一種人工合成的信號肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人工合成的信號肽及其應用。本發(fā)明的信號肽的氨基酸序列為SEQIDNO:3。本發(fā)明的信號肽可添加于哺乳動物細胞表達載體,用于引導哺乳動物來源蛋白分泌表達，可將其在動物細胞中的外源蛋白表達量提高。
【專利說明】一種人工合成的信號肽及其應用
[0001]本案為以下專利申請的分案申請:
[0002]申請?zhí)?201210118230.9 ；
[0003]申請日:2012年4月20日；
[0004]發(fā)明名稱:一種人工合成的信號肽及其應用
【技術領域】
[0005]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及用于引導哺乳動物來源蛋白質在哺乳動物細胞中分泌表達的信號肽及其應用。
技術背景
[0006]外源基因在宿主細胞中的高效表達是蛋白質的結構和功能分析、蛋白質或多肽類藥物研究開發(fā)的先決條件。用于表達重組蛋白的表達體系有微生物、植物、酵母、昆蟲細胞和動物細胞等。哺乳動物細胞是表達具有天然活性蛋白的最佳宿主，其優(yōu)勢在于能正確有效地識別真核蛋白的合成、加工和分泌信號，識別和去除基因中的內含子，再經剪切加工成為成熟的mRNA，能準確地完成糖基化、磷酸化，形成鏈內和鏈間二硫鍵及蛋白水解等翻譯后加工過程，因而產生的完整抗體和天然抗體一樣，具有生物學活性，既可識別抗原又可激活補體系統。哺乳動物細胞易被重組的DNA轉染，經過篩選可得到轉化的細胞，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性，表達的產物分泌到培養(yǎng)基中易于純化。利用哺乳動物細胞表達蛋白產物已廣泛應用于生物制品工業(yè)，如病毒疫苗、抗體、干擾素、免疫調節(jié)劑、激素、和生長因子等的大量制備。但動物細胞外源蛋白表達效率低，且成本高，因此提高動物細胞外源蛋白表達效率，降低生產成本是當前工作中的重中之重。
`[0007]影響外源蛋白質在哺乳動物細胞中的因素很多，如信號肽、轉錄和翻譯控制因子、RNA加工(RNA Processing)、基因拷貝的數目、mRNA的穩(wěn)定性、外源基因在染色體上的整合位點、重組蛋白對宿主細胞的潛在毒性和宿主細胞的基因組偏好性(genetic properties)等。在表達載體已經確定的情況下，信號肽的選擇就顯得至關重要了。
[0008]分泌蛋白的N-端通常由可被剪切的15_30Aa的前導順序組成，此順序稱為信號肽(signal sequence),在N-端或靠近N端處有2_3個極性Aa,而在信號肽的中部都是一個唯一的疏水核心或者由很多的疏水Aa構成。信號肽中沒有其它保守順序也沒有酸性基團。和導肽相似，信號肽也是可足以將任何附加的多肽轉運進靶膜。例如將信號肽加在珠蛋白的N-端，就可使它不再留在胞液中，而是穿過膜而分泌到胞外。
[0009]信號肽可使正在翻譯的核糖體附著到RER膜上。核糖體是通過信號肽的功能而附著并合成分泌蛋白的。因此游離的核糖體和膜結合核糖體之間本身并無差異。信號肽是作為一種附著到ER膜上的信號識別，此可能通過開始合成出的N-端頭幾個氨基酸的疏水功能。然后蛋白鏈插進膜中，信號肽埋在膜中的一種蛋白酶所剪切這時核糖體已完成翻譯，蛋白已延著導肽途經穿過膜。信號肽分泌外源蛋白的作用如下:
[0010]I)信號肽能夠引導分泌蛋白或膜蛋白出胞。[0011]2)信號肽的疏水核心決定蛋白質的分泌效率。
[0012]3)信號肽能夠引導蛋白質在細胞內不同區(qū)域或不同細胞器進行正確的定位。
[0013]4)信號肽能夠分泌增強子增強外源蛋白的分泌。
[0014]5)短的信號欣有利于減少表達載體的分子置，提高整合到宿主染色體上外源基因表達盒的穩(wěn)定性和轉錄效率。
[0015]對于分泌蛋白，選擇合適的信號肽可以將其表達量成倍提高，無論對于工業(yè)生產還是科學研究，其意義都是非常深遠的。

【發(fā)明內容】

[0016]本發(fā)明目的是提供一種可以弓丨導外源哺乳動物細胞蛋白高效表達的信號肽及其應用，以降低哺乳動物來源蛋白的生產成本。
[0017]首先，本發(fā)明提供了一種人工合成的用于引導哺乳動物來源蛋白質在哺乳動物細胞中分泌表達的信號肽，所述信號肽的氨基酸序列選自SEQ ID N0:l-5中的任一。其中，SEQID NO: 1-5的信號肽具有較高的同源性。
[0018]SEQ ID NO:1MDVLAFLLGLLLLffLPGVRC
[0019]SEQ ID NO:2MDVPAEFLGLLLLWLSGVRC
[0020]SEQ ID NO:3MRVLPEFLGLLLLWISGVRC
[0021]SEQ ID NO:4MDVPLQLLGLLLL`WLSGVRC
[0022]SEQ ID NO:5MDVPAELLGLLLLWISGVRC
[0023]所述的哺乳動物細胞可以是CHO、BHK、SP2/0、C127等。
[0024]本發(fā)明的信號肽可用于在哺乳動物宿主細胞中引導哺乳動物來源蛋白的分泌表達。
[0025]本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述用于引導哺乳動物來源蛋白質在哺乳動物細胞中分泌表達的信號肽。
[0026]進一步的，所述多核甘酸的序列選自SEQ ID N0:6-10中的任一:
[0027]ATGGATGTTCTTGCTTTTCTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGC (SEQ ID NO:6)
[0028]ATGGATGTTCCTGCCGAATTTCTTGGATTGTTGTTGTTGTGGCTCTCCGGAGTGCGTTGC (SEQ ID NO:7)
[0029]ATGAGGGTTCTGCCTGAATTCCTGGGACTTTTGTTGTTGTGGATTTCCGGCGTGCGATGT (SEQ ID NO:8)
[0030]ATGGATGTACCACTTCAGCTTCTTGGCTTGTTGTTGCTTTGGCTTTCTGGCGTGAGATGT (SEQ ID NO:9)
[0031]ATGGATGTGCCTGCTGAACTTTTGGGCCTTCTTTTGTTGTGGATATCAGGAGTACGATGC (SEQ ID NO:10)
[0032]本發(fā)明的多核苷酸可通過常規(guī)的合成方法制備。
[0033]本發(fā)明的多核苷酸可添加于哺乳動物細胞表達載體，用于引導哺乳動物來源蛋白的分泌表達。
[0034]利用本發(fā)明的信號肽在動物細胞中分泌表達哺乳動物來源蛋白的方法為:將編碼本發(fā)明信號肽的多核苷酸與編碼表達哺乳動物細胞來源蛋白的多核苷酸連接后克隆入哺乳動物細胞表達載體，而后將該重組哺乳動物細胞表達載體轉染哺乳動物細胞后表達目的蛋白。
[0035]本發(fā)明還提供了一種哺乳動物細胞表達載體，所述表達載體含有前述編碼本發(fā)明信號肽的多核苷酸及編碼哺乳動物來源的蛋白質的多核苷酸。[0036]所述表達載體中，編碼本發(fā)明信號肽的多核苷酸緊接在所述編碼哺乳動物來源的蛋白質的多核苷酸前端。
[0037]進一步的，所述表達載體中，所述編碼本發(fā)明信號肽的多核苷酸的前端添加有Kozak序列ο
[0038]所述表達載體的啟動子可以是EF-1a啟動子、CMV啟動子、SV40晚期啟動子或SV40早期啟動子等。
[0039]如本發(fā)明實施例列舉的，所述表達載體為改造的pIRESneo3，所述改造的pIRESneo3中，人EF-1 a啟動子序列或人EFl-HTLV啟動子序列替換了 pIRESneo3質粒中的hCMV主要立即早期啟動子序列。
[0040]本發(fā)明還提供了一種哺乳動物宿主細胞，所述宿主細胞為前述表達載體所轉染。所述的哺乳動物細胞可選自CHO、BHK、SP2/0、C127等。
[0041]本發(fā)明還進一步提供了一種哺乳動物來源的蛋白質的生產方法，為在適合表達所述哺乳動物來源的蛋白質的條件下，培養(yǎng)前述哺乳動物宿主細胞，而后從培養(yǎng)物中采用常規(guī)方法分離出所述哺乳動物來源的蛋白質。
[0042]所述哺乳動物來源的蛋白質可以為任意分子量的蛋白質，如各種藥物蛋白:促紅細胞生成素，各種具有促紅細胞生成素活性的改構促紅細胞生成素，以及抗體等。
[0043]本發(fā)明將本發(fā)明信號肽與蛋白質自身信號肽進行比較，外源蛋白表達量的測定結果表明，本發(fā)明的信號肽特別適用于CHO細胞，與現有信號肽相比，在動物細胞中的外源蛋白表達量獲得大幅提升，表達水平提高了約2~36倍，其應用有利于篩選到高表達單克隆細胞株，具有降低生產成本、便于后續(xù)純化等優(yōu)勢。`【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1顯示發(fā)明信號肽與EPO自身信號肽的比較(pEF載體)
[0045]圖2顯示發(fā)明信號肽與EPO自身信號肽的比較(pEV載體)
【具體實施方式】
[0046]下述實施例詳細說明本發(fā)明，但并不對其發(fā)明范圍進行限制
[0047]本發(fā)明實施例所列舉的表達載體，是由質粒pIRESneo3改造獲得。其中，人EF_1 a啟動子序列、人EFl-HTLV啟動子序列分別替換了原質粒中的hCMV主要立即早期啟動子(Human cytomegalovirus major immediate early promoter)序列。
[0048]實施例1信號肽的合成
[0049]因信號肽較短，將信號肽按引物合成。5，端添加NheI酶切位點及Kozak序列，3，端添加目的基因序列部分，以便于在目的基因上添加該信號肽。
[0050]信號肽I:TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTTCTTGCTTTTCTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:11)
[0051 ]信號肽 2:TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTTCCTGCCGAATTTCTTGGATTGTTGTTGTTGTGGCTCTCCGGAGTGCGTTGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:12)
[0052]信號肽 3:TCGGAGCTAGCCACCATGAGGGTTCTGCCTGAATTCCTGGGACTTTTGTTGTTGTGGATTTCCGGCGTGCGATGTGCCCCACCACG (SEQ ID NO:13)[0053]信號肽4:TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTACCACTTCAGCTTCTTGGCTTGTTGTTGCTTTGGCTTTC TGGCGTGAGATGTGCCCCACCACG (SEQ ID NO:14)
[0054]信號肽5:TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTGCCTGCTGAACTTTTGGGCCTTCTTTTGTTGTGGATATCAGGAGTACGATGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:15)
[0055]實施例2人EF-1 α啟動子的擴增
[0056]以質粒pEF6/V5_HisA (購自Invitrogen公司)為模版，人EF-1 α啟動子序列為參考，設計引物F01/R01,進行聚合酶鏈式反應,擴增出人EF-1 α啟動子序列，反應條件如表1。
[0057]FOl:CATACTAGTGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAG (SEQ ID NO:16)
[0058]RO1:ACGGCTAGCTCCGAGCTCGGTACCAAGCTTACCTAGCCA (SEQ ID NO:17)
[0059]表1PCR反應條件
[0060]

iimcci 保溫時μ ?壞次數(次)
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[0061]所得PCR產物與經過SmaI處理的pUC57 (購自Fermentas公司)連接，并進行測序鑒定，結果表明序列如下所示:
[0062]ACTAGTGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGG GAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTAGCTTGGTACTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGAGCTAGC (SEQ ID NO:18)[0063]實施例3人EFl-HTLV啟動子的擴增
[0064]以質粒pFUSE-CHIg_hG3 (購自InvivoGen公司)為模版，人EF1-HTLV啟動子序列為參考，設計引物H)2/R02，進行聚合酶鏈式反應，擴增出人EFl-HTLV啟動子序列，反應條件如表1。
[0065]F02:ACGACTAGTGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGC (SEQ ID NO:19)
[0066]R02:ATCGCTAGCGTAGGCGCCGGTCACAGCT (SEQ ID NO:20)
[0067]所得PCR產物與經過SmaI處理的pUC57 (購自Fermentas公司)連接，并進行測序鑒定，結果表明序列如下所示:
[0068]ACTAGTGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACGCTAGC (SEQ ID NO:21)
[0069]實施例4重組pEF表達載體的構建`
[0070]將實施例2中的產物與pIRESneo3質粒進行Spel/Nhel雙酶切連接，獲得質粒pEF。
[0071]將經過密碼子優(yōu)化的人促紅細胞生成素基因(GeneBank登錄號:AB463610，含自身信號肽且5丨端添加了 Kozak序列)分別經Nhel/BamHI雙酶切處理后，連接至Nhel/BamHI雙酶切后的質粒PEF，所獲得的重組質粒命名為pEF-EPO。
[0072]將信號肽1，信號肽2，信號肽3，信號肽4，信號肽5分別與促紅細胞生成素(無信號肽)進行PCR拼接，拼接產物與質粒pEF分別進行Spel/Nhel雙酶切連接。所獲得的重組質粒分別命名為 pEF-EPOl, pEF-EP02, pEF_EP03, pEF_EP04, pEF_EP05。
[0073]實施例5重組pEF表達載體瞬時轉染表達研究
[0074]米用脂質體法(lipofectamineLTX, invitrogen)將質粒 pEF-EPO, pEF-EPOl, pEF-EP02, pEF-EP03, pEF_EP04，pEF_EP05分別轉染CHO-S細胞，檢測其促紅細胞生成素的瞬時表達水平。
[0075]按照lipofectamine LTX 操作說明書，將 3 μ g pEF-EPO，pEF-EPOl, pEF_EP02, pEF-EP03, pEF-EP04, pEF_EP05質粒分別轉染培養(yǎng)于6孔板(2.5ml/well, 10%胎牛血清)的CHO-S細胞(約1.1XlO6個細胞)。轉染細胞在5%C02，37°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，收集培養(yǎng)液上清，表達產物經鑒定具有促紅細胞生成素活性，利用ELISA法測定其促紅細胞生成素表達量。pEF-EPO，pEF-EPOl, pEF-EP02, pEF-EP03, pEF-EP04, pEF-EP05 的表達量分別是 3ng/ml, 73ng/ml, 100ng/ml, 62ng/ml, 85ng/ml, 110ng/ml。結果顯示，本發(fā)明信號肽相對于促紅細胞生成素自身信號肽，在相同條件下，EPO表達量提高了 20~36倍。
[0076]實施例6重組pEV表達載體的構建
[0077]將實施例3中的產物與pIRESneo3質粒進行Spel/Nhel雙酶切連接，獲得質粒pEFl-HTLV。[0078]將經過密碼子優(yōu)化的人促紅細胞生成素基因(GeneBank登錄號:AB463610，含自身信號肽且Y端添加了 Kozak序列)分別經Nhel/BamHI雙酶切處理后，連接至Nhel/BamHI雙酶切后的質粒PEV，所獲得的重組質粒命名為pEV-EPO。
[0079]將信號肽1，信號肽2，信號肽3，信號肽4，信號肽5分別與促紅細胞生成素(無信號肽)進行PCR拼接，拼接產物與質粒pEV分別進行Spel/Nhel雙酶切連接。所獲得的重組質粒分別命名為 pEV-EPOl, pEV-EP02, pEV-EP03, pEV-EP04, pEV_EP05。
[0080]實施例7重組pEV表達載體瞬時轉染表達研究
[0081]米用脂質體法(lipofectamineLTX, invitrogen)將質粒 pEV-EPO, pEV-EPOl, pEV-EP02, pEV-EP03, pEV_EP04，pEV_EP05分別轉染CHO-S細胞，檢測其促紅細胞生成素的瞬時表達水平。
[0082]按照lipofectamine LTX 操作說明書，將 3 μ g pEV-EPO，pEV-EPOl, pEV_EP02, pEV-EP03, pEV-EP04, pEV_EP05質粒分別轉染培養(yǎng)于6孔板(2.5ml/well, 10%胎牛血清)的CHO-S細胞(約1.1XlO6個細胞)。轉染細胞在5%C02，37°C的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，收集培養(yǎng)液上清，表達產物經鑒定具有促紅細胞生成素活性，利用ELISA法測定其促紅細胞生成素表達量。pEV-EPO，pEV-EPOl, pEV-EP02, pEV-EP03, pEV-EP04, pEV-EP05 的表達量分別是 20ng/ml, 53ng/ml, 58ng/ml, 48ng/ml, 40ng/ml, 60ng/ml。結果顯示，本發(fā)明信號肽相對于促紅細胞生成素自身信`號肽，在相同條件下，將EPO表達量提高了 2~3倍。
【權利要求】
1.一種人工合成的用于引導哺乳動物來源蛋白質在哺乳動物細胞中分泌表達的信號肽，所述信號肽的氨基酸序列為SEQ ID N0:3。
2.如權利要求1所述信號肽用于在哺乳動物宿主細胞中引導哺乳動物來源蛋白的分泌表達。
3.—種多核苷酸,所述多核苷酸編碼權利要求1所述信號肽。
4.如權利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述多核甘酸的序列為SEQID N0:8。
5.—種哺乳動物細胞表達載體,所述表達載體含有權利要求3或4所述多核苷酸及編碼哺乳動物來源的蛋白質的多核苷酸。
6.如權利要求5所述哺乳動物細胞表達載體，其特征在于，權利要求3或4所述多核苷酸緊接在所述編碼哺乳動物來源的蛋白質的多核苷酸前端。
7.如權利要求5所述哺乳動物細胞表達載體,其特征在于,進一步的，所述表達載體中，權利要求3或4所述多核苷酸的前端添加有Kozak序列。
8.如權利要求5所述哺乳動物細胞表達載體，其特征在于，所述表達載體的啟動子選自EF-1 α啟動子、CMV啟動子、SV40晚期啟動子或SV40早期啟動子。
9.如權利要求5所述哺乳動物細胞表達載體，其特征在于，所述哺乳動物來源的蛋白質選自促紅細胞生成素，各種具有促紅細胞生成素活性的改構促紅細胞生成素，以及抗體。
10.一種哺乳動物宿主細胞，所述宿主細胞為權利要求5-9任一所述表達載體所轉染。
11.如權利要求10所述哺乳動物宿主細胞，其特征在于，所述哺乳動物宿主細胞為CH0、BHK、SP2/0 或 C127。
12.—種哺乳動物來源的蛋白質的生產方法，為在適合表達哺乳動物來源的蛋白質的條件下，培養(yǎng)權利要求10或11所述哺乳動物宿主細胞，而后從培養(yǎng)物中分離出所述哺乳動物來源的蛋白質。
13.如權利要求12所述哺乳動物來源的蛋白質的生產方法，其特征在于，所述哺乳動物來源的蛋白質選自促紅細胞生成素，各種具有促紅細胞生成素活性的改構促紅細胞生成素，以及抗體。
【文檔編號】C12N15/85GK103483423SQ201310332207
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2010年9月17日 優(yōu)先權日:2010年9月17日
【發(fā)明者】周永春, 張玉晶, 厲穎 申請人:上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司, 上海復星醫(yī)藥（集團）股份有限公司