一種白念珠菌smt3基因的用途及缺失smt3基因的白念珠菌減毒株的制作方法
【專利摘要】發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種白念珠菌 SMT3 基因的用途及缺失 SMT3 基因的白念珠菌減毒株。本發(fā)明公開了白念珠菌 SMT3 基因的用途，為用于制備 smt3/smt3 缺失株，或者用于制備、篩選白念珠菌治療藥物。本發(fā)明還公開了一種白念珠菌減毒株，所述減毒株中 SMT3 基因不表達。本發(fā)明通過對白念珠菌中 SMT3 基因的敲除，研究了其在細胞周期以及形態(tài)發(fā)生及轉(zhuǎn)換過程中的功能，最后通過小鼠系統(tǒng)感染實驗確立了 SMT3 在白念珠菌毒性表現(xiàn)中的重要功能。
【專利說明】-種白念珠菌SMT3基因的用途及缺失SMT3基因的白念珠 菌減毒株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種白念珠菌SUM0的SMT3基因的用途及缺 失SMT3基因的白念珠菌減毒株。

【背景技術(shù)】
[0002] 白念珠菌（Candidaalbicans)是一種臨床上分離到的一種機會性人體致病真 菌，特別在免疫下調(diào)的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起廣泛的淺 部和深部系統(tǒng)感染，感染部位包括口腔，女性陰道等，引起鵝口瘡，陰道炎等，也可以侵 入表皮和內(nèi)皮細胞進入血液而到達內(nèi)臟器官，如腎臟，腦部等，導致敗血癥，嚴重可以導 致死亡（Odds,F.C. 1994.J.Am.Acad,Dermatol. 31:S2-S5.)。白念珠菌在不同的生長條 件下，有不同的生長形態(tài)，這些不同形態(tài)之間可以在一定條件下進行轉(zhuǎn)換。包括酵母態(tài) (yeastform)，和菌絲態(tài)（hyphae)，以及白菌（whitephase)和灰菌（opaquephase)之 間的轉(zhuǎn)換。這種形態(tài)轉(zhuǎn)化能力直接影響白念珠菌的致病能力（Odds,F.C. 1985.CritRev Microbiol. 12:45-93;Brown,A.J.P.etal. 1999.TrendsMicrobiol. 7:334-338.),形態(tài)轉(zhuǎn) 換能力缺陷的菌株其系統(tǒng)感染能力大大下降或消失（Lo,H.J.etal，Cell90:939-949.)。 白-灰轉(zhuǎn)換首先在臨床上分離的W0-1菌株中發(fā)現(xiàn)。這兩種形態(tài)的菌也具有不同的致病性， 白囷在系統(tǒng)感染中具有較強的致病能力，而灰囷在表皮感染中具有較強的致病能力。因而 白灰轉(zhuǎn)換是念珠菌為了適應(yīng)不同的微環(huán)境而產(chǎn)生的兩種形態(tài)，這兩種形態(tài)對于念珠菌的致 病能力有重要作用。同時，白灰轉(zhuǎn)換對于白色念珠菌實現(xiàn)其交配也是必要的。與釀酒酵母 類似，白色念珠菌為了實現(xiàn)同源重組，需要經(jīng)過一個交配的過程，有研究表明白念珠菌灰菌 形態(tài)交配效率大約是白菌形態(tài)的1〇 6倍，因此，白色念珠菌要實現(xiàn)交配，首先要進行白灰轉(zhuǎn) 換，由白菌轉(zhuǎn)換為灰菌形態(tài)，才可以實現(xiàn)交配。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)已通過功能互補的方法找到了調(diào)控白色念珠菌白灰轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵性因子， Worl(White-OpaqueRegulatorl)，Worl在念珠菌白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作 用。在隨后的Worl調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究中，我們通過酵母雙雜交篩選并且鑒定了一些與之相互作 用的蛋白，其中包括兩個含有特征性的SP-RING結(jié)構(gòu)的SUMOE3連接酶。
[0004] SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier,小泛素相關(guān)修飾物）是二十多年前 發(fā)現(xiàn)的一種可逆的蛋白翻譯后修飾，在此之后，許多參與SUM0化修飾以及去SUM0化過程的 酶被發(fā)現(xiàn)和鑒定。與此同時，對于SUM0化底物的尋找也得出一系列可以發(fā)生SUM0化修飾 的蛋白，這些蛋白參與到細胞功能的各個環(huán)節(jié)。
[0005] SUM0化修飾是一個高度動態(tài)化的過程，其結(jié)果因具體蛋白而異，包括改變蛋白的 定位，調(diào)控蛋白的活性，以及在某些情況下影響蛋白的穩(wěn)定性。乍一看這些結(jié)果似乎沒有什 么共同性；但其實這些結(jié)果都源自SUM0化修飾對于蛋白質(zhì)的相互作用特性的改變。
[0006] SUM0在釀酒酵母中的研究已經(jīng)很成熟，但在白念珠菌中的已有研究還比較鮮見。
[0007] StephenW.Martin等人對白念珠菌細胞周期中Septin的行為進行了研究。他 們的研究表明，雖然白念珠菌中Septin不發(fā)生SUMO化修飾，但SUMO卻特異性地定位于Septin;進一步的研究表明，Septin的一個組分Cdcll能夠與一個SUMO化的蛋白結(jié)合，從 而使其定位于Septin。
[0008] MichelleD.Leach等人在白念珠菌中發(fā)現(xiàn)了大約30個SUMO化修飾的革巴蛋白，其 中大多數(shù)是具有典型的SUM0化修飾模式W-K-X-E，這些蛋白主要涉及到對外界各種刺激 的應(yīng)答過程。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于通過基因敲除的方法，研究SMT3基因在細胞周期、形態(tài)發(fā)生及 轉(zhuǎn)換過程中的功能，并且提供一種缺失SMT3基因的白念珠菌減毒株。
[0010] 本發(fā)明首先公開了白念珠菌SMT3基因的用途，為用于制備SMT3基因不表達的白 念珠菌smt3/smt3缺失株，或者用于制備、篩選白念珠菌治療藥物。
[0011] 本發(fā)明的SMT3基因含有如SEQIDN0:18所示的核苷酸序列，其在白念珠菌中編 碼SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier泛素相關(guān)小修飾蛋白）。
[0012] 較優(yōu)的，所述SUM0蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0 :19所示。
[0013] 較優(yōu)的，本發(fā)明所述smt3/smt3缺失株為白念珠菌的減毒株。在所述白念珠菌 smt3/smt3缺失株中SMT3基因不表達。
[0014] 本發(fā)明所述白念珠菌治療藥物為以SMT3基因為治療靶基因，使SMT3基因不表達 的藥物、或者以SMT3基因表達的蛋白（SUM0)為拮抗對象的藥物；或者以SMT3基因和其他 基因共同作為靶基因加以沉默的藥物。通過以SMT3基因為靶點，篩選或制備使該基因不表 達的藥物，用于使白念珠菌的毒性減弱，從而治療白念珠菌感染。例如，該白念珠菌治療藥 物可以通過RNA干擾或者基因重組的方法使SMT3基因不表達；或者通過制備SMT3蛋白拮 抗劑，使SMT3基因表達的SUM0不發(fā)揮作用。
[0015] 本發(fā)明第二方面公開了一種白念珠菌減毒株，為白念珠菌smt3/smt3缺失株，所 述減毒株中SMT3基因不表達。
[0016] 進一步的，本發(fā)明的白念珠菌減毒株屬于泛素相關(guān)小修飾蛋白基因缺失株。
[0017] 較優(yōu)的，本發(fā)明所述白念珠菌smt3/smt3缺失株中，SMT3基因通過同源重組的方 法敲除。與野生型白念珠菌相比，本發(fā)明的減毒株在生長方面出現(xiàn)嚴重缺陷，即便是在豐富 培養(yǎng)基中也只能緩慢生長，并且伴隨菌落及細胞形態(tài)方面的異常。同時，在白灰轉(zhuǎn)換實驗 中，smt3/smt3對促進白灰轉(zhuǎn)換的刺激條件不敏感，白灰轉(zhuǎn)換效率比同樣處理的野生型顯著 降低，而且形成的灰菌菌落不穩(wěn)定，在低溫條件下也能轉(zhuǎn)換到白菌狀態(tài)或者絲狀生長狀態(tài)。
[0018] 本發(fā)明第三方面公開了前述白念珠菌減毒株的構(gòu)建方法，為通過同源重組的方法 對白念珠菌中SMT3基因的兩個拷貝進行了敲除，具體步驟如下：
[0019] 1) SMT3基因第一個拷貝的敲除：采用SEQ ID N0 :1-2所示序列的引物從白念珠 菌野生型菌株基因組DNA中擴增SMT3的上游序列片段，利用Xhol+PstI酶切連接到載體 PCUB6中，得到質(zhì)粒pK0-SMT3Up ;然后以SEQ ID N0:3-4所示序列的引物從白念珠菌野生型 菌株基因組中擴增得到SMT3的下游序列I，以BamHI+Notl酶切連接到前述pK0-SMT3Up 中，得到敲除質(zhì)粒PSMT3K0 I ;將所述敲除質(zhì)粒pSMT3K0 I酶切后轉(zhuǎn)化白念珠菌，經(jīng)細胞內(nèi) 同源重組得到第一拷貝SMT3敲除的單敲除菌株；
[0020] 2)SMT3基因第二個拷貝的敲除：采用SEQIDNO:1-2所示序列的引物從白念珠 菌野生型菌株基因組DNA中擴增SMT3的上游序列片段，利用Xhol+PstI酶切連接到載體 PCUB6中，得到質(zhì)粒pK0-SMT3Up;然后以SEQIDN0:3、5所示序列的引物從白念珠菌野生型 菌株基因組中擴增得到SMT3的下游序列II，以BamHI+Notl酶切連接到前述pK0-SMT3Up 中，得到敲除質(zhì)粒PSMT3K0II;將所述敲除質(zhì)粒pSMT3K0II酶切后轉(zhuǎn)化白念珠菌，經(jīng)細胞內(nèi) 同源重組得到第二拷貝SMT3敲除的smt3/smt3雙敲除菌株。
[0021] 本發(fā)明第四方面公開了前述白念珠菌減毒株在研究白念珠菌生長及毒性功能中 的應(yīng)用，或者在制備或篩選白念珠菌治療藥物中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明最后還公開了一種制備白念珠菌治療藥物的方法，為以白念珠菌中的SMT3 基因為靶標，沉默SMT3基因的表達。
[0023] 進一步的，為以白念珠菌中的SMT3基因作為RNA干擾的靶標或者基因重組的靶 標，沉默SMT3基因的表達。
[0024] 本發(fā)明利用URA-BLAST策略對SUM0蛋白的基因SMT3進行了基因敲除。敲除后 的smt3/smt3出現(xiàn)嚴重的生長缺陷，包括生長速度緩慢，形態(tài)異常以及不均一性；同時，在 形態(tài)轉(zhuǎn)換方面，smt3/smt3因為細胞分裂障礙而在非絲狀生長條件下出現(xiàn)假菌絲生長，而在 促進白灰轉(zhuǎn)換的刺激條件下，則出現(xiàn)明顯的響應(yīng)滯后，相比野生型，其白灰轉(zhuǎn)換效率顯著降 低。因此可以得出結(jié)論：SUM0基因在白念珠菌細胞周期、形態(tài)轉(zhuǎn)換以及毒性中充當了重要 的角色。
[0025] 有益效果：本發(fā)明研究了白念珠菌基因SMT3對菌絲生長和菌株毒性的影響，并成 功構(gòu)建了一種白念珠菌減毒株，在本發(fā)明的減毒株中SMT3基因不表達。本發(fā)明的白念珠菌 菌絲生長和毒性相關(guān)因子基因SMT3和白念珠菌減毒株均可用于制備或篩選白念珠菌治療 藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1 :基因缺失菌株的鑒定
[0027] 圖2 :SUM0缺失株在生長方面遲緩的實驗結(jié)果
[0028] 圖3 :SUM0缺失株的菌落及細胞形態(tài)的實驗結(jié)果
[0029] 圖4 :驗證SUM0參與了Worl的翻譯后修飾的實驗結(jié)果
[0030] 圖5 :SUM0在白念珠菌毒性方面作用的實驗結(jié)果

【具體實施方式】
[0031] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。
[0032] 白念珠菌（Candidaalbicans)是一種人體機會性致病真菌，可以引起廣泛的感 染，但是其真正的致病因子和致病機理還沒有完全研究清楚。已有研究表明，白念珠菌存在 與其致病性密切相關(guān)的兩種形態(tài)轉(zhuǎn)換方式：酵母-菌絲發(fā)育以及白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換。本發(fā)明利 用URA-BLAST策略對白念珠菌中唯一的SUM0基因SMT3進行了基因敲除。敲除后的smt3/ smt3在生長方面出現(xiàn)嚴重缺陷，即便是在豐富培養(yǎng)基中也只能緩慢生長，并且伴隨菌落及 細胞形態(tài)方面的異常；同時，在白灰轉(zhuǎn)換實驗中，smt3/smt3對促進白灰轉(zhuǎn)換的刺激條件不 敏感，白灰轉(zhuǎn)換效率比同樣處理的野生型顯著降低，而且形成的灰菌菌落不穩(wěn)定，在低溫條 件下也能轉(zhuǎn)換到白菌狀態(tài)或者絲狀生長狀態(tài)。小鼠毒理實驗結(jié)果表明，smt3/smt3在系統(tǒng) 感染中的毒力顯著下降。
[0033] 本發(fā)明的白念珠菌SMT3基因可用CaSMT3表示，在不會與釀酒酵母SMT3基因混淆 的情況下也用SMT3表示，白念珠菌SMT3基因缺失株用smt3/smt3表示。
[0034] 基本實驗方法：
[0035] 方法1 :白念珠菌基因組DNA抽提
[0036] 白念珠菌培養(yǎng)過夜用ddH20洗1次，懸浮在500yl溶液A中（1M山梨醇，100mM EDTApH8. 0)，加入5ill20mg/ml的Zymolase，37°C放置1小時后，高速離心去上清，細胞 用 500ii1ofTEbuffer(20mMTris?HC1pH7. 5，ImMEDTA)洗一次，懸浮在 350ii1of 丁已131^€61'中，并加入90111(^溶液8(2501111 ￡01六？118.0，4001111 1'1^8.11(：1?118.0，2% SDS)，65°C放置30分鐘，加入80illof5MKAc，冰上放置1小時，高速離心5分鐘，吸取 上清并加入lml的無水乙醇，-20°C放置20分鐘，高速離心5分鐘，沉淀用70%乙醇洗一次， 離心后烘干。
[0037] 方法2 :白念珠菌的轉(zhuǎn)化
[0038] 準備PEG/LiAc溶液（pH7. 5)10ml;在 1. 5mlEppendof管中依次加入質(zhì)粒 5yg， 10lill0mg/ml魚精DNA，混勻；加入0.lml感受態(tài)細胞和0. 6mlPEG/LiAc，votex混勻； 30°C200rpm培養(yǎng)30min;加入70iUDMS0,輕輕混勻；42°C熱沖擊15min，期間不時輕輕搖 勻；冰浴2min:高速離心15s，吸掉上清，用0. 2mlTE重懸細胞；涂布于適當?shù)臓I養(yǎng)篩選SD 平板上。
[0039] 方法3:小鼠系統(tǒng)感染
[0040] 以體重在16-18g ICR雄性小鼠為實驗對象，通過尾靜脈注射100 ill白念珠菌各 種菌株，并培養(yǎng)觀測25天。各個菌株分高低兩個濃度注射，注射濃度分別為5X 107細胞/ 毫升和5X106細胞/毫升。
[0041] 方法4:免疫共沉淀與Western雜交
[0042] 白念珠菌表達菌株在YH)培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)至飽和，按A6QQ 0.05轉(zhuǎn)接于YPD 培養(yǎng)基中于25°C培養(yǎng)6h，至A6QQ為0? 6-1. 0或在YPD+10% Serum培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng) 3. 5h，50ml培養(yǎng)物離心收集，10ml無菌水洗一次。以下步驟均在4°C進行。細胞重懸于 0? 5ml酵母細胞裂解液（200mM Tris-HCl pH8. 0, 400mM(NH4)2S04, 10mM MgCl2, ImM EDTA, 10% Glycerol, 7mM ^-mercaptoethanol, 2mM benzamidine, ImM PMSF, 2 u g/ml pepstatin A，2iig/ml leupeptin,4iig/ml antipain)，加入0.4g酸洗玻璃珠（425_600iim，Sigma)。 在振蕩器FP120上振3次，每次30s，間隔冰浴5min。裂解液12, OOOrpm離心5min，上清再 離心5min，收集上清并測定蛋白濃度，-70°C保存。
[0043] 取500 ii 1細胞抽提物，與等體積的IP Buffer混合，加入10 ii 1床體積的protein G agarose beads,在4°C旋轉(zhuǎn)混合1小時后低速離心，吸取上清加入5 ii g的FLAG單抗，在 4°C旋轉(zhuǎn)混合1小時，然后加入30 ill床體積的protein G agarose beads,繼續(xù)混合2小 時。用IP Buffer洗免疫共沉淀物五次，然后重懸在2X蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液中，進行 SDS-PAGE電泳。用濕法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS-T溶液 封閉膜2-3小時，一抗4°C結(jié)合過夜。用TBS-T室溫洗膜1次，5分鐘。用相應(yīng)的二抗于室 溫結(jié)合1小時，再用TBS-T洗膜四次，每次5分鐘，用ECL試劑顯色。
[0044] 實施例1 smt3/smt3雙敲除白念珠菌株的構(gòu)建
[0045] 通過同源重組的方法對白念珠菌中表達SUM0的SMT3基因的兩個拷貝進行了敲 除。敲除株通過PCR進行了基因型鑒定，具體方法如下：
[0046] 1?第一條染色體SMT3基因的敲除
[0047] 用引物SMT3-UP-F (SEQ ID N0 :1)和引物SMT3-UP-R (SEQ ID N0 :2)從野生型 菌株SC5314基因組DNA中擴增SMT3的上游序列片段約300bp，利用Xhol + PstI酶切連 接到載體PCUB6中，得到質(zhì)粒pK0-SMT3Up。再以引物SMT3-D0WN-F (SEQ ID N0:3)和引物 SMT3-D0WN-R (SEQ ID N0:4)從野生型菌株SC5314基因組中擴增得到SMT3的下游序列約 300bp，以BamHI + Notl酶切連接到pK0-SMT3Up中，得到敲除質(zhì)粒pSMT3K0 I。所得質(zhì)粒 經(jīng)擴增后以Xhol和SstI酶切后轉(zhuǎn)化入野生型菌（JYC5,來自SC5314的MTLa/a型菌)。
[0048] 2. SMT3基因第二個拷貝的敲除
[0049] 第二拷貝敲除質(zhì)粒的構(gòu)建與第一拷貝類似，只是為了避免第二輪轉(zhuǎn)化時重組替換 掉第一輪正確敲除的基因座，用于敲除重組的SMT3下游片段擴增了400bp，具體方法如下。
[0050] 敲除質(zhì)粒pSMT3K0II的構(gòu)建：用引物SMT3-UP-F(SEQIDN0 :1)和SMT3-UP-R (SEQIDN0 :2)從野生型菌株SC5314基因組DNA中擴增SMT3的上游序列片段約300bp，利 用Xhol+PstI酶切連接到載體pCUB6中，得到質(zhì)粒pK0-SMT3Up。再以引物SMT3-D0WN-F (SEQIDN0 :3)和引物SMT3-D0WN400-R(SEQIDN0 :5)從基因組中擴增得到SMT3的下游 序列約400bp，以BamHI+Notl酶切連接到pK0-SMT3Up中，得到敲除質(zhì)粒pSMT3K0II。所 得敲除質(zhì)粒經(jīng)酶切后轉(zhuǎn)化入步驟1所得的第一拷貝敲除的菌株，經(jīng)細胞內(nèi)同源重組后得到 第二拷貝SMT3敲除的smt3/smt3雙敲除白念珠菌株。
[0051] 3.雙拷貝缺失菌株的鑒定
[0052] 通過PCR的方法對敲除子進行鑒定：分別以SMT3基因座上游引物（SEQ IDN0:6 和SEQ IDN0A:11)、開放閱讀框內(nèi)引物（SEQ IDN0A:8和SEQ IDN0A:10, SEQ IDN0A:9 和SEQ IDN0A:11)以及敲除質(zhì)粒引物（SEQ IDN0A:8和SEQ IDN0A:7)進行PCR鑒定，具 體鑒定結(jié)果見附圖1。
[0053] 表1 SMT3敲除及鑒定所用引物
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 白念珠菌SMT3基因的用途，為用于制備SMT3基因不表達的白念珠菌smt3/smt3缺 失株，或者用于制備、篩選白念珠菌治療藥物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，SMT3基因含有如SEQ ID NO: 18所示的核苷 酸序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，SMT3基因在白念珠菌中編碼泛素相關(guān)小修 飾蛋白。
4. 一種白念珠菌減毒株，為白念珠菌smt3/smt3缺失株，所述減毒株中SMT3基因不表 達。
5. 如權(quán)利要求4所述的白念珠菌減毒株，其特征在于，所述白念珠菌減毒株為泛素相 關(guān)小修飾蛋白基因缺失株。
6. 如權(quán)利要求5所述的白念珠菌減毒株，其特征在于，所述泛素相關(guān)小修飾蛋白含有 SEQ ID NO : 19所示的氨基酸序列。
7. 如權(quán)利要求4所述的白念珠菌減毒株，其特征在于，所述白念珠菌smt3/smt3缺失株 中，SMT3基因通過同源重組的方法敲除。
8. 權(quán)利要求4-7任一權(quán)利要求所述白念珠菌減毒株的構(gòu)建方法，為通過同源重組的方 法對白念珠菌中SMT3基因的兩個拷貝進行了敲除，具體步驟如下： 1. SMT3基因第一個拷貝的敲除：采用SEQ ID N0:l-2所示序列的引物從白念珠菌野生 型菌株基因組DNA中擴增SMT3的上游序列片段，利用Xhol + PstI酶切連接到載體pCUB6 中，得到質(zhì)粒pK0-SMT3Up;然后以SEQ ID N0:3-4所示序列的引物從白念珠菌野生型菌株 基因組中擴增得到SMT3的下游序列I，以BamHI + Notl酶切連接到前述pK0-SMT3Up中， 得到敲除質(zhì)粒PSMT3K0 I ;將所述敲除質(zhì)粒pSMT3K0 I酶切后轉(zhuǎn)化白念珠菌，經(jīng)細胞內(nèi)同源 重組得到第一拷貝SMT3敲除的單敲除菌株； 2. SMT3基因第二個拷貝的敲除：采用SEQ ID N0:l-2所示序列的引物從白念珠菌野生 型菌株基因組DNA中擴增SMT3的上游序列片段，利用Xhol + PstI酶切連接到載體pCUB6 中，得到質(zhì)粒pK0-SMT3Up;然后以SEQ ID N0:3、5所示序列的引物從白念珠菌野生型菌株 基因組中擴增得到SMT3的下游序列II，以BamHI + Notl酶切連接到前述pK0-SMT3Up中， 得到敲除質(zhì)粒PSMT3K0 II ;將所述敲除質(zhì)粒pSMT3K0 II酶切后轉(zhuǎn)化白念珠菌，經(jīng)細胞內(nèi)同源 重組得到第二拷貝SMT3敲除的smt3/smt3雙敲除菌株。
9. 權(quán)利要求4-7任一權(quán)利要求所述白念珠菌減毒株在研究白念珠菌生長及毒性功能 中的應(yīng)用，或者在制備或篩選白念珠菌治療藥物中的應(yīng)用。
10. -種制備白念珠菌治療藥物的方法，為以白念珠菌中的SMT3基因為靶標，沉默 SMT3基因的表達。
【文檔編號】C12R1/725GK104342375SQ201310330386
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】陳江野, 鄢明輝 申請人:中國科學院上海生命科學研究院