核酸分析器件以及使用其的核酸分析裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種核酸分析器件以及使用其的核酸分析裝置。本發(fā)明涉及一種核酸分析器件，其為利用熒光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其具備平滑的支持基體，在所述支持基體上具備含有頂點的形狀的金屬結(jié)構(gòu)體和由所述金屬以外的材料構(gòu)成的薄膜層，所述金屬結(jié)構(gòu)體的一部分從所述薄膜層露出，在所述露出的金屬結(jié)構(gòu)體表面具有用于分析試樣中的核酸的核酸探針，并且該核酸分析器件中具有1分子1分子地被各核酸探針捕捉的多個熒光分子，熒光分子被核酸探針捕捉到時熒光增強。
【專利說明】核酸分析器件以及使用其的核酸分析裝置
[0001]本發(fā)明是申請?zhí)枮?008101333406、申請日為2008年7月18日、發(fā)明名稱為“核酸分析器件以及使用其的核酸分析裝置”的發(fā)明申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及核酸分析器件以及使用其的核酸分析裝置。
【背景技術(shù)】
[0003]作為核酸分析器件，正在不斷開發(fā)確定DNA或RNA的堿基序列的新技術(shù)。
[0004]現(xiàn)在，就通常使用的利用電泳的方法而言，預(yù)先由序列確定用的DNA片段或RNA試樣進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備出合成的cDNA片段試樣，通過周知的sanger測序法進行雙脫氧反應(yīng)，然后進行電泳，計測分子量分離展開圖案來進行解析。
[0005]與此相對，近年，如非專利文獻I所述，有人提出了在基板上固定DNA等來確定其堿基序列的方法。該方法為，在基板表面I分子I分子地隨機捕捉要分析的試樣DNA片段，大致I個堿基I個堿基地使其延長，通過熒光計測來檢測其結(jié)果，從而確定堿基序列。具體來講，以下述工序作為I個循環(huán):采用4種dNTP的衍生物(MdNTP)進行DNA聚合酶反應(yīng)的工序，所述4種dNTP的衍生物作為DNA聚合酶的底物被組入模板DNA，由于保護基的存在可停止DNA鏈延伸反應(yīng)，并且還具有可檢測的標記；接著，用熒光等檢測被組入的MdNTP的工序；以及將MdNTP恢復(fù)到可延伸的狀態(tài)的工序，通過反復(fù)該循環(huán)，確定試樣DNA的堿基序列。在本技術(shù)中，由于能夠一分子一分子地確定DNA片段的序列，因此，可以同時解析大量的片段，可以增大解析能力。另外，本方式存在能確定每個單一 DNA分子的堿基序列的可能性，因此，可能不需要對克隆或PCR等操作的DNA進行精制、擴增，這些步驟是以往技術(shù)中的問題，從而可以期待基因組解析好基因診斷的快速化。
[0006]非專利文獻I:P.N.A.S2003, Vol.100，pp.3960-3964.[0007]非專利文獻2:Physical Review Letters2006, 96, ppll3002-113005.[0008]非專利文獻3:Anal.Chem.Vol.78，6238-6245.[0009]非專利文獻4:Nanotechnology, 2007, vol.18, pp044017-044021.[0010]非專利文獻5: J.Coput.Theor.Nanosc1.2007, vol.4, pp686_691.[0011 ]非專利文獻 6:Nanotechnology, 2006, vol.17, pp475-482.[0012]非專利文獻7:P.N.A.S2006, Vol.103，ppl9635_19640.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]發(fā)明要解決的問題
[0014]利用基板上的延伸反應(yīng)解析堿基序列時，以在所述非專利文獻I中公開方式為代表，通常將單堿基延伸反應(yīng)?未反應(yīng)底物的洗滌?計測作為一個循環(huán)，即，逐次反應(yīng)方式。對每個單一 DNA分子解析堿基序列時,計測探針DNA上的一分子熒光色素的熒光,所述熒光色素是通過單堿基延伸反應(yīng)而被組入DNA雙鏈中的核苷酸所附帶的，但是，在通常的熒光測定中，不能識別探針DNA上被捕捉的熒光分子與在其附近浮游的未反應(yīng)的核苷酸所附帶的熒光色素。因此，每延伸一個堿基后，都必不可少地要洗滌未反應(yīng)底物。由于加入該洗滌工序，就存在如下問題:需要在基板上形成復(fù)雜的流路或送液裝置以及廢液處理裝置；還要大量地消耗反應(yīng)試劑；進一步，整個解析所需要的反應(yīng)時間也加長。
[0015]為了識別探針DNA上被捕捉的一分子熒光色素與未反應(yīng)底物的熒光分子，必須要做出這樣的條件，即，只加強在探針DNA上被捕捉的熒光色素的發(fā)光，減弱浮游的色素的發(fā)光以達到不發(fā)光或忽視的程度。
[0016]本發(fā)明的目的是識別通過堿基延伸反應(yīng)而被組入DNA雙鏈中的核苷酸所附帶的一分子熒光色素與未反應(yīng)底物的熒光分子。
[0017]解決問題的方法
[0018]因此，本發(fā)明人等經(jīng)過潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了以下方法:通過在探針DNA上或核酸合成酶上形成基于局 域表面等離子體振子的強熒光增強場，可以識別、計測通過單堿基延伸反應(yīng)而被組入DNA雙鏈中的核苷酸所附帶的熒光色素與浮游的色素。特別深入研究了制作出強熒光增強場的金屬結(jié)構(gòu)體的形狀、和在被局域化的增強場內(nèi)固定探針DNA或核酸合成酶的方法，發(fā)現(xiàn)了使兩者并存的方法。
[0019]本發(fā)明涉及利用熒光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其通過光照射產(chǎn)生局域型表面等離子體振子，并且，用于分析試樣中的核酸的核酸探針或核酸合成酶被配置于所述表面等離子體振子的產(chǎn)生部位。
[0020]發(fā)明效果
[0021]根據(jù)本發(fā)明，可有效地引起由表面等離子體振子所產(chǎn)生的熒光增強效果，并且，可將DNA探針或核酸合成酶固定于熒光增強效果所涉及的區(qū)域，因此，即使不除去帶有熒光分子的未反應(yīng)底物，也能夠計測堿基延伸反應(yīng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是用于說明本發(fā)明的核酸分析器件的概念的圖。
[0023]圖2是用于說明本發(fā)明的核酸分析器件的制造方法的一個例子的圖。
[0024]圖3是用于說明本發(fā)明的核酸分析器件的制造方法的一個例子的圖。
[0025]圖4是用于說明本發(fā)明的核酸分析器件的結(jié)構(gòu)的一個例子的圖。
[0026]圖5是用于說明使用本發(fā)明的核酸分析器件的核酸分析裝置的一個例子的圖。
[0027]圖6是用于說明本發(fā)明的核酸分析器件的概念的圖。
[0028]符號說明
[0029]101熒光色素
[0030]102未反應(yīng)底物的熒光色素
[0031]103平滑基板
[0032]104金屬結(jié)構(gòu)體
[0033]105 DNA 探針
[0034]201,301平滑的支持基體
[0035]202，203，302，303電子射線用正性保護層
[0036]204，206，208，304 鈦[0037]205,209 金
[0038]207,306 SiO2 膜
[0039]305金的濺射膜
[0040]401透光性支持基體
[0041]402點陣狀配置金屬結(jié)構(gòu)體的區(qū)域
[0042]403反應(yīng)室
[0043]404溫調(diào)單元
[0044]405分注單元
[0045]406 閥
[0046]407,506 流路
[0047]408廢液罐
[0048]501 蓋板
[0049]502檢測窗
[0050]503 注入口
`[0051]504 排出口
[0052]505 器件
[0053]507,508 YAG 激光光源
[0054]509,510 激光
[0055]511 λ/4 板
[0056]512 二色鏡
[0057]513 透鏡
[0058]514 棱鏡
[0059]515 物鏡
[0060]516光學濾波器
[0061]517成像透鏡
[0062]518 二維 CCD 相機
[0063]605核酸合成酶
【具體實施方式】
[0064]本實施例提供一種核酸分析器件，其為利用突光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其特征在于，通過光照射產(chǎn)生局域型表面等離子體振子，并且，具有在所述表面等離子體振子的產(chǎn)生部位配置有用于分析試樣中的核酸的核酸探針的金屬結(jié)構(gòu)體。
[0065]另外，本實施例提供一種核酸分析器件，其為利用熒光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其特征在于，制成在平滑的支持基體上、在相對于所述支持基體表面垂直的方向上，順序?qū)盈B金屬體、絕緣層、金屬體的結(jié)構(gòu)，所述絕緣層具有用于分析試樣中的核酸的核酸探針。
[0066]此外，本實施例提供一種核酸分析器件，其為利用突光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其特征在于，在平滑的支持基體上，具備含有頂點的形狀的金屬結(jié)構(gòu)體和由所述金屬以外的材料構(gòu)成薄膜層，制成所述含有頂點的金屬結(jié)構(gòu)體的一部分從所述薄膜層露出、該部分以外的所述金屬結(jié)構(gòu)體被埋入所述薄膜層中的結(jié)構(gòu)，在所述露出的金屬結(jié)構(gòu)體表面具有用于分析試樣中的核酸的核酸探針。
[0067]此外，本實施例提供一種核酸分析器件，其為利用熒光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其特征在于，在平滑的支持基體上，具被含有頂點的形狀的金屬結(jié)構(gòu)體和由所述金屬以外的材料構(gòu)成薄膜層，制成所述含有頂點的金屬結(jié)構(gòu)體的一部分從所述薄膜層露出、并且該部分以外的所述金屬結(jié)構(gòu)體被埋入所述薄膜層中的結(jié)構(gòu)，在所述露出的金屬結(jié)構(gòu)體表面固定用于分析試樣中的核酸的核酸探針，然后除去薄膜層，從而制作出核酸分析器件。
[0068]此外，本實施例提供一種核酸分析器件，其為利用突光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其特征在于，具有通過光照射產(chǎn)生局域型表面等離子體振子的金屬結(jié)構(gòu)體，用于分析試樣中的核酸的核酸合成酶被配置在所述局域型表面等離子體振子的產(chǎn)生部位。
[0069]此外，本實施例提供一種核酸分析器件，其為利用突光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其特征在于，具備平滑的支持基板，在所述支持基板上、在相對于所述支持基板表面垂直的方向上，順序?qū)盈B金屬體、絕緣層以及金屬體，在所述絕緣層具有用于分析試樣中的核酸的核酸合成酶。
[0070]此外，本實施例提供一種核酸分析器件，其為利用熒光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其特征在于，具備平滑的支持基板，在所述支持基板上，具備含有頂點的形狀的金屬結(jié)構(gòu)體和由所述金屬以外的材料構(gòu)成的薄膜層，所述金屬結(jié)構(gòu)體的一部分從所述薄膜層露出，在所述露出的金屬結(jié)構(gòu)體表面，具有用于分析試樣中的核酸的核酸合成酶。
[0071]此外，本實施例提供的前述記載的核酸分析器件的特征在于，所述結(jié)構(gòu)體是圓錐形。
[0072]此外，本實施例提 供的前述記載的核酸分析器件的特征在于，所述結(jié)構(gòu)體是多面體。
[0073]此外，本實施例提供的前述記載的核酸分析器件的特征在于，作為金屬，使用從金、銀、鉬選出的貴金屬。
[0074]此外，本實施例提供的前述記載的核酸分析器件的特征在于，將所述金屬結(jié)構(gòu)體陣列狀地配置于支持基體上。
[0075]此外，本實施例提供一種核酸分析裝置，其特征在于，具有對試樣照射光的設(shè)備與發(fā)光檢測設(shè)備，通過使核酸試樣對前述記載的核酸分析器件進行雜交，讓具有熒光色素的核苷酸與核酸合成酶共存于所述器件上，在該器件上產(chǎn)生核酸延伸反應(yīng)，對在延伸反應(yīng)中被組入核酸鏈中的熒光色素進行熒光測定，從而，取得所述核酸試樣的堿基序列信息。
[0076]此外，本實施例提供一種核酸分析裝置，其特征在于，具備:對核酸分析器件供給具有突光色素的核苷酸、引物以及核酸試樣的設(shè)備；對所述核酸分析器件照射光的設(shè)備；在核酸分析器件上共存所述核苷酸、所述引物以及所述核酸試樣，利用由此產(chǎn)生的核酸延伸反應(yīng)將熒光色素組入核酸鏈中，對該熒光色素產(chǎn)生的熒光進行測定的發(fā)光檢測設(shè)備；從而取得所述核酸試樣的堿基序列信息。
[0077]以下，參照附圖來說明上述及其他的本發(fā)明的新的特征與效果。
[0078]這里，為了完全理解本發(fā)明，對特定的實施方式進行詳細的說明，但本發(fā)明不限于這里記載的內(nèi)容。
[0079]實施例1
[0080]采用圖1說明本實施例的器件的概念。為了識別在探針DNA上捕捉的熒光色素101與未反應(yīng)底物的熒光分子102，需要改變照射于探針DNA上被捕捉的熒光色素101與浮游的未反應(yīng)的熒光色素102的光的強度，或者只使探針DNA上的色素101有效地產(chǎn)生輻射過程。實施例以后者的方案為基礎(chǔ)，如 Physical Review Letters2006, 96，ppl 13002-113005 (非專利文獻2)中報告所示，是基于這樣的物理現(xiàn)象，即，局域型表面等離子體振子提高由于分子的光吸收所產(chǎn)生的電子遷移與從激發(fā)單態(tài)向基態(tài)的輻射遷移這兩者的概率?？梢灶A(yù)料到局域型表面等離子體振子的熒光增強效果為數(shù)倍至數(shù)十倍左右。該影響涉及的范圍是IOnm至20nm左右，如果在固定有探針DNA的金屬結(jié)構(gòu)體的表面產(chǎn)生局域型表面等離子體振子，則只有被探針DNA組入的色素會受到熒光增強的良好影響，其與浮游的色素所產(chǎn)生的熒光強度差在數(shù)倍至數(shù)十倍以上。產(chǎn)生局域型表面等離子體振子的部位以及影響涉及的范圍是IOnm至20nm左右，這種程度極其局域化，因此，在這樣的部位上固定探針DNA是極其困難的，而且，關(guān)于在平滑基板 上制作數(shù)萬至數(shù)十萬個產(chǎn)生這樣的局域型表面等離子體振子的部位，就本發(fā)明人等所能知道的范圍來講，至今還沒有先例。本實施例發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)生局域型表面等離子體振子的部位上簡便地固定探針DNA的方法，并且，提供可在平滑基板103上制作數(shù)萬至數(shù)十萬個產(chǎn)生這樣的局域型表面等離子體振子的部位的方法。
[0081]對于由表面等離子體振子所產(chǎn)生的熒光增強現(xiàn)象，已知有使用Anal.Chem.Vol.78，6238-6245 (非專利文獻3)所報告的納米級的銀的島結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，或使用Nanotechnology, 2007, vol.18，pp044017-044021 (非專利文獻4)所報告的金直徑為數(shù)十納米的球狀微粒的物質(zhì)。
[0082]對于一個個的探針DNA分子，將數(shù)萬至數(shù)十萬的具有島狀結(jié)構(gòu)的塊或球狀微粒配置于玻璃基板等平滑基板上是不可能的。特別是，將探針DNA分子固定于規(guī)定的位點是不可能的。
[0083]因此，本發(fā)明人等對于可生成強有力的表面等離子體振子，并且可在表面等離子體振子產(chǎn)生部位附近固定探針DNA分子的結(jié)構(gòu)進行了深入研究。進而，考慮到制造成本，認為優(yōu)選的結(jié)構(gòu)為可以有效應(yīng)用在半導(dǎo)體或配線基板的制造中使用的薄膜工藝來進行制造的結(jié)構(gòu)，從而對結(jié)構(gòu)進行了研究。
[0084]通過J.Comput.Theor.Nanosc1.2007, vol.4, pp686_691 (非專利文獻 5)的計算模擬來預(yù)測，當金納米微粒接近時，在其間的間隙中所生成強有力的局域表面等離子體振子。但是，使金納米微粒接近來制成對、控制其微粒間的距離，并將金納米微粒對點陣狀地排列于平滑基板上、并將DNA探針固定于構(gòu)成對的金微粒之間，這些操作是非常困難的。本發(fā)明人等潛心研究，結(jié)果設(shè)計出以下結(jié)構(gòu)體:在金屬結(jié)構(gòu)體之間夾入絕緣層，通過控制該絕緣層的厚度來控制金屬結(jié)構(gòu)體之間的間隔，并且，將探針DNA分子固定于該絕緣層。
[0085]插入金屬結(jié)構(gòu)體之間的絕緣層可以使用SiO2等無機材料，也可以使用以聚酰亞胺為代表的有機材料。哪種場合中，都可利用與金屬表面的化學性質(zhì)的差別，選擇適合的官能基團，將其賦予絕緣層，或者預(yù)先將所述官能基團修飾于探針DNA分子末端，使其與金屬結(jié)構(gòu)體反應(yīng)，從而制造想要的帶有探針DNA分子的金屬結(jié)構(gòu)體。絕緣層的膜厚優(yōu)選為Inm至20nm左右，但并不限于該條件。金屬結(jié)構(gòu)體通過利用掩模的蒸鍍?濺射來制造，或者利用蒸鍍.濺射來形成薄膜后，通過干式或濕式蝕刻來制造。可以將金屬、絕緣物、金屬連續(xù)地通過蒸鍍.濺射進行制膜后，利用蝕刻等制成想要形狀的結(jié)構(gòu)體，也可以通過掩模，用蒸鍍.濺射來層疊金屬、絕緣物、金屬，制造出結(jié)構(gòu)體。或者，也可以用絕緣物夾住金屬箔進行粘接后，將層疊物粘接于平滑基板，利用蝕刻等進行成型，從而制造出想要的金屬層疊體。金屬結(jié)構(gòu)體的合適的大小因照射的光的波長而異。即，適合產(chǎn)生表面等離子體振子的共振頻率根據(jù)金屬結(jié)構(gòu)體表面的自由電子群與光的相互作用來確定。如果激發(fā)光是可見光，則金屬結(jié)構(gòu)體的大小以及寬.高優(yōu)選為30nm至IOOOnm左右，但并不限于該條件。通過光引發(fā)的電場在金屬中造成更大的反極化場(具有與光產(chǎn)生的外加電場相反相位的電場)，這與強有力的局域型表面等離子體振子的形成有關(guān)，因此，作為金屬，優(yōu)選具有更大負的介電常數(shù)的金屬，優(yōu)選金、銀、鉬等貴金屬。
[0086]另外，作為產(chǎn)生強有力的表面等離子體振子的結(jié)構(gòu)，已知有頂端尖銳化的微小的針。例如，在Nanotechnology, 2006，vol.17，pp475_482 (非專利文獻6)中，通過計算模擬預(yù)測出頂端越尖就越可能產(chǎn)生強的表面等離子體振子。但是，將頂端尖的金屬針點陣狀地排列于平滑基板，并將DNA探針固定于頂端是非常困難的。本發(fā)明人等進行潛心研究設(shè)計出以下結(jié)構(gòu)體:其為使頂端尖銳化的金屬結(jié)構(gòu)體，用與所述金屬不同的材料覆蓋所述金屬結(jié)構(gòu)體，使得只露出頂端，通過利用所述金屬與覆蓋其的材料對于探針DNA分子的粘接性的差異，只在金屬頂端部固定探針DNA分子。作為使頂端尖銳化的結(jié)構(gòu)體，優(yōu)選圓錐形或具有多個角的多面體，但并不限于該條件。作為覆蓋所述結(jié)構(gòu)體的材料，可以應(yīng)用SiO2等無機材料或高分子等有機材料。作為制造方法，可以想到通過下部寬的具有大錐度的掩模，利用蒸鍍.濺射將金屬制膜的方法。制造金屬結(jié)構(gòu)體后，在整個面上形成SiO2等無機材料或高分子等有機材料的薄膜。作為薄膜的形成方法，應(yīng)用蒸鍍.濺射或利用涂布液的涂布?？梢酝ㄟ^調(diào)控制膜的厚度，使頂端部露出?；蛘?，也可以形成厚到覆蓋頂端部的薄膜后，通過蝕刻來露出頂端部。為了將探針DNA分子固定于露出部，可以利用金屬結(jié)構(gòu)體表面與薄膜表面的化學性質(zhì)的差異。例如，金屬是金而覆蓋金屬的膜是SiO2時，通過預(yù)先在探針DNA的末端修飾巰基，使得如果在形成SiO2披覆膜后應(yīng)用探針DNA，則只在金露出部上固定探針DNA。金屬結(jié)構(gòu)體的合適的大小因照射的光的波長而異。即，適于產(chǎn)生表面等離子體振子的共振頻率是根據(jù)金屬結(jié)構(gòu)體表面的自由電子群與光的相互作用而定的。如果激發(fā)光為可見光，貝1J金屬結(jié)構(gòu)體的大小與寬.高`優(yōu)選為30nm至IOOOnm左右,但并不限于該條件。另外，通過上述方法，將DNA探針固定于頂端部后，即使除去覆蓋金屬結(jié)構(gòu)體的薄膜，由表面等離子體振子所產(chǎn)生的效果也相同。覆蓋金屬結(jié)構(gòu)體的薄膜對作為核酸分析器件的特性產(chǎn)生不良影響時，優(yōu)選被除去。
[0087]參照圖2，對將DNA探針固定于鄰近的兩個金結(jié)構(gòu)體之間的核酸分析器件的制造方法進行說明。利用旋轉(zhuǎn)涂布法在平滑的支持基體201上分別涂布2種電子射線用正性保護層202、203。作為平滑的支持基體，可以使用玻璃基板、藍寶石基板、樹脂基板等。制成器件時，需要從與形成金屬結(jié)構(gòu)體的面相對側(cè)的背面照射激發(fā)光的場合中，最好使用透光性優(yōu)異的石英基板或藍寶石基板。作為2種電子射線用正性保護層，例如，可以使用聚甲基丙烯酸甲酯、與具有容易因自由基斷裂而解聚的結(jié)構(gòu)的高分子保護層的組合。作為后者的保護層，在實用上優(yōu)選用170°C-200°C的加熱板進行2-5分鐘左右的預(yù)烘，并且，可以用20KV的加速電壓、電子射線量為20-50 μ C/cm2進行描畫，例如，可以舉出ZEP-520A(日本瑞翁社制造)。利用基板上的標記的位置進行定位后，實施2次電子射線直描曝光，在各個保護層中，形成基板側(cè)的保護層202的孔徑比保護層203的孔徑大的通孔。例如，形成各自直徑為300nm和250nm的通孔。將該通孔作為錐度大的沉積用的掩模來有效利用。通孔依賴于可用并行處理解析的核酸分子數(shù)，考慮到制造上的簡便性.成品率的高低與可用并行處理解析的核酸分子數(shù)，適于以Iym左右的間距來形成。通孔形成區(qū)域也取決于可用并行處理解析的核酸分子數(shù)，但在很大程度上也依賴于檢測裝置側(cè)的位置精度、位置分解能。例如，以I μ m的間距構(gòu)成反應(yīng)位點(金屬結(jié)構(gòu)體)時,如果通孔形成區(qū)域為ImmXlmm,則能形成100萬個反應(yīng)位點。形成通孔后，根據(jù)金屬結(jié)構(gòu)體的組成，將鈦204、金205、鈦206、SiO2膜207、鈦208、金209用濺射進行制膜。為了增強藍寶石-金、金-SiO2間的粘接，而優(yōu)選加入鈦，也可以使用鉻等其他金屬。剝離2層保護層后，通過蝕刻金209使得鈦208露出。金209的蝕刻優(yōu)選濕式蝕刻，蝕刻液優(yōu)選碘系的蝕刻液。碘系蝕刻液由碘與碘化物(碘化鉀或碘化銨)構(gòu)成，具有如下優(yōu)點:液體是中性而容易操作，根據(jù)成分濃度也容易控制蝕刻速度。作為例子，可以舉出AURUM-301 (關(guān)東化學社制造)。接著，通過干式蝕刻對鈦208、SiO2膜207、鈦206進行蝕刻，使下層的金205露出。該蝕刻優(yōu)選氬等離子體蝕刻。接著，再次對金進行濕式蝕刻，直至下層的金205的寬度為IOOnm至500nm左右。該金205的最終大小需要根據(jù)用于生成局域型表面等離子體振子而照射的光的波長來調(diào)節(jié)。例如，使用500nm左右的光的場合中，寬度為50nm至500nm左右、高度為50nm至500nm左右是有效的。最后，將DNA探針固定于SiO2膜207上。固定方法考慮了各種方法，作為例子記述了使用氨基硅烷處理的方法。通過氨基硅烷處理，將氨基導(dǎo)入SiO2膜207。然后，使其與生物素-琥珀酰亞胺(Pierce公司制造的NHS-Biotin)反應(yīng)后，與鏈霉親和素進行反應(yīng)，接著，再與預(yù)先將生物素修飾于末端的DNA探針210進行反應(yīng)，從而，制成了在鄰近的兩個金結(jié)構(gòu)體之間固定有DNA探針的核酸分析器件。DNA探針的長度并無特別限制，但如果太長或者太短，則可能會使DNA隱藏于金結(jié)構(gòu)體，其與核酸試樣的雜交效率可能會變差。因此，DNA探針長度優(yōu)選為20至50個堿基長度。在使用除了金以外的銀或鉬的場合中，當然可以利用與上述制造方法相同的方法來制作。
[0088]接著，參照圖3，對于在金的圓錐形的頂端部固定有DNA探針的結(jié)構(gòu)的核酸分析器件的制造方法進行說明。利用旋轉(zhuǎn)涂布法，將2種電子射線用正性保護層302、303分別涂布于平滑的支持基體301上。作 為平滑的支持基體，可以使用玻璃基板、藍寶石基板、樹脂基板等。制成器件時，在需要從與形成有金屬結(jié)構(gòu)體的面相對側(cè)的背面照射激發(fā)光的場合中，使用透光性優(yōu)異的石英基板或藍寶石基板即可。作為2種電子射線用正性保護層，例如，可以使用聚甲基丙烯酸甲酯、與具有容易因自由基斷裂而解聚的結(jié)構(gòu)的高分子保護層的組合。作為后者的保護層，在實用上優(yōu)選用170-200°C的加熱板進行2-5分鐘左右的預(yù)烘，并且，可以用20KV的加速電壓、電子射線量為20-50 μ C/cm2進行描畫，例如，可以舉出ZEP-520A (日本瑞翁社制造)。利用基板上的標記的位置進行定位后，實施2次電子射線直描曝光，在各個保護層中，形成基板側(cè)的電子射線用正性保護層302的孔徑比電子射線用正性保護層303的孔徑大的通孔。例如，形成各直徑為300nm和IOOnm的通孔。將該通孔作為錐度大的沉積用的掩模來有效利用。形成通孔后，根據(jù)金屬結(jié)構(gòu)體的組成，利用濺射將鈦304、金305進行制膜。從增強藍寶石-金之間的粘接的角度考慮，優(yōu)選利用鈦，也可以使用鉻等其他的金屬。形成的濺射膜305如圖3所示，呈圓錐形。對于調(diào)節(jié)該圓錐形的形狀，改變2層保護層的各膜厚與孔徑是有效的方法。剝離2層保護層后，利用濺射將SiO2膜306進行制膜。接著，通過反應(yīng)性離子蝕刻(使用CF4/02)，對SiO2膜306進行蝕刻，使金305的頂端部露出。接著，通過羥基硅烷處理，在SiO2膜306上導(dǎo)入羥基，防止非特異性吸附。最后，與在末端修飾有巰基的DNA探針307反應(yīng)，從而制成在金的圓錐形頂端部固定有DNA探針的結(jié)構(gòu)的核酸分析器件。在使用除了金以外的銀或鉬的場合中，當然可以利用與上述制造方法相同的方法來制作。
[0089]參照圖4，對核酸分析器件優(yōu)選的結(jié)構(gòu)的一個例子進行說明。在透光性支持基體401上，搭載多個以點陣狀配置有金屬結(jié)構(gòu)體的區(qū)域402。金屬結(jié)構(gòu)體相當于前面所述的金屬結(jié)構(gòu)體，g卩，在鄰近的兩個金結(jié)構(gòu)體之間固定有DNA探針的金屬結(jié)構(gòu)體，或在金的圓錐形的頂端部固定有DNA探針的結(jié)構(gòu)的金屬結(jié)構(gòu)體。配置間隔可以根據(jù)要解析的核酸試樣、熒光檢測裝置的規(guī)格來進行適當?shù)脑O(shè)定。例如，將25mmX75mm的載玻片作為透光性支持基體401、使以I微米間隔點陣狀地配置有金屬結(jié)構(gòu)體的區(qū)域402為5mmX8mm時，每一區(qū)域可以解析4000萬種的核酸分子，可以將8個左右的這樣的區(qū)域搭載于透光性支持基體401 (載玻片)上。因而，例如在用于RNA的表達解析的場合中，每一細胞表達大約40萬分子的RNA,因此，可以像數(shù)字計數(shù)那樣十分正確地進行RNA的表達頻率解析，在一片基板上可以進行8個左右的解析。如前所 述，為了在透光性支持基體401上設(shè)置多個反應(yīng)區(qū)域，可以通過將預(yù)先設(shè)置流路的反應(yīng)室403蓋在透光性支持基體401上來實現(xiàn)。反應(yīng)室403是由為形成流路而預(yù)先挖掘了流路407的槽的PDMS (polydimethylsi1xane:聚二甲基娃氧燒)等樹脂基體形成的，貼合于器件上進行使用。具體來講，是由對核酸試樣、反應(yīng)酶、緩沖液、核苷酸底物等進行保存.溫度管理的溫調(diào)單元404，輸出反應(yīng)液的分注單元405，控制液體流動的閥406，廢液罐408構(gòu)成的。根據(jù)需要，配置溫調(diào)機進行溫度控制。反應(yīng)結(jié)束時，通過反應(yīng)室403的流路供給洗滌液，并收納于廢液罐408。
[0090]實施例2
[0091]對核酸分析裝置的實施例進行說明。參照圖5，對使用核酸分析器件的核酸分析裝置的優(yōu)選結(jié)構(gòu)的一個例子進行說明。
[0092]在本實施例中，核酸分析裝置具備:對核酸分析器件供給具有熒光色素的核苷酸、核酸合成酶以及核酸試樣的設(shè)備；對核酸分析器件照射光的設(shè)備；對于通過在核酸分析器件上共存核苷、核酸合成酶以及核酸試樣所產(chǎn)生的核酸延伸反應(yīng)而被組入核酸鏈中的熒光色素的熒光進行測定的發(fā)光檢測設(shè)備。更具體地講，在反應(yīng)室中設(shè)置所述器件505，所述反應(yīng)室是由蓋板501、檢測窗502、作為溶液交換口的注入口 503以及排出口 504構(gòu)成的。作為蓋板501與檢測窗502的材質(zhì)，使用PDMS (聚二甲基硅氧烷)。另外，檢測窗502的厚度為0.17mm。由YAG激光光源(波長532nm，輸出20mW)507以及YAG激光光源(波長355醒，輸出20mW)508振動出激光510與509，只將激光509利用λ /4板511制成圓偏振光，通過二色鏡512 (反射波長410nm以下的光)將所述兩個激光調(diào)節(jié)至同軸后，利用透鏡513進行聚光，然后，經(jīng)由棱鏡514以臨界角以上對器件505進行照射。根據(jù)本實施例，通過激光照射，使得存在于器件505表面上的金屬結(jié)構(gòu)體中產(chǎn)生局域型表面等離子體振子，被結(jié)合于金屬結(jié)構(gòu)體的DNA探針捕捉的靶物質(zhì)的熒光體會存在于熒光增強場內(nèi)。熒光體被激光激發(fā)，其增強的熒光的一部分經(jīng)由檢測窗502被射出。另外，由檢測窗502射出的熒光通過物鏡515(X60,NAl.35,動作距離0.15mm)形成平行光束,利用光學濾波器516屏蔽掉背景光與激發(fā)光，利用成像透鏡517在二維CXD相機518上成像。
[0093]在逐次反應(yīng)方式的場合中，作為帶有熒光色素的核苷酸，可以使用P.N.A.S2006,Vol.103,ppl9635-19640 (非專利文獻7)中公開的核苷酸，即，在核糖的3’ OH位置上引入3’-0_烯丙基作為保護基，并且，在嘧啶的5位的位置或嘌呤的7位的位置上經(jīng)由烯丙基結(jié)合有熒光色素的核苷酸。由于烯丙基通過光照射或與鈀接觸會被切斷，因此，可以同時實現(xiàn)色素的消光與延伸的控制。在逐次反應(yīng)中也不需要以洗滌來除去未反應(yīng)的核苷酸。此外，由于不需要洗滌工序，因此也可以以實時方式計測延伸反應(yīng)。此時，所述核苷酸不需要在核糖的3’ OH位置上引入3’ -O-烯丙基作為保護基，使用通過用光照射就能夠斷裂的官能基團與色素結(jié)合的核苷酸即可。
[0094]如上所述，通過采用本實施例的核酸分析器件組成核酸分析裝置，不用引入洗滌工序，可以實現(xiàn)解析時間的縮短化、器件及分析裝置的簡便化，不只是逐次反應(yīng)方式，還可以以實時方式檢測堿基的延伸反應(yīng)，相對于以往技術(shù)可以實現(xiàn)生產(chǎn)能力的大幅改善。
[0095]實施例3
[0096]通常，由局域型表面等離子體振子產(chǎn)生的熒光增強場，即使再大也就是結(jié)構(gòu)體的直徑程度，更具體講，是20nm以下的大小。另一方面，核酸的大小在10個堿基長度時為3.411111，與2011111的增強場相當?shù)暮怂釣?0 + 3.4\10 N 58.8個堿基長度。因而，在實施例1的器件中，如果不想辦法使延伸的核酸成團或擴大在熒光增強場的話，則難以確定比58個堿基長度長的堿基序列。如果讀取的堿基長度短，則將得到的序列信息與DB校對時的校對率就低。
[0097]因此，在本實施例中，與實施例1和2不同，用于分析試樣中的核酸的核酸合成酶被配置在所述表面等離子體振子的產(chǎn)生部位。由于可在熒光增強效果所涉及的區(qū)域內(nèi)固定核酸合成酶，因此，可以讀取更長的堿基長度。以下，以不同于實施例1和2的內(nèi)容為主進行說明。`
[0098]參照圖6對本實施例的器件的概念進行說明。為了識別被核酸合成酶605捕捉的熒光色素101與未反應(yīng)底物的熒光分子102，需要只讓核酸合成的色素101有效地產(chǎn)生輻射過程。局域型表面等離子體振子的熒光增強效果涉及的范圍是IOnm至20nm左右，如果在固定核酸合成酶605的金屬結(jié)構(gòu)體的表面產(chǎn)生局域型表面等離子體振子，則只有被組入核酸合成酶605的色素受到熒光增強的良好影響，與游離的色素相比，可帶來數(shù)倍至數(shù)十倍的熒光強度的差別。本實施例發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)生局域型表面等離子體振子的部位上簡便地固定核酸合成酶605的方法，并且，提供一種能夠在平滑的支持基板103上制作數(shù)萬至數(shù)十萬個產(chǎn)生這種局域型表面等離子體振子的部位的方法。
[0099]在本實施例中，在金屬結(jié)構(gòu)體之間夾入絕緣層，通過控制該絕緣層的厚度來控制金屬結(jié)構(gòu)體之間的間隔，并且，將核酸合成酶固定于該絕緣層。
[0100]插入金屬結(jié)構(gòu)體之間的絕緣層可以使用SiO2等無機材料，也可以使用以聚酰亞胺為代表的有機材料。哪種場合中，都可利用與金屬表面的化學性質(zhì)的差別，選擇適合的官能基團，將其賦予絕緣層，或者使存在于核酸合成酶內(nèi)的官能基團、或被導(dǎo)入進核酸合成酶的新的官能基團與金屬結(jié)構(gòu)體進行反應(yīng)，從而制造出想要的帶有核酸合成酶的金屬結(jié)構(gòu)體。
[0101]另外，也可以制成使頂端尖銳化的金屬結(jié)構(gòu)體，用與所述金屬不同的材料覆蓋所述金屬結(jié)構(gòu)體使得只露出頂端，利用所述金屬和覆蓋其的材料與核酸合成酶的粘接性的差異，使核酸合成酶只固定于金屬頂端部。
[0102]為了將核酸合成酶固定于露出部，可以利用金屬結(jié)構(gòu)體表面與薄膜表面的化學性質(zhì)的差異。例如，金屬為金而覆蓋金屬的膜為SiO2時，使存在于核酸合成酶內(nèi)的官能基團或?qū)脒M核酸合成酶的新的官能基團與導(dǎo)入進金的表面的官能基團進行反應(yīng)，從而只在金露出部上固定核酸合成酶。金屬結(jié)構(gòu)體的合適的大小因照射的光的波長而異。即，適于產(chǎn)生表面等離子體振子的共振頻率根據(jù)金屬結(jié)構(gòu)體表面的自由電子群與光的相互作用而定。如果激發(fā)光為可見光，則金屬結(jié)構(gòu)體的大小為，寬.高適于為30至IOOOnm左右，但并不限于該條件。另外，通過上述方法，將核酸合成酶固定于頂端部后，即使除去覆蓋金屬結(jié)構(gòu)體的薄膜，由表面等離子體振子所產(chǎn)生的效果也相同。在覆蓋金屬結(jié)構(gòu)體的薄膜對作為核酸分析器件的特性造成不良影響時，優(yōu)選將其除去。
[0103]核酸合成酶只要能延伸核酸即可，并無特別限制。作為這樣的例子，例如核酸是DNA時，可以舉出各種DNA聚合酶。另一方面，核酸是RNA時，可以舉出各種RNA聚合酶。
[0104]一種在臨近的兩個金結(jié)構(gòu)體之間固定有核酸合成酶的核酸分析器件的制造方法，其中，在將核酸合成酶固定于SiO2膜之前的步驟與實施例1相同，因此省略對其進行說明。將核酸合成酶固定于SiO2膜的方法考慮了各種方法，作為例子，記述了使用氨基硅烷處理的方法。通過氨基硅烷處理，在SiO2膜207上導(dǎo)入氨基。然后，與作為雙功能試劑的N- (4-馬來酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺(同仁化學研究所社制造的GMBS)進行反應(yīng)后，與核酸合成酶進行反應(yīng)，從而制成在臨近的兩個金結(jié)構(gòu)體之間固定有核酸合成酶的核酸分析器件。關(guān)于固定核酸合成酶的方法，前述的方法不過是一個例子，還可使用的方法有:利用與其他的硝酸纖維素、聚丙烯酰胺等的物理吸附的方法；利用組氨酸與鎳離子或鈷離子的特異性親和的方法；或者利用生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合的方法等。另外，作為金屬結(jié)構(gòu)體使用銀或鉬時，也可以同樣地制作。
[0105]接著，提供一種在金的圓錐形的頂端部固定有核酸合成酶的核酸分析器件的制造方法，其中，在將核酸合成酶固定于金的圓錐形的頂端部之前的步驟與實施例2相同，因此省略對其進行說明。`
[0106]與實施例2同樣，通過反應(yīng)性離子蝕刻(使用CF4/02)，對SiO2膜306進行蝕刻，使金305的頂端部露出。接著，通過羥基硅烷處理，在SiO2膜306上導(dǎo)入羥基，防止非特異性吸附。然后，采用氨基燒硫醇，形成SAM(Self-Assembled monolayer:自組裝單分子層)膜，在金表面上導(dǎo)入氨基后，采用N- (4-馬來酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺(同仁化學研究所社制造的GMBS)來導(dǎo)入能夠與巰基反應(yīng)的官能基團。最后，使存在于核酸合成酶307內(nèi)的巰基與所述官能基團進行反應(yīng)，從而制成在金的圓錐形的頂端部固定有核酸合成酶的結(jié)構(gòu)的核酸分析器件。關(guān)于固定核酸合成酶的方法，前述的方法不過是一個例子，還可使用的方法有:利用與其他的硝酸纖維素、聚丙烯酰胺等的物理吸附的方法；利用組氨酸與鎳離子或鈷離子的特異性親和的方法；或者利用生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合的方法等。另外，作為金屬結(jié)構(gòu)體使用銀或鉬時，也可以同樣地制作。
[0107]另外，在本實施例中說明的核酸分析器件可以用與實施例2同等的核酸分析裝置進行分析。與實施例2的不同之處只是用核酸合成酶來取代引物，這里省略說明。另外，此時，該裝置具備:對核酸分析器件供給具有熒光色素的核苷酸、引物以及核酸試樣的設(shè)備；對核酸分析器件照射光的設(shè)備；對于通過在核酸分析器件上共存核苷、引物以及核酸試樣所產(chǎn)生的核酸延伸反應(yīng)而被組入核酸鏈中的熒光色素的熒光進行測定的發(fā)光檢測設(shè)備。
[0108]另外，各 實施例可以進行適當?shù)慕M合。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸分析器件，其為利用熒光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其具備平滑的支持基體，在所述支持基體上具備含有頂點的形狀的金屬結(jié)構(gòu)體和由所述金屬以外的材料構(gòu)成的薄膜層，所述金屬結(jié)構(gòu)體的一部分從所述薄膜層露出，在所述露出的金屬結(jié)構(gòu)體表面具有用于分析試樣中的核酸的核酸探針，并且該核酸分析器件中具有I分子I分子地被各核酸探針捕捉的多個熒光分子，熒光分子被核酸探針捕捉到時熒光增強。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金屬結(jié)構(gòu)體為圓錐形。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金屬結(jié)構(gòu)體為多面體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分析器件，其特征在于，作為所述金屬結(jié)構(gòu)體，使用從金、銀或鉬中選出的貴金屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金屬結(jié)構(gòu)體以陣列狀配置于所述支持基體上。
6.使用權(quán)利要求1所述的核酸分析器件的核酸分析裝置，其特征在于，具備: 對核酸分析器件供給具有突光色素的核苷酸、核酸合成酶以及核酸試樣的設(shè)備； 對所述核酸分析器件 照射光的設(shè)備； 對該組入核酸鏈中的熒光色素的熒光進行測定的發(fā)光檢測設(shè)備，所述熒光色素是通過核酸分析器件上共存所述核苷酸、所述核酸合成酶以及所述核酸試樣而發(fā)生的核酸延伸反應(yīng)被組入核酸鏈中的； 從而取得所述核酸試樣的堿基序列信息。
7.—種核酸分析器件，其為利用熒光測定來分析試樣中的核酸的核酸分析器件，其具備平滑的支持基板，在所述支持基板上具備含有頂點的形狀的金屬結(jié)構(gòu)體和由所述金屬以外的材料構(gòu)成薄膜層，所述金屬結(jié)構(gòu)體的一部分從所述薄膜層露出，在所述露出的金屬結(jié)構(gòu)體表面，具有用于分析試樣中的核酸的核酸合成酶，并且該核酸分析器件中具有I分子I分子地被各核酸合成酶捕捉的多個熒光分子，熒光分子被核酸合成酶捕捉到時熒光增強。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金屬結(jié)構(gòu)體為圓錐形。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金屬結(jié)構(gòu)體為多面體。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分析器件，其特征在于，作為所述金屬結(jié)構(gòu)體，使用從金、銀或鉬中選出的貴金屬。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金屬結(jié)構(gòu)體以陣列狀配置于所述支持基板上。
12.使用權(quán)利要求7所述的核酸分析器件的核酸分析裝置，其特征在于，具備: 對核酸分析器件供給具有熒光色素的核苷酸、引物以及核酸試樣的設(shè)備； 對所述核酸分析器件照射光的設(shè)備； 對組入核酸鏈中的熒光色素產(chǎn)生的熒光進行測定的發(fā)光檢測設(shè)備，所述熒光色素是通過在核酸分析器件上共存所述核苷酸、所述引物以及所述核酸試樣而發(fā)生的核酸延伸反應(yīng)被組入核酸鏈中的； 從而取得所述核酸試樣的堿基序列信息。
【文檔編號】C12N15/09GK103451086SQ201310337180
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2007年7月20日
【發(fā)明者】齋藤俊郎, 高橋智, 奈良原正俊 申請人:株式會社日立高新技術(shù)