
2.模板的制備:
基因組提取采用CTAB方法，并將濃度調(diào)整為10ng/ μ L。然后將此濃度的基因組按10倍濃度進行梯度稀釋為104，103，102，10 pg/μ L，制備成系列梯度濃度的標準DNA模板。
[0021]3.引物合成:
引物由上海生工生物有限公司合成，配制成10 μ M使用液。
[0022]4.LAMP擴增反應(yīng)體系:
總體積 25 μ L，包括:1.4-2.0mM dNTP、2_8mM MgS04、0.6-1.0M 甜菜堿，1.6μΜ 外引物(peach -F3, peach _Β3)、0.2μΜ 內(nèi)引物(peach -FIP, peach _BIP)、3.2-8.0U Bst DNA聚合酶、Ix Thermopol buffer (包含:20mM Tris-HCl (pH 8.8 i 25°C ), 10 mM KCl,1mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0.1%.Triton X-100)?
[0023]LAMP定性擴增反應(yīng)程序:
65°C反應(yīng)40min，85°C放置3min，終止反應(yīng)。
[0024]5.LAMP定量擴增反應(yīng)體系:
總體積 25 μ L，包括:1.4-2.0mM dNTP、l_8mM MgS04、0.6_1.2M 甜菜堿，1.6μΜ 外引物(M0N863-F3，M0N863-B3)、0.2μΜ 內(nèi)引物(M0N863-FIP, Μ0Ν863_ΒΙΡ)、3.2-8.0U Bst DNA 聚合酶、Ix Thermopol buffer (包含:20mM Tris-HCl (pH 8.8 i 25°C), 10 mM KCl, 1mM(NH4) 2S04, 2 mM MgS04, 0.1%.Triton X-100), I μ L 20x SYBR Green I, ddH20 補足至25 μ Lo
[0025]LAMP定量擴增反應(yīng)程序為:
64°C反應(yīng) 3 min, 50 個循環(huán):64°C 30 s,64°C 30 S。
[0026]6.結(jié)果分析
6.1擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示為LAMP典型的階梯狀條帶，在EcoR V位點，通過計算，酶切產(chǎn)物大小為99bp和91bp，酶切結(jié)果與預(yù)期相符(圖1).6.2五個不同桃基因組DNA濃度(105，104，103，102，10pg/>L)的樣品，都可以被檢測到(圖2)，這說明最低檢測限為10pg。
[0027]6.3檢測靈敏度的五個不同桃基因組濃度(105，104，103，102，10pg/>L)的樣品，都可以被檢測到(圖3)。這說明最低檢測限為10pg。
[0028]實施例2桃內(nèi)標試劑盒的制備
本發(fā)明所提供的試劑盒由一套引物組、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、顯色劑以及一張陽性定量標準曲線等組成。
[0029]1.試劑盒中的引物為: peach-F3:ATTGCACCAATTTGCCAG peach-B3:TGACTATGCTCTCCTGTTC peach-FIP:CACATCAGCAACATTCTATTGGTTC-ACCTCTCTCTCACTAGAACA
peach-BIP:ATCCACAACATCTTCACATTCCC_
GGCCTAATGAGATGCCTTG
2.反應(yīng)液是由體積比為5:8:1:8 的 Ix Thermopol buffer、1.4-2.2mM dNTP、3_9mMMgS04、0.4-1.0M 甜菜堿組成；其中 Ix Thermopol buffer 含有 20mM Tris-HCl (pH 8.8 i25°C )，10 mM KCl, 1mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0.1%.Triton X-100
3.Bst DNA聚合酶為Bst DNA polymerase，每微升含3-8個活性單位；還有SYBRGREEN I熒光染料，稀釋到后可作為顯色劑。
[0030]實施例3試劑盒檢測桃內(nèi)標
1.實驗材料:農(nóng)夫果園混合果汁
2.樣品的制備和模板的提取:取樣品10ml，12000r/min離心10min，沉淀用CTAB方法提取基因組。
[0031]3.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增:在200 μ LPCR管中配置反應(yīng)體系，引物混合物9 μ L，反應(yīng)液13 μ L，Bst DNA聚合酶8U，DNA模板I μ L，ddH201 μ L，蓋緊管蓋，65 °C水浴鍋中反應(yīng)40min。
[0032]4.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物的檢測:反應(yīng)結(jié)束后，直接向反應(yīng)液中加入IyL 100xSYBR Green I，混勻，肉眼觀察顏色變化。有擴增反應(yīng)的管顏色變?yōu)榫G色，無擴增反應(yīng)的管仍然保持SYBR Green I的橙色。
[0033]5.環(huán)介導(dǎo)等溫定量擴增:在200 μ LPCR管中配置反應(yīng)體系，引物混合物9 μ L，反應(yīng)液13 μ L，Bst DNA聚合酶8U，DNA模板I μ L，ddH201 μ L，蓋緊管蓋放于定量PCR中，650C 3min，50 循環(huán)[65°C 30s, 65°C 30s]。
[0034]6.環(huán)介導(dǎo)等溫定量擴增產(chǎn)物的檢測:將樣品測得的Ct值代入在標準曲線方程中，算出樣品的濃度。根據(jù)單倍體桃分子的分子質(zhì)量約為0.55 pg，計算得出每毫升果汁中桃成分的拷貝數(shù)約為270。
【權(quán)利要求】
1.一種桃內(nèi)標準基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成: 上游外引物，peach-F3:ATTGCACCAATTTGCCAG 下游外引物，peach-B3:TGACTATGCTCTCCTGTTC 上游內(nèi)引物，peach-FIP:CACATCAGCAACATTCTATTGGTTC-
ACCTCTCTCTCACTAGAACA 下游內(nèi)引物，peach-BIP:ATCCACAACATCTTCACATTCCC-
GGCCTAATGAGATGCCTTG。
2.一種桃內(nèi)標的檢測方法，其特征在于，以桃葉綠體a/b結(jié)合蛋白(Lhcb2)(EF127291.1)基因為靶基因，通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法用權(quán)利要求1所述的檢測引物對樣品的DNA選擇性擴增所述的靶基因片段，確認是否存在有擴增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的桃內(nèi)標的檢測方法，其特征在于，該檢測方法具體為: (1)模板的提取:將樣品在液氮中磨成粉末，稱20mg±lmg樣品，用CTAB方法提取基因組。 (2) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增體系包括:1.4-2.0mM dNTP、2_8mM MgS04、0.6-1.0M 甜菜堿，0.2-1.6μΜ 外引物(peach_F3, peach_B3)、0.2 μ M 內(nèi)引物(peach-FIP, peach_BIP)、3.2-8.0U Bst DNA 聚合酶、Ix Thermopol buffer (包含:20mMTris-HCl(ρΗ8.8025°C )，1mM KCl, 1mM(NH4)2S04, 2mM MgS04, 0.1%.Triton X-100)，用ddH20補充體系至25 μ L0定量體系中將I μ L ddH20換成I μ L的20Χ SYBR Green I。 (3)環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)產(chǎn)物的檢測: 利用電泳檢測、熒光檢測環(huán)介導(dǎo)反應(yīng)產(chǎn)物是否有擴增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品為桃葉。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，(2)中定量檢測樣品的最低限度為10pg，并且有標準曲線方程。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的桃內(nèi)標環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速診斷試劑盒，其特征在于，普通定性環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)程序:60-65°C反應(yīng)40min。反應(yīng)所使用的儀器為普通PCRdK浴鍋以及恒溫培養(yǎng)箱。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的桃內(nèi)標環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速診斷試劑盒，其特征在于，定量環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)程序:64°C反應(yīng)3min，50個循環(huán):64°C 30s，64°C 30s。反應(yīng)所使用的儀器為定量PCR。
8.桃內(nèi)標環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如權(quán)利要求I所述的引物組、權(quán)利要求3所述的反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、顯色劑以及一張陽性定量標準曲線。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的桃內(nèi)標環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的引物組由體積比為1:1:8:8的上下游外引物和上下游內(nèi)引物組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的桃內(nèi)標環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于，反應(yīng)液是由體積比為 5:8:1:8 的 Ix Thermopol buffer、1.4-2.2mM dNTP、3_9mM MgSO4>0.4-1.0M甜菜堿組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的桃內(nèi)標環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速診斷試劑盒，其特征在于，Bst DNA聚合酶每微升含3-8個活性單位。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的桃內(nèi)標環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速診斷試劑盒，其特征在于，試劑盒還包 括SYBR GREEN I熒光染料，稀釋后可作為顯色劑，另外還有一份定量標準曲線圖。
【文檔編號】C12Q1/68GK104178558SQ201310312627
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月24日
【發(fā)明者】許文濤, 黃昆侖, 閆興華, 翟百強, 羅云波, 徐瑗聰, 商穎, 董凱 申請人:北京福德安科技有限公司, 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)