在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，包括將頭孢丙烯母核、?；噭┤芙庠趦伤嗑酆衔锶芤褐?，母核與?；噭┠柋葹?：1～4，加入固定化青霉素G?；负笤偌尤雰上喾峙湔{(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)pH＝4.5～7，在5～30℃反應(yīng)1～80h，酶在反應(yīng)體系中的濃度為50～150U/ml。本發(fā)明的方法可有效抑制青霉素酰化酶的水解活性，從而降低?；噭┑乃夂彤a(chǎn)物的水解程度。與用水作為介質(zhì)的方法相比，本方法使得產(chǎn)物與酶分配在不同的兩種水相中，反應(yīng)物充分與酶接觸，使得合成/水解比值得到了很大提高，頭孢丙烯的產(chǎn)率可提高20%，最高得率達(dá)到78%。本發(fā)明采用新型的可回用兩水相體系，體系回收再利用，降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及頭孢丙烯的制備方法，尤其涉及一種在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]頭孢丙烯(Cefprozil),是頭孢菌素類廣譜抗菌藥。對(duì)G+、G—菌和厭氧菌的抗菌活性均很強(qiáng)，對(duì)G+菌尤為突出，對(duì)￠-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，主要用于治療中耳炎，呼吸道感染及皮膚和皮膚軟組織感染等。頭孢丙烯生物利用度高，胃腸道吸收完全，抗菌譜廣，穩(wěn)定性好，是一個(gè)發(fā)展前景很好的半合成頭孢類藥物。
[0003]頭孢丙烯的化學(xué)合成主要有兩種方法，一種是以頭孢母核為起始原料，經(jīng)Wittig反應(yīng)在3-位引入丙烯基，7-位脫保護(hù)基團(tuán)后引入側(cè)鏈，最后在三氟乙酸作用下脫去7-位側(cè)鏈氨基和4-位羧基上的保護(hù)基團(tuán)；另一種是通過青霉素衍生物丙二烯氮雜環(huán)丁酮與Z-丙烯基有機(jī)銅試劑進(jìn)行1，4_共軛加成形成頭孢環(huán)，在3-位引入丙烯基，然后在7-位引入側(cè)鏈而得頭孢丙烯。
[0004]側(cè)鏈和母核含有羥基、羧基等活潑基團(tuán)，且化學(xué)合成的選擇性低，在反應(yīng)中往往會(huì)發(fā)生多種副反應(yīng)。為了避免這些副反應(yīng)，在合成時(shí)需要對(duì)活潑基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，通常選用硅烷化保護(hù)的母核與酸酐側(cè)鏈。一些反應(yīng)條件如溶劑為二氯甲烷或者二甲基甲酰胺，硅烷化反應(yīng)溫度為零下四十度，去保護(hù)基團(tuán)時(shí)要用較多鹽酸等都增加了化學(xué)合成的復(fù)雜性。
[0005]Vroom的研究中，將苯甘氨酸、對(duì)羥基苯甘氨酸制成相應(yīng)的酰胺衍生物,利用固定在凝膠和氨基酸多聚體上的青霉素?；傅拇呋饔茫铣闪祟^孢丙烯等一系列藥物。Usher研究了用側(cè)鏈羧酸酯和含有`氨基的母核在青霉素酰化酶的作用下催化合成日-族抗生素。其中以7-氨基-3-丙烯基-3-頭孢菌素-4-羧酸為起始原料，在固定化青霉素?；傅淖饔孟?，與對(duì)羥基苯甘氨酸乙二醇酯縮合得到頭孢丙烯。馮勝昔以7-苯乙酰氨基-3-E-丙烯基-3-頭孢菌素-4-羧酸(反式GPRA)為原料，在青霉素酰化酶作用下水解得到3-E-丙烯基-3-頭孢菌素-4-羧酸(反式APRA)，將固相酶過濾后，調(diào)濾液pH分離得到反式APRA。然后將實(shí)驗(yàn)用量的反式APRA與對(duì)羥基苯甘氨酸乙二醇酯在青霉素?；缸饔孟驴s合得到反式頭孢丙烯。
[0006]酶催化合成反應(yīng)在很多方面展現(xiàn)了比化學(xué)合成反應(yīng)更大的優(yōu)勢(shì)，酶法合成具有工藝簡(jiǎn)單，無(wú)需基團(tuán)保護(hù)，環(huán)境友好，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但是酶催化反應(yīng)其本身有一定的局限性，比如在應(yīng)用中普遍存在產(chǎn)物的積聚對(duì)酶帶來(lái)的反饋抑制，影響酶催化合成的能力并且容易造成產(chǎn)物的水解。為了克服這些弊端，需要選擇一個(gè)合適的反應(yīng)介質(zhì)，可以及時(shí)轉(zhuǎn)移酶周圍的產(chǎn)物并且保持底物與酶的接觸，這樣有利于促進(jìn)酶催化反應(yīng)的能力并且提高產(chǎn)率。
[0007]有機(jī)溶劑可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的分離，但是對(duì)酶的穩(wěn)定性有不利影響，兩水相體系的生物相容度高，成相條件溫和，不會(huì)破壞酶的活性，且在相界面處有低的界面能，振蕩后一相在另一相中形成微小乳液，傳質(zhì)速率快，通?？梢曰谖镔|(zhì)的分配系數(shù)不同而將其分離，實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)與分離的耦合。所以兩水相體系可以為酶催化反應(yīng)提供一個(gè)良好的介質(zhì)，基于對(duì)產(chǎn)物的分配作用可以將其及時(shí)轉(zhuǎn)移，產(chǎn)物與酶的分配在不同的相可以減少自身的水解以及對(duì)酶的抑制。
[0008]對(duì)于青霉素?；傅拇呋铣深^孢丙烯反應(yīng)的研究較少，用于酶催化合成的兩水相體系也是較為昂貴且為不易回收的聚乙二醇及鹽的體系。頭孢丙烯傳統(tǒng)化學(xué)合成方法存在弊端，亟待改進(jìn)，酶催化合成雖然有一定優(yōu)勢(shì)，但也有一定缺陷，傳統(tǒng)兩水相體系不能回收利用而限制了大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，該合成頭孢丙烯的方法生產(chǎn)成本低，較為經(jīng)濟(jì)，是一種溫和、有效、污染少、產(chǎn)率高的合成頭孢丙烯的方法，最高得率達(dá)到78%。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
一種在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，包括如下步驟:
(1)將頭孢丙烯母核、?；?劑溶解于可回用兩水相聚合物溶液中，其中加入的頭孢丙烯母核與?；噭┑哪柋葹?:1-4 ;
(2)將固定化青霉素?；讣尤氩襟E(I)獲得的溶液中，再加入使頭孢丙烯在兩相之間進(jìn)行分配的調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值為4.5-7.0，反應(yīng)體系在5-30°C反應(yīng)I-80 h，分離獲得所述頭孢丙烯，其中青霉素?；冈诜磻?yīng)體系中的濃度為50-150U/ml (IU=I個(gè)酶活單位)，頭孢丙烯母核在反應(yīng)體系中的濃度為10-80mM。
[0011]本發(fā)明步驟(I)中，所述頭孢丙烯母核為具有結(jié)構(gòu)式(I)的化合物或其鹽酸鹽，可從市售夠得，也可通過化學(xué)合成方法獲得，結(jié)構(gòu)式(I )的化合物為7-氨基-3-丙烯基頭孢烷酸:
【權(quán)利要求】
1.一種在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)將頭孢丙烯母核、?；噭┤芙庥诳苫赜脙伤嗑酆衔锶芤褐?，其中加入的頭孢丙烯母核與酰化試劑的摩爾比為1:1-4 ; (2)將固定化青霉素?；讣尤氩襟E(I)獲得的溶液中，再加入使頭孢丙烯在兩相之間進(jìn)行分配的調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH=4.5-7.0，反應(yīng)體系在5-30°C反應(yīng)I-80 h，分離獲得所述頭孢丙烯，其中青霉素?；冈诜磻?yīng)體系中的濃度為50-150U/ml，頭孢丙烯母核在反應(yīng)體系中的濃度為10-80mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述頭孢丙烯母核為具有結(jié)構(gòu)式(I )的7-氨基-3-丙烯基頭孢烷酸或其鹽酸鹽:
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述?；噭榫哂薪Y(jié)構(gòu)式(II)的化合物:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，其特征在于:所述可回用兩水相體系是由兩種可回用的聚合物形成的，每種可回用聚合物在兩水相體系中的濃度為2%-5% (w/w)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，其特征在于:所述可回用兩水相體系是溫度響應(yīng)的聚合物Pnb與PH響應(yīng)的聚合物Padb形成的兩水相體系，或者是兩種PH響應(yīng)的聚合物Padb與Padba形成的兩水相體系，或者是PH響應(yīng)的聚合物PADB與檸檬酸鈉形成的兩水相體系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，其特征在于:所述聚合物Pnb通過調(diào)節(jié)溫度至其低溫臨界溶解溫度對(duì)其進(jìn)行回收利用，所述聚合物Padb與Padba通過調(diào)節(jié)PH值至相應(yīng)聚合物的等電點(diǎn)進(jìn)行回收利用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，其特征在于:步驟(2)中，使頭孢丙烯在兩相之間進(jìn)行分配的調(diào)節(jié)劑為硫酸銨、磷酸二氫鈉或者磷酸二氫鉀，其濃度為IOmM-lOOmM。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:所述頭孢丙烯母核在反應(yīng)體系中的濃度為30-50mM ;所述頭孢丙烯母核與?；噭┑哪柋葹?:3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，其特征在于:步驟(2)中，反應(yīng)體系的反應(yīng)溫度為10-20°C ;反應(yīng)體系的反應(yīng)時(shí)間為30-80h ;反應(yīng)體系的pH值為5.0-6.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯的方法，其特征在于，所述固定化青霉素?；笧楣潭ɑ那嗝顾谿?；?；該青霉素G?；竵?lái)源于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)或幾產(chǎn) 喊菌(Alcaligenes faecalis)。
【文檔編號(hào)】C12P35/04GK103451259SQ201310341198
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月7日
【發(fā)明者】曹學(xué)君, 祝超慧, 唐子安, 趙志炎, 李玉丹, 陳佳伶 申請(qǐng)人:南通康鑫藥業(yè)有限公司, 華東理工大學(xué)