一種水稻開花素重組蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種水稻開花素重組蛋白的制備方法，所述方法包括RNA提取、重組載體制備、基因工程菌獲得、重組蛋白分離純化等步驟；實驗證明，在本發(fā)明低溫條件16～20℃下，誘導的蛋白可溶性明顯增大，包涵體含量降低。本發(fā)明首次嘗試了對植物開花素蛋白OsHd3a的原核表達，成功克隆了OsHd3a基因并構建了表達載體，重組質粒經(jīng)酶切鑒定，再經(jīng)測序確認序列正確，最后經(jīng)過Ni-NTAResin分離純化得到重組蛋白Hd3a，為將其應用于植物開花生理過程的調控提供了基礎，對植物生產(chǎn)實踐具有重要的意義。
【專利說明】一種水稻開花素重組蛋白的制備方法
(-)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水稻開花素重組蛋白的制備方法。
(二)【背景技術】
[0002]開花是綠色植物特有的現(xiàn)象，開花植物使得世界絢麗多彩。多年來，科學家一直在對植物開花機理進行不懈的探索，并希望對植物開花的周期進行調控。1937年，俄國植物生理學家Mikhail Chailakhyan提出開花素(Florigen)假說,認為植物葉片接收到光信號后會產(chǎn)生某種物質并傳遞到植物莖頂端誘導花芽產(chǎn)生。利用嫁接等研究方法也進一步發(fā)現(xiàn)植物葉子可以通過感受日晝長短變化來感受季節(jié)變化，并因此而產(chǎn)生某種物質，引發(fā)一種從葉到莖尖的長距離信號傳導，最終促進開花。這種可能的物質被稱為開花素，但是幾十年來開花素的化學本質一直沒有被鑒定。最近幾年在擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oriza sativa)中同時發(fā)現(xiàn)了開花素，它是一種可移動的蛋白分子，參與花器官形成的誘導。在擬南芥中開花素是由葉片中Flowering Locus T(FT)基因編碼的FT蛋白，可通過維管系統(tǒng)運送至莖尖，激活其它開花相關基因并引起開花。水稻中的FT同源蛋白是0sHd3a，能從葉中傳遞到莖尖分生組織從而導致水稻開花。在番爺(Solanum Iycopersicum)中也存在 FT 同源基因 SINGLE-FLOWER TRUSS (SFT)，在煙草(Nicotiana tabacum)或番茄中過量表達FT或SFT基因都會促進提前開花。
[0003]開花素相關的研究結果給我們利用開花的分子機制對植物開花進行調控提供了重要啟示，開花素既然是葉片中產(chǎn)生并可以移動的蛋白，那么就可以通過人工的方法生產(chǎn)開花素蛋白并施用于植物，如果可以應用于農(nóng)作物、花卉觀賞園藝等植物進行開花周期的調控，那么具有巨大的應用前景和商業(yè)價值。植物的開花年限，既是科學家研究的熱點也是實踐生產(chǎn)中需要解決的問題。
(三)
【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種水稻開花素重組蛋白的制備方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術方案是:
[0006]一種水稻開花素重組蛋白的制備方法，所述方法包括:
[0007](I)取開花期水稻葉片，用液氮研磨后，按常規(guī)方法提取總RNA ；
[0008](2)以水稻總RNA為模板，用擴增弓I物進行RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆至PMD18-T，獲得重組載體pMD18-T-0sHd3a ；
[0009]所述擴增引物序列如下:
[0010]h游引物:5’ -CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3’ ；
[0011]下游引物:5’-GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3，；
[0012]擴增得到的核苷酸序列如下:
[0013]ATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAGGGACCCTCTTGTGGTT GGTAGGGTTGTGGGTGATGTGCTGGACGCGTTCGTCCGGA GCACCAACCTCAAGGTCACCTATGGCTCCAAGACCGTGTC CAATGGCTGCGAGCTCAAGCCGTCCATGGTCACCCACCAG CCTAGGGTCGAGGTCGGCGGCAATGACATGAGGACATTCT ACACCCTTGTGATGGTAGACCCAGATGCACCAAGCCCAAG TGACCCTAACCTTAGGGAGTATCTACATTGGTTGGTCACTG ATATTCCTGGTACTACTGCAGCGTCATTTGGGCAAGAGGTG ATGTGCTACGAGAGCCCAAGGCCAACCATGGGGATCCACC GGCTGGTGTTCGTGCTGTTCCAGCAGCTGGGGCGTCAGAC AGTGTACGCGCCCGGGTGGCGTCAGAACTTCAACACCAA GGACTTCGCCGAGCTCTACAACCTCGGCTCGCCGGTCGCC GCCGTCTACTTCAACTGCCAGCGCGAGGCAGGCTCCGGCG GCAGGAGGGTCTACCCCTAG ；
[0014]其編碼的氨基酸序列如下:
[0015]MAGSGRDRDPLVVGRVVGDVLDAFVRSTNLKVTYGSKTVS NGCELKPSMVTHQPRVEVGGNDMRTFYTLVMVDPDAPSPS DPNLREYLHWLVTDIPGTTAASFGQEVMCYESPRPTMGIHRL VFVLFQQLGRQTVYAPGffRQNFNTKDFAELYNLGSPVAAVY FNCQREAGSGGRRVYP ；
[0016](3)測序正確的重組載體1?18-1'-08!1(13&經(jīng)限制性內切酶恥61/10 I酶切后，將含目的基因片段插入pET28b，構建重組表達載體PET28b-0sHd3a，經(jīng)過測序驗證后轉入大腸桿菌菌株BL21 (DE3)；
[0017](4)含重組質粒的表達菌株BL21 (DE3)在37°C活化培養(yǎng)后，挑取單菌落轉入LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)12h，所得菌液按照1:100體積比加入到含卡那霉素50 μ g/m L的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)至OD6tltl為0.4，加入終濃度0.50mmol/L的IPTG，20°C誘導培養(yǎng)至OD6c?為1.0 ;實驗證明，在本發(fā)明的溫度條件(20°C)下，誘導的蛋白可溶性明顯增大，包涵體含量降低。
[0018](5)步驟(4)所得菌液經(jīng)分離純化，得到所述水稻開花素重組蛋白。
[0019]優(yōu)選的，為增加可溶性蛋白的含量，步驟(4)誘導培養(yǎng)時培養(yǎng)基中還可添加有2g/L的葡萄糖。
[0020]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明首次嘗試了對植物開花素蛋白0sHd3a的原核表達，成功克隆了 0sHd3a基因并構建了表達載體，重組質粒經(jīng)酶切鑒定，再經(jīng)測序確認序列正確，最后經(jīng)過N1-NTA Resin分離純化得到重組蛋白Hd3a，為將其應用于植物開花生理過程的調控提供了基礎，對植物生產(chǎn)實踐具有重要的意義。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1為重組質粒pET-28b_0sHd3a的酶切結果分析；M:marker ; 1:重組質粒pET-28b_0sHd3a ；
[0022]圖2為親和層析后目的蛋白SDS-PAGE圖；
[0023]圖3為IPTG誘導濃度的優(yōu)化；IPTG濃度為:1:不加IPTG的對照；2:0.25mmol/L ；3:0.SOmmoI /I, ；4: 1.00mmol/L。
(五)【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0025]實施例1:
[0026]一、獲得0sHd3a基因的編碼區(qū)DAN片段；
[0027]水稻總RNA提取采用RNAiso Reagent試劑盒(Takara公司)進行:取開花期水稻葉片lOOmg，用液氮研磨后，加入提取液按照說明書提取總RNA。提取的總RNA加入DNase去除基因組DNA，進行氯仿抽提純化后溶于RNase free ddH20，隨后參照PrimeScript RT-PCRKit使用說明合成cDNA —鏈。水稻開花調控基因0sHd3a擴增的正向引物為:5’ -CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3’，下劃線為限制酶 Nde I。反向引物為:5’ -GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3’，下劃線為限制酶Xho I。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后進行凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆至PMD18-T (上海生工)載體進行測序。
[0028]二、構建含有目的基因的大腸桿菌重組表達載體PET28b-0sHd3a ;測序正確的pMD18-T-0sHd3a載體和pET28b(Novagen)分別經(jīng)限制性內切酶Ndel/Xhol酶切后，連接，將目的基因片段(SEQ ID N0.3)插入pET28b，構建pET28b-0sHd3a載體，獲得目標基因融合有His-tag的重組表達載體。pET28b-0sHd3a經(jīng)過測序驗證后轉入大腸桿菌菌株BL21 (DE3)進行重組蛋白(SEQ ID N0.4)的表達研究。重組載體的酶切驗證圖見附圖1。
[0029]三、重組質粒轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，獲得基因工程菌。
[0030](I)菌株的活化及擴大培養(yǎng)
[0031]LB液體培養(yǎng)基配制:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化鈉IOg,蒸懼水1000mL。
[0032]LB平板即LB固體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基添加15g/L瓊脂。
[0033]取于_70°C保存的大腸桿菌BL21 (DE3)菌種，用滅菌牙簽沾取冰渣，劃線于LB平板(LB液體培養(yǎng)基+15g/ L瓊脂)上，.于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時。用滅菌牙簽挑取單菌落放入含5mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于30°C搖床(轉速200r/min)培養(yǎng)12小時。取500 μ L試管中菌液，轉入含50mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37°C搖床(轉速200r/min)培養(yǎng)3小時，此時OD6qq=0.4左右。
[0034](2)感受態(tài)細胞的制備
[0035]培養(yǎng)液冰浴10分鐘，將90mL培養(yǎng)液轉入2支50ml離心管中，4°C，4500r/min下離心5分鐘，棄上清液。用30mL0.lmol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，4°C，4500r/min下離心3分鐘，棄上清液。用IOmL0.lmol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，冰浴30分鐘，4°C，4000r/min下離心3分鐘，棄上清液。用2mL0.lmol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，即制成感受態(tài)細胞。
[0036](3)感受態(tài)細胞的轉化
[0037]取感受態(tài)細胞菌液50 μ L，加入I μ L含有目的基因的質粒pET28b_0sHd3a，輕輕吸打混勻，冰浴20分鐘。42°C熱擊60秒，迅速置于冰上2分鐘。加入LB液體培養(yǎng)基200 μ L，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)I小時。取培養(yǎng)后的菌液200 μ L，涂布于含卡那霉素的LB平板(卡那霉素含量50μ g/mL)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時。
[0038]四、重組蛋白分離純化
[0039]2XYT培養(yǎng)基配制:蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaC15g，蒸餾水lOOOmL，pH7.0。
[0040]含重組質粒以及空質粒的表達菌株BL21 (DE3)在37°C活化培養(yǎng)后，挑取單菌落轉入含5mL2XYT培養(yǎng)基(含卡那霉素50μ g/mL)中37°C振蕩培養(yǎng)12h，取菌液500 μ L加入到含50mL2XYT培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μ g/mL)中，37°C搖床(轉速200r/min)培養(yǎng)OD6tltl至
0.4，加入IPTG (0.50mmol/L)誘導，20°C誘導培養(yǎng)OD6tltl至1.0。離心收集菌體，保留上清液用于檢測。菌體沉淀加入BugBuster protein extraction reagent (Merck公司)進行溫和吸打懸浮，室溫孵育20min后于4°C、14000r/min離心20min，上清液和沉淀分別保存?zhèn)溆谩?br> [0041]經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測確定目標蛋白所在的組分后，上清液采用His bindpurification kit(Merck公司)進行N1-NTA Resin親和柱層析,方法按照說明書進行。重組蛋白由唑洗脫后在4°C條件下，IOmmoI/L磷酸緩沖液PBS (pH7.0)中進行透析，更換磷酸緩沖液4次,共透析16h以除去咪唑和NaCl等成分,透析后的蛋白經(jīng)Bradford法定量后進行電泳分析，電泳圖中可以觀察到重組蛋白目的條帶(圖2)。上清液中蛋白來自于細胞內部，同時表明了目標蛋白主要是胞內的可溶性表達?？梢钥闯隼肗1-NTA Resin能成功純化出重組目標蛋白，目標帶相對較純，這說明his-tag能有效的與鎳柱結合，達到高效分離純化植物開花素蛋白的目的。
[0042]本發(fā)明研制的過程中開始發(fā)現(xiàn)蛋白表達量低，且不可溶的包涵體較多，經(jīng)過改進和條件優(yōu)化，提高了蛋白表達量以及可溶性。
[0043]蛋白表達條件的優(yōu)化:
[0044]取于_70°C保存的轉質粒的BL21 (DE3)菌株，用滅菌牙簽分別劃線于LB平板(卡那霉素含量50 μ g/mL), 37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時。用滅菌牙簽挑取單菌落，放入含5mL2X YT培養(yǎng)基(含卡那霉素5(8/1)的試管中，371:搖床(轉速20017/111)培養(yǎng)12小時。取試管中的菌液500 μ L，分別加入到含50mL2XYT培養(yǎng)基(卡那霉素含量50 μ g/mL)的錐形瓶中，37°C搖床(轉速200r/min)培養(yǎng)2.5小時，此時OD6tltl=0.4左右。以不加IPTG為對照，進行IPTG條件優(yōu)化，IPTG設置系列濃度梯度，包括從0.25,0.50，1.00mmol/L，誘導時間3小時和5小時，20°C搖床(轉速200r/min)誘導。取ImL菌液于EP管中，10000r/min離心I分鐘，去上清液。加100 μ L PBS懸浮沉淀，即制成電泳樣品。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法對樣品進行電泳。蛋白電泳結果見圖3。
[0045]結果顯示，0.50mmol/L IPTG能顯著誘導重組蛋白的產(chǎn)生，大于此濃度后，對蛋白表達量的誘導效果不大，因此采取濃度為0.50mmol/L的IPTG進行重組蛋白誘導。而在溫度為20°C條件下培養(yǎng)，誘導的蛋白可溶性明顯增大，包涵體含量降低。
[0046]實施例2:重組開花素蛋白對開花植物番茄催花的生物測定
[0047]以未開花的苗齡一致的番茄幼苗(番茄品種浙雜502)進行重組蛋白活性生物測定。供試番茄幼苗分三組，注射重組開花素蛋白(SEQ ID N0.4)處理組、注射不含蛋白的緩沖液處理組、自然培養(yǎng)的不處理的空白對照組，從葉脈或葉柄處進行注射，重組蛋白的最終注射用量分別為每株2、10、50μ8，不含緩沖液為lOmmol/L磷酸緩沖液PBS (pH7.0)，每個處理有20株苗。處理的和未處理的植物苗在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計自然苗及處理苗的開花時間、開花率等開花情況。結果表明，各種處理的苗最終開花率接近，達到95%以上。但是，蛋白處理組的開花率達到90%以上的時間比未處理的自然苗和緩沖液處理的對照苗平均提前了 5天，表明重組開花素蛋白對所測番茄開花進程有一定的促進作用。
【權利要求】
1.一種水稻開花素重組蛋白的制備方法，所述方法包括: (1)取開花期水稻葉片，用液氮研磨后，提取總RNA； (2)以水稻總RNA為模板，用擴增引物進行RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆至PMD18-T，獲得重組載體pMD18-T-0sHd3a ； 所述擴增引物序列如下: 上游引物:5，-CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG-3，； 下游引物:5，-GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG-3，； (3)測序正確的重組載體pMD18-T-0sHd3a經(jīng)限制性內切酶Ndel/Xhol酶切后，將含目的基因片段插入pET28b，構建重組表達載體PET28b-0sHd3a，經(jīng)過測序驗證后轉入大腸桿菌菌株 BL21 (DE3)； (4)含重組質粒的表達菌株BL21(DE3)在37°C活化培養(yǎng)后，挑取單菌落轉入LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)12h，所得菌液按照1:100體積比加入到含卡那霉素50 μ g/m L的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200r/min培養(yǎng)至OD6tltl為0.4，加入終濃度0.50mmol/L的IPTG，20°C誘導培養(yǎng)至OD6tltl為1.0 ; (5)步驟(4)所得菌液經(jīng)分離純化，得到所述水稻開花素重組蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)誘導培養(yǎng)時培養(yǎng)基中還添加有2g/L的葡萄 糖。
【文檔編號】C12N15/70GK103436551SQ201310346525
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月9日 優(yōu)先權日:2013年8月9日
【發(fā)明者】朱廷恒, 王渭霞, 嚴宏波, 汪琨, 崔志峰 申請人:浙江工業(yè)大學