通過加強輔酶循環(huán)再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens 2，3-丁二醇產(chǎn)量的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明從B.amyloliqefaciens?B10-127中克隆出參與2,3-丁二醇合成途徑中輔酶循環(huán)再生的關(guān)鍵酶基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(gapdh)和3-羥基-2-丁酮還原酶(acr)，并將該基因與穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5-HpaII連接，成功構(gòu)建了攜帶基因gapdh和acr基因的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh，并轉(zhuǎn)入解淀粉芽孢桿菌B10-127中，獲得加強gapdh和acr基因表達(dá)的解淀粉芽孢桿菌pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh／B.amyloliquefaciens。原始菌株相比，重組菌2,3-丁二醇產(chǎn)量提高了14.7％，副產(chǎn)物如3-羥基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的積累分別降低65.6％、43.8％和42.4％，且發(fā)酵周期有所縮短。通過補料流加發(fā)酵，2,3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到121.3g／L。
【專利說明】通過加強輔酶循環(huán)再生速率提高Baci Ilusamy 1li quefac i ens 2，3-丁二酉孚產(chǎn)量
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]通過加強輔酶循環(huán)再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇
產(chǎn)量，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著能源資源的日益短缺和環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，開發(fā)可再生的生物質(zhì)資源為原料，經(jīng)過化學(xué)、生物及其集成方法生產(chǎn)各種化學(xué)品、功能材料和能源物質(zhì)的生物煉制技術(shù)越來越受到國內(nèi)外的高度重視。2，3-丁二醇是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料及航空航天等領(lǐng)域。2，3- 丁二醇脫氫生成雙乙酰，是一種高價值食品風(fēng)味劑，具有一定的抑菌效果；在脫氫酶的作用下，生成的3-羥基-2- 丁酮(乙偶姻)是一種應(yīng)用廣泛的天然食用香料；脫水生成的甲乙酮可作為一種高價值的液體燃料添加劑，亦是重要的低沸點溶劑，應(yīng)用于涂料、粘結(jié)劑、潤滑劑、燃料、油墨等行業(yè)；脫水生成的1，3_ 丁二烯可用于合成橡膠、ABS樹脂及SBS彈性體等；酯化產(chǎn)品是合成聚酯和聚氨酯的前體。而且2，3-丁二醇是一種極具價值的液體燃料，其燃燒值與甲醇(22.1kJ / g)、乙醇(29.0kJ / g)相當(dāng)。由于2，3- 丁二醇的高辛烷值，它可作為汽油的辛烷值提升劑或航空燃料另外，2，3- 丁二醇及其衍生物亦可廣泛用于藥用載體、增塑劑、柔軟劑等的生產(chǎn)。
[0003]近年來用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇取得了較好的實驗室研究結(jié)果，但生物法生產(chǎn)2，3- 丁二醇尚未實現(xiàn)工業(yè)化。目前報道的2，3- 丁二醇生產(chǎn)菌株多為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)腸桿菌屬(Enterobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)等，這些菌種具有潛在致病性，不符合符合工業(yè)化 安全生產(chǎn)的要求。因此，使用安全菌種利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇具有良好的工業(yè)化前景。本發(fā)明人在前期研究中篩選得到一株安全菌株Bacillusamyloliquefaciens,該菌具有良好的2,3- 丁二醇生產(chǎn)潛力，但是發(fā)酵過程中積累較多的副產(chǎn)物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸等。葡萄糖代謝合成2，3- 丁二醇的過程也是一個氧化還原反應(yīng)，該反應(yīng)途徑中需要輔酶NADH和NAD+的參與。葡萄糖首先經(jīng)過EMP途徑生產(chǎn)丙酮酸，此途徑中的關(guān)鍵酶3-磷酸甘油醛脫氫酶氧化3-磷酸甘油醛合成磷酸烯醇式丙酮酸，需要氧化型輔酶NAD+的參與；隨后丙酮酸經(jīng)過三個關(guān)鍵酶催化合成2，3_ 丁二醇，而2，3-丁二醇的合成最后一步是乙偶姻還原酶催化還原乙偶姻合成2，3-丁二醇，此反應(yīng)需要還原型輔酶NADH的參與。3-磷酸甘油醛脫氫酶和乙偶姻還原酶組成一個輔酶循環(huán)再生體系。為進(jìn)一步提高該菌株2，3_ 丁二醇合成能力，并減少副產(chǎn)物的積累，發(fā)明人提出了一種通過加強輔酶循環(huán)再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇能力的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種通過加強輔酶循環(huán)再生速率提高Bacillusamyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇能力的方法。[0005]本發(fā)明所使用菌種為Bacillus amyloliquefaciens B10-127 (已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學(xué)；保藏日期:2012年9月14日；保藏編號為:CCTCC NO:M2012349)。本發(fā)明首先從解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)B10-127中克隆出參與2, 3_ 丁二醇合成途徑中輔酶循環(huán)再生的關(guān)鍵酶基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(gapdh)和3-羥基-2-丁酮還原酶(acr)，并將該基因與穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5_HpaII連接，成功構(gòu)建了攜帶基因gapA和acr基因的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5-Hpa 11 -acr-Hap 11 -gap dh,并轉(zhuǎn)入解淀粉芽孢桿菌B10-127中，獲得加強gapdh和acr基因表達(dá)的解淀粉芽抱桿菌 pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh / B.amyloliquefaciens (重新命名為PAG)。并對原始菌及重組菌pAG進(jìn)行2，3- 丁二醇發(fā)酵性能檢測，說明加強gapdh和acr基因的表達(dá)能夠提高2，3- 丁二醇產(chǎn)量，降低副產(chǎn)物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的積累。[0006]基于以上研究，對原始菌以及重組菌pAG進(jìn)行發(fā)酵實驗，結(jié)果表明，與原始菌株相t匕，重組菌2，3- 丁二醇產(chǎn)量提高了 14.7%，副產(chǎn)物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的積累分別降低65.6%、43.8%和42.4%，且發(fā)酵周期有所縮短。為了進(jìn)一步提高重組菌的發(fā)酵性能，我們采用補料流加，發(fā)酵48h，發(fā)酵液中2，3- 丁二醇積累量達(dá)到121.3g/L，這是現(xiàn)有技術(shù)所不能達(dá)到的結(jié)果。
[0007]本發(fā)明的有益效果:
[0008]本發(fā)明人所用菌株是一株安全菌株B.amyloliquefaciens,通過加強輔酶循環(huán)再生速率提高B.amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇效率,并減少發(fā)酵過程中副產(chǎn)物如3-羥基-2-丁酮、乙酸、乳酸和丁二酸等的積累，這有利于提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1 質(zhì)粒 pMA5-HpaI1-acr_HapI1-gapdh 構(gòu)建不意圖
[0010]圖2SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況
【具體實施方式】
[0011]實施例1:目的基因的擴增及重組解淀粉芽孢桿菌的構(gòu)建
[0012]質(zhì)粒pMA5-HpaI1-acr_HapI1-gapdh構(gòu)建示意圖如圖1所示,具體過程如下:
[0013]首先，以菌株B10-127的染色體DNA為模板，利用引物Pl和P2，通過PCR技術(shù)擴增得到一段901bp大小的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的acr基因，將純化后的acr基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI消化后，與同樣經(jīng)過上述兩種限制性內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒pMA5-HapII 連接(pMA5-HapII 序列如 SED ID NO:3 所示)，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMA5-HapII_acr，經(jīng)雙酶切驗證后，表明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。隨后，利用引物P3和P4通過PCR擴增得到核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示的基因gapdh，將純化后的acr基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和BamHI消化后，與同樣經(jīng)過上述兩種限制性內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒pMA5_HapII連接，構(gòu)建另一個重組載體pMA5-HapI1-gapdh ;然后以重組載體pMA5-HapI1-gapdh為模板，利用引物P4和P5通過PCR技術(shù)擴增出帶有啟動子HapII的基因片段HapI1-gapdh ;最后，將該基因片段通過限制性內(nèi)切酶Mlu I處理后，與同樣經(jīng)過Mlu I處理和去磷酸化處理的載體pMA5-HapI1-acr在T4DNA連接酶的作用下16°C過夜連接，將連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)E.coli JM109中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證并確認(rèn)重組質(zhì)粒 pMA5-HapI1-acr_HapI1-gapdh 構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒 pMA5-HapI1-acr_HapI1-gapdh以電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至解淀粉芽孢桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，即得到重組解淀粉芽孢桿菌pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh / B.amyloliquefaciens。對原始菌以及重組菌 pAG 胞內(nèi)蛋白表達(dá)分析可以看出，基因gapdh和acr在重組菌pAG成功實現(xiàn)過量表達(dá)。
[0014]以B.amyloliquefaciens基因組總DNA為模板,設(shè)計兩條引物,PCR擴增引物設(shè)計如下:
[0015]Pl:5? -CGCATATGATGAAAGCGGCAAGATGGC-3’ (Nde I),
[0016]P2:5’ -CGGGATCCTTAATTCGGTTTTACTAAG-3’ (BamH I)。
[0017]P3:5， -CGGGATCCATGAAGGTAAAAGTAGC-3， (BamHI),
[0018]P4:5’ -CGACGCGTCTACACAGCTGACGGGTG-3’ (Mlu I),
[0019]P5:5’ -CGACGCGTTTTTGAGTGATCTTCTC-3’ (MluI)
[0020]實施例3:菌原始菌及重組菌的發(fā)酵性能驗證
[0021](I)種子培養(yǎng)
[0022]從活化平板上挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速160r / min，培養(yǎng)時間為12h左右`，種子培養(yǎng)基組成:酵母提取物5g / L，胰蛋白胨IOg /L, NaCllOg / L0
[0023](2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0024]初始發(fā)酵培養(yǎng)體積為2.5L，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:
[0025]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:葡萄糖160g/L,玉米衆(zhòng)5g / L,尿素3g/L,檸檬酸鈉6g/L,K2HP044g / L，MgSO40.2g/L ;將上述發(fā)酵培養(yǎng)基用5mol / L的NaOH調(diào)節(jié)其pH至6.5，在121 °C下高溫滅菌30min。
[0026]發(fā)酵發(fā)酵條件:將上述培養(yǎng)好的種子液按4%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度37°C，空氣流量為120m3 / h*m3培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)速為350r / min。定時取樣測定細(xì)胞濃度、底物殘留量和3-羥基-2- 丁酮產(chǎn)量。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中產(chǎn)物2，3- 丁二醇和乙偶姻用氣相色譜測定(GC-1690J氣相色譜儀，杭州科曉化工儀器公司)。色譜條件如下:毛細(xì)管柱，30mX0.32mn色譜柱中固定液為AT.SE-30，，檢測器為FID，柱溫150°C，汽化室與檢測器的溫度均為250°C，載氣為N2，流速0.1Mpa,進(jìn)樣量2 u L，采用外標(biāo)法定量。利用液相色譜分析發(fā)酵液中有機酸含量。色譜條件:色譜柱為KC-811，流動相A為4mM高氯酸，流動相B為超純水，流動相梯度為0~7.5min25%~75% A，7.51~15min75% A，流動相流速為1.0mL / min，紫外檢測波長為210nn，進(jìn)樣量為20iU，柱溫為60°C。結(jié)果如表I所示，與原始菌株相比，重組菌2，3- 丁二醇產(chǎn)量提高了 14.7%，副產(chǎn)物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的積累分別降低65.6%,43.8%和42.4%，且發(fā)酵周期有所縮短。
[0027](3)補料流加發(fā)酵培養(yǎng)
[0028]種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)條件和實施例3(1)和3(2)相同，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖殘留濃度低于20g/L，通過補料泵一次性補加60-70g/L左右的葡萄糖，當(dāng)葡萄糖消耗速率低于6g / L *h時停止補料，當(dāng)殘留在發(fā)酵液中的葡萄糖被消耗完時結(jié)束發(fā)酵。通過補料流加發(fā)酵，2，3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到121.3g/L。
[0029]表1原始菌以及重組菌pAG發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇性能比較
【權(quán)利要求】
1.一種加強輔酶循環(huán)再生速率的重組解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens),其特征在于:將SEQ ID NO:1所示的3-羥基-2- 丁酮還原酶基因acr和SEQ ID NO:2所示的3-磷酸甘油醛脫羧酶基因gapdh共同克隆到穿梭載體pMA5-HpaII構(gòu)建成為重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh并轉(zhuǎn)化至保藏編號為CCTCC NO:M2012349的解淀粉芽孢桿菌中，從而提高解淀粉芽孢桿菌合成2，3- 丁二醇的能力。
2.將權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌用于2，3_丁二醇發(fā)酵上的應(yīng)用，其特征是與原始的解淀粉芽孢桿菌相比，重組菌2，3_ 丁二醇產(chǎn)量提高了約14.7%，副產(chǎn)物如3-羥基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的積累分別降低65.6%、43.8%和42.4%，且發(fā)酵周期有所縮短。通過補料流加 發(fā)酵，2，3- 丁二醇產(chǎn)量達(dá)到121.3g/L。
【文檔編號】C12R1/07GK103602624SQ201310342415
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月8日
【發(fā)明者】饒志明, 楊套偉, 張顯, 徐美娟, 滿在偉 申請人:江南大學(xué)