一種人工合成的信號(hào)肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人工合成的信號(hào)肽及其應(yīng)用。本發(fā)明的信號(hào)肽的氨基酸序列為SEQIDNO:5。本發(fā)明的信號(hào)肽可添加于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白分泌表達(dá)，可將其在動(dòng)物細(xì)胞中的外源蛋白表達(dá)量提高。
【專利說(shuō)明】一種人工合成的信號(hào)肽及其應(yīng)用
[0001] 本案為以下專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)：
[0002] 申請(qǐng)?zhí)枺?01210118230. 9 ;
[0003] 申請(qǐng)日：2012年4月20日；
[0004] 發(fā)明名稱：一種人工合成的信號(hào)肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0006] 外源基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析、蛋白質(zhì)或多肽類 藥物研究開(kāi)發(fā)的先決條件。用于表達(dá)重組蛋白的表達(dá)體系有微生物、植物、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞 和動(dòng)物細(xì)胞等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)具有天然活性蛋白的最佳宿主，其優(yōu)勢(shì)在于能正確有 效地識(shí)別真核蛋白的合成、加工和分泌信號(hào)，識(shí)別和去除基因中的內(nèi)含子，再經(jīng)剪切加工成 為成熟的mRNA，能準(zhǔn)確地完成糖基化、磷酸化，形成鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵及蛋白水解等翻譯后 加工過(guò)程，因而產(chǎn)生的完整抗體和天然抗體一樣，具有生物學(xué)活性，既可識(shí)別抗原又可激活 補(bǔ)體系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞易被重組的DNA轉(zhuǎn)染，經(jīng)過(guò)篩選可得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，具有遺傳穩(wěn)定 性和可重復(fù)性，表達(dá)的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中易于純化。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白產(chǎn)物已 廣泛應(yīng)用于生物制品工業(yè)，如病毒疫苗、抗體、干擾素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、和生長(zhǎng)因子等的 大量制備。但動(dòng)物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率低，且成本高，因此提高動(dòng)物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效 率，降低生產(chǎn)成本是當(dāng)前工作中的重中之重。
[0007] 影響外源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的因素很多，如信號(hào)肽、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制因子、 RNA加工（RNA Processing)、基因拷貝的數(shù)目、mRNA的穩(wěn)定性、外源基因在染色體上的整合 位點(diǎn)、重組蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性和宿主細(xì)胞的基因組偏好性（genetic properties) 等。在表達(dá)載體已經(jīng)確定的情況下，信號(hào)肽的選擇就顯得至關(guān)重要了。
[0008] 分泌蛋白的N-端通常由可被剪切的15_30Aa的前導(dǎo)順序組成，此順序稱為信號(hào)肽 (signal sequence),在N-端或靠近N端處有2-3個(gè)極性Aa，而在信號(hào)肽的中部都是一個(gè) 唯一的疏水核心或者由很多的疏水Aa構(gòu)成。信號(hào)肽中沒(méi)有其它保守順序也沒(méi)有酸性基團(tuán)。 和導(dǎo)肽相似，信號(hào)肽也是可足以將任何附加的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)靶膜。例如將信號(hào)肽加在珠蛋白 的N-端，就可使它不再留在胞液中，而是穿過(guò)膜而分泌到胞外。
[0009] 信號(hào)肽可使正在翻譯的核糖體附著到RER膜上。核糖體是通過(guò)信號(hào)肽的功能而附 著并合成分泌蛋白的。因此游離的核糖體和膜結(jié)合核糖體之間本身并無(wú)差異。信號(hào)肽是作 為一種附著到ER膜上的信號(hào)識(shí)別，此可能通過(guò)開(kāi)始合成出的N-端頭幾個(gè)氨基酸的疏水功 能。然后蛋白鏈插進(jìn)膜中，信號(hào)肽埋在膜中的一種蛋白酶所剪切這時(shí)核糖體已完成翻譯，蛋 白已延著導(dǎo)肽途經(jīng)穿過(guò)膜。信號(hào)肽分泌外源蛋白的作用如下：
[0010] 1)信號(hào)肽能夠引導(dǎo)分泌蛋白或膜蛋白出胞。
[0011] 2)信號(hào)肽的疏水核心決定蛋白質(zhì)的分泌效率。
[0012] 3)信號(hào)肽能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域或不同細(xì)胞器進(jìn)行正確的定位。
[0013] 4)信號(hào)肽能夠分泌增強(qiáng)子增強(qiáng)外源蛋白的分泌。
[0014] 5)短的信號(hào)欣有利于減少表達(dá)載體的分子置，提高整合到宿主染色體上外源基因 表達(dá)盒的
[0015] 穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。
[0016] 對(duì)于分泌蛋白，選擇合適的信號(hào)肽可以將其表達(dá)量成倍提高，無(wú)論對(duì)于工業(yè)生產(chǎn) 還是科學(xué)研究，其意義都是非常深遠(yuǎn)的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明目的是提供一種可以引導(dǎo)外源哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白高效表達(dá)的信號(hào)肽及其 應(yīng)用，以降低哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的生產(chǎn)成本。
[0018] 首先，本發(fā)明提供了一種人工合成的用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽的氨基酸序列選自SEQ ID N0:1-5中的任一。其中，SEQ ID N0:1-5的信號(hào)肽具有較高的同源性。
[0019] SEQ ID NO:1 MDVLAFLLGLLLLWLPGVRC
[0020] SEQ ID NO :2 MDVPAEFLGLLLLWLSGVRC
[0021] SEQ ID NO :3 MRVLPEFLGLLLLWISGVRC
[0022] SEQ ID NO :4 MDVPLQLLGLLLLWLSGVRC
[0023] SEQ ID NO :5 MDVPAELLGLLLLWISGVRC
[0024] 所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是CH0、BHK、SP2/0、C127等。
[0025] 本發(fā)明的信號(hào)肽可用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的分泌表 達(dá)。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋 白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào)肽。
[0027] 進(jìn)一步的，所述多核甘酸的序列選自SEQ ID N0:6-10中的任一：
[0028] ATGGATGTTCTTGCTTTTCTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGC (SEQ ID N0:6)
[0029] ATGGATGTTCCTGCCGAATTTCTTGGATTGTTGTTGTTGTGGCTCTCCGGAGTGCGTTGC (SEQ ID N0:7)
[0030] ATGAGGGTTCTGCCTGAATTCCTGGGACTTTTGTTGTTGTGGATTTCCGGCGTGCGATGT (SEQ ID N0:8)
[0031] ATGGATGTACCACTTCAGCTTCTTGGCTTGTTGTTGCTTTGGCTTTCTGGCGTGAGATGT (SEQ ID N0:9)
[0032] ATGGATGTGCCTGCTGAACTTTTGGGCCTTCTTTTGTTGTGGATATCAGGAGTACGATGC (SEQ ID NO:10)
[0033] 本發(fā)明的多核苷酸可通過(guò)常規(guī)的合成方法制備。
[0034] 本發(fā)明的多核苷酸可添加于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋 白的分泌表達(dá)。
[0035] 利用本發(fā)明的信號(hào)肽在動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的方法為：將編碼 本發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸與編碼表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源蛋白的多核苷酸連接后克隆入哺 乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，而后將該重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后表達(dá)目的 蛋白。
[0036] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有前述編碼本發(fā)明 信號(hào)肽的多核苷酸及編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
[0037] 所述表達(dá)載體中，編碼本發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸緊接在所述編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源的 蛋白質(zhì)的多核苷酸前端。
[0038] 進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體中，所述編碼本發(fā)明信號(hào)肽的多核苷酸的前端添加有 Kozak序列。
[0039] 所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子可以是EF-la啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子或 SV40早期啟動(dòng)子等。
[0040] 如本發(fā)明實(shí)施例列舉的，所述表達(dá)載體為改造的pIRESneo3,所述改造的 pIRESneo3中，人EF-la啟動(dòng)子序列或人EF1-HTLV啟動(dòng)子序列替換了 pIRESneo3質(zhì)粒中的 hCMV主要立即早期啟動(dòng)子序列。
[0041] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為前述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染。 所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可選自CHO、BHK、SP2/0、C127等。
[0042] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，為在適合表達(dá)所 述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)前述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，而后從培養(yǎng)物中采用常 規(guī)方法分離出所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)。
[0043] 所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)可以為任意分子量的蛋白質(zhì)，如各種藥物蛋白：促紅 細(xì)胞生成素，各種具有促紅細(xì)胞生成素活性的改構(gòu)促紅細(xì)胞生成素，以及抗體等。
[0044] 本發(fā)明將本發(fā)明信號(hào)肽與蛋白質(zhì)自身信號(hào)肽進(jìn)行比較，外源蛋白表達(dá)量的測(cè)定結(jié) 果表明，本發(fā)明的信號(hào)肽特別適用于CH0細(xì)胞，與現(xiàn)有信號(hào)肽相比，在動(dòng)物細(xì)胞中的外源蛋 白表達(dá)量獲得大幅提升，表達(dá)水平提高了約2?36倍，其應(yīng)用有利于篩選到高表達(dá)單克隆 細(xì)胞株，具有降低生產(chǎn)成本、便于后續(xù)純化等優(yōu)勢(shì)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1顯示發(fā)明信號(hào)肽與ΕΡ0自身信號(hào)肽的比較（pEF載體）
[0046] 圖2顯示發(fā)明信號(hào)肽與ΕΡ0自身信號(hào)肽的比較（pEV載體）

【具體實(shí)施方式】
[0047] 下述實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但并不對(duì)其發(fā)明范圍進(jìn)行限制
[0048] 本發(fā)明實(shí)施例所列舉的表達(dá)載體，是由質(zhì)粒pIRESne〇3改造獲得。其中，人EF-1 a 啟動(dòng)子序列、人EF1-HTLV啟動(dòng)子序列分別替換了原質(zhì)粒中的hCMV主要立即早期啟動(dòng)子 (Human cytomegalovirus major immediate early promoter)序列。
[0049] 實(shí)施例1信號(hào)肽的合成
[0050] 因信號(hào)肽較短，將信號(hào)肽按引物合成。5'端添加 Nhel酶切位點(diǎn)及Kozak序列，3' 端添加目的基因序列部分，以便于在目的基因上添加該信號(hào)肽。
[0051] 信號(hào)肽 1 ：TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTTCTTGCTTTTCTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTT CC
[0052] CGGGGTGAGGTGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:11)
[0053] 信號(hào)肽 2 ：TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTTCCTGCCGAATTTCTTGGATTGTTGTTGTTGTGGCTC TC
[0054] CGGAGTGCGTTGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:12)
[0055] 信號(hào)肽 3 ：TCGGAGCTAGCCACCATGAGGGTTCTGCCTGAATTCCTGGGACTTTTGTTGTTGTGGATT TC
[0056] CGGCGTGCGATGTGCCCCACCACG (SEQ ID NO:13)
[0057] 信號(hào)肽 4 ：TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTACCACTTCAGCTTCTTGGCTTGTTGTTGCTTTGGCTT TC
[0058] TGGCGTGAGATGTGCCCCACCACG (SEQ ID NO:14)
[0059] 信號(hào)肽 5 ：TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTGCCTGCTGAACTTTTGGGCCTTCTTTTGTTGTGGATA TC
[0060] AGGAGTACGATGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:15)
[0061] 實(shí)施例2人EF-1 α啟動(dòng)子的擴(kuò)增
[0062] 以質(zhì)粒pEF6/V5_HisA (購(gòu)自Invitrogen公司）為模版，人EF-1 a啟動(dòng)子序列為 參考，設(shè)計(jì)引物F01/R01,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出人EF-la啟動(dòng)子序列，反應(yīng)條件如 表 1。F01:CATACTAGTGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAG (SEQ ID NO:16)
[0063] R01:ACGGCTAGCTCCGAGCTCGGTACCAAGCTTACCTAGCCA (SEQ ID NO:17)
[0064] 表1PCR反應(yīng)條件
[0065]

【權(quán)利要求】
1. 一種人工合成的用于引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號(hào) 肽，所述信號(hào)肽的氨基酸序列為SEQ ID NO:5。
2. 如權(quán)利要求1所述信號(hào)肽用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中引導(dǎo)哺乳動(dòng)物來(lái)源蛋白的分 泌表達(dá)。
3. -種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述信號(hào)肽。
4. 如權(quán)利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述多核甘酸的序列為SEQ ID NO: 10。
5. -種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求3或4所述多核苷酸及編 碼哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
6. 如權(quán)利要求5所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于，權(quán)利要求3或4所述多核苷 酸緊接在所述編碼哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的多核苷酸前端。
7. 如權(quán)利要求5所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于，進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體 中，權(quán)利要求3或4所述多核苷酸的前端添加有Kozak序列。
8. 如權(quán)利要求5所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的啟動(dòng)子選 自EF-1 α啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子或SV40早期啟動(dòng)子。
9. 如權(quán)利要求5所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白 質(zhì)選自促紅細(xì)胞生成素，各種具有促紅細(xì)胞生成素活性的改構(gòu)促紅細(xì)胞生成素，以及抗體。
10. -種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為權(quán)利要求5-9任一所述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染。
11. 如權(quán)利要求10所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞為 CH0、BHK、SP2/0 或 C127。
12. -種哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，為在適合表達(dá)哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的 條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求10或11所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，而后從培養(yǎng)物中分離出所述哺乳動(dòng) 物來(lái)源的蛋白質(zhì)。
13. 如權(quán)利要求12所述哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng) 物來(lái)源的蛋白質(zhì)選自促紅細(xì)胞生成素，各種具有促紅細(xì)胞生成素活性的改構(gòu)促紅細(xì)胞生成 素，以及抗體。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104059128SQ201310332218
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2010年9月17日
【發(fā)明者】周永春, 張玉晶, 厲穎 申請(qǐng)人:上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司