一種ck15角蛋白及基因的應(yīng)用方法
【專利摘要】一種CK15角蛋白及基因的應(yīng)用方法，它基礎(chǔ)于CK15角蛋白及基因在制備早期診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，它的應(yīng)用方法為：檢測(cè)CK15角蛋白基因在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織及其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)，總mRNA的抽提，使用Biometra公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用REST2009軟件分析,P<0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CK15角蛋白在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織顯著上調(diào)，它可以作為診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的特異標(biāo)志，使尿路上皮移行細(xì)胞癌早期診斷，提高診斷的準(zhǔn)確性及及術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
【專利說(shuō)明】—種CK15角蛋白及基因的應(yīng)用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉蛋白及基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種CK15角蛋白及基因在移行細(xì)胞癌早期診斷及術(shù)后快速動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的應(yīng)用方法。

【背景技術(shù)】
[0002]尿路上皮多器官癌是指腎盂、輸尿管和膀胱等泌尿系統(tǒng)多個(gè)器官同時(shí)或先后發(fā)生移行細(xì)胞癌，尿路上皮移行細(xì)胞癌在泌尿系腫瘤中占有很重要的位置，是我國(guó)常見(jiàn)腫瘤之一。移行細(xì)胞癌發(fā)生率占尿路上皮腫瘤的90%以上。
[0003]尿路上皮移行細(xì)胞癌的典型生物學(xué)特征之一是多發(fā)性。這種多發(fā)性不僅表現(xiàn)為泌尿系同一器官同時(shí)或先后出現(xiàn)幾個(gè)腫瘤，還表現(xiàn)為當(dāng)尿路上皮系統(tǒng)的某個(gè)器官發(fā)生腫瘤，在泌尿系統(tǒng)的其他部位、同側(cè)或?qū)?cè)可同時(shí)或先后出現(xiàn)腫瘤。臨床上尿路上皮多器官癌出現(xiàn)順序多為順尿流方向，且多見(jiàn)于解剖學(xué)上相鄰的兩個(gè)器官之間。泌尿系統(tǒng)各器官發(fā)生多器官癌的幾率為:腎盂37.5%，輸尿管75.0%，膀胱8.3%，尿道66.7%。以輸尿管、尿道和腎盂的發(fā)生率較高。尿路上皮多器官癌還沒(méi)有特異的診斷方法。目前臨床對(duì)于該疾病的術(shù)前診斷主要有影像學(xué)檢查、尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查、尿熒光原位雜交技術(shù)尿脫落細(xì)胞檢測(cè)、輸尿管鏡檢活檢等，其中以尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查最為常用，傳統(tǒng)的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查診斷敏感性低。因此亟需出現(xiàn)新的方法以提高其早期診斷敏感性及術(shù)后復(fù)發(fā)的快速動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
[0004]CK基因是上皮細(xì)胞中保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的纖維蛋白家族。CK15基因也被稱為KRT15;K15; KlCO0該基因的產(chǎn)物被稱為CK15角蛋白，存在于多種器官的上皮細(xì)胞，包括部分食道、宮頸及角膜邊緣細(xì)胞。人類的KRT15基因位于17q 21.2染色體區(qū)域，全長(zhǎng)456氨基酸，分子大小49212 Da。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種CK15角蛋白基因的應(yīng)用方法，它可以作為診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的特異標(biāo)志基因，使尿路上皮移行細(xì)胞癌在早期即可快速診斷發(fā)現(xiàn)，、提高診斷的準(zhǔn)確性及早期無(wú)創(chuàng)性診斷及術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
[0006]為了解決【背景技術(shù)】所存在的問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:所述的CK15角蛋白及基因在尿路上皮移行細(xì)胞癌的早期診斷，手術(shù)后期隨訪等試劑產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述用免疫檢測(cè)診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品包括--與CK15蛋白特異性結(jié)合的抗體及非抗體類結(jié)合體，它的應(yīng)用方法包括(A)、組織分離，手術(shù)切除待檢的尿路上皮組織，分離后，迅速提取病灶及周圍5cm以外正常組織，將待檢樣品組織塊剪成適當(dāng)大小印壓于玻片上，用4%多聚甲醒固定5?10分鐘，晾干；
(B)、將制備好的樣品置于2%BSA或10%BSA中，于37°C孵育濕盒內(nèi)封閉30min；
(C)、加入商業(yè)生產(chǎn)或自行制備的CK15蛋白的特異性抗體，用0.0lM pH7.4的PBS稀釋進(jìn)行1:100稀釋，于37 °C孵育30 min過(guò)夜孵育，然后用0.0lM濃度的PBST漂洗5 minX3次； (D)、加熒光標(biāo)記的CK15蛋白的二抗抗體，于37°C濕盒避光孵育30 1^11，再用0.0現(xiàn)的PBST避光漂洗5minX 3次，用甘油緩沖液封片并鏡檢，陽(yáng)性結(jié)果為人類尿路上皮移行細(xì)胞癌。
[0007]所述的診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品包括:用CK15角蛋白免疫檢測(cè)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品，它的應(yīng)用方法為(a)、組織分離，手術(shù)切除待檢的尿路上皮組織，分離后，迅速提取病灶及周圍5cm以外正常組織，放入液氮保存，逆轉(zhuǎn)錄酶為 M-MLV Reverse Transcriptase, Takara C0.PCR 試劑 TaqDNA 聚合酶、dNTP, CK15角蛋白基因的弓丨物是 Forward: 5，-ggaagagatccgggacaaa-3，Reverse: 5，-tgtcaatctccaggacaacg-3’，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為456 bp,以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,其引物Forward: 5’-agccatgtacgtagccatcc-3’ Reverse:5’ -
tcacaatgcctgtggtacg-3’，β-actin 擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為 400bp ；
(b)、總mRNA的抽提步驟具體如下:將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入ImlTRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，將勻漿樣品在室溫放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離，每使用Iml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘；4°C 1000Xg離心15分鐘使樣品分為三層:將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)如離心管，用異丙醇沉淀水相中的RNA ;每使用Iml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘；用75 %乙醇洗滌RNA沉淀，每使用Iml TRIzol至少加Iml 75 %乙醇，2_8°C不超過(guò)7500Xg離心5分鐘，棄上清；室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，加入25-200 μ I無(wú)Rnase水，55-60°C放置10分鐘使RNA溶解；_70°C保存，為除去基因組DNA污染，全部RNA均用無(wú)RNA酶的DNA酶I消化；
(c)、使用B1metra公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，檢測(cè)CK15角蛋白基因在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織及其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)，反應(yīng)體系如下:總體積20 μ 1，SYBR PremixEX Taq 10 μ 1，引物各0.2 μ 1，DNA I μ 1，ddH20 8.2 μ 1，離心混勻，放入PCR儀中反應(yīng)，以β -actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用REST2009軟件分析，P〈0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CK15角蛋白在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織顯著上調(diào)；
本發(fā)明具有以下有益效果:它可以作為診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的特異標(biāo)志基因，用于尿路上皮移行細(xì)胞癌的診斷，提高診斷的準(zhǔn)確性及早期無(wú)創(chuàng)性診斷及術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
[0008]【具體實(shí)施方式】:
本【具體實(shí)施方式】采取以下技術(shù)方案:所述的CK15角蛋白及基因在尿路上皮移行細(xì)胞癌的早期診斷，手術(shù)后期隨訪等試劑產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述用免疫檢測(cè)診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品包括:與CK15蛋白特異性結(jié)合的抗體及非抗體類結(jié)合體，它的應(yīng)用方法包括(A)、組織分離，手術(shù)切除待檢的尿路上皮組織，分離后，迅速提取病灶及周圍5cm以外正常組織，將待檢樣品組織塊剪成適當(dāng)大小印壓于玻片上，用4%多聚甲醛固定5?10分鐘，晾干;
(B)、將制備好的樣品置于2%BSA或10%BSA中，于37°C孵育濕盒內(nèi)封閉30min；
(C)、加入商業(yè)生產(chǎn)或自行制備的CK15蛋白的特異性抗體，用0.0lM pH7.4的PBS稀釋進(jìn)行1:100稀釋，于37 °C孵育30 min過(guò)夜孵育，然后用0.0lM濃度的PBST漂洗5 min X 3次；
(D)、加熒光標(biāo)記的CK15蛋白的二抗抗體，于37°C濕盒避光孵育301^11，再用0.0現(xiàn)的PBST避光漂洗5minX3次，用甘油緩沖液封片并鏡檢，陽(yáng)性結(jié)果為人類尿路上皮移行細(xì)胞癌。
[0009]所述的診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品包括:用CK15角蛋白免疫檢測(cè)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品，它的應(yīng)用方法為(a)、組織分離，手術(shù)切除待檢的尿路上皮組織，分離后，迅速提取病灶及周圍5cm以外正常組織，放入液氮保存，逆轉(zhuǎn)錄酶為 M-MLV Reverse Transcriptase, Takara C0.PCR 試劑 TaqDNA 聚合酶、dNTP, CK15角蛋白基因的弓丨物是 Forward: 5，-ggaagagatccgggacaaa-3，Reverse: 5，-tgtcaatctccaggacaacg-3’，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為456 bp,以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,其引物Forward: 5’-agccatgtacgtagccatcc-3’ Reverse:5’ -
tcacaatgcctgtggtacg-3’，β-actin 擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為 400bp ；
(b)、總mRNA的抽提步驟具體如下:將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入ImlTRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，將勻漿樣品在室溫放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離，每使用Iml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘；4°C 1000Xg離心15分鐘使樣品分為三層:將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)如離心管，用異丙醇沉淀水相中的RNA ;每使用Iml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘；用75 %乙醇洗滌RNA沉淀，每使用Iml TRIzol至少加Iml 75 %乙醇，2_8°C不超過(guò)7500Xg離心5分鐘，棄上清；室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，加入25-200 μ I無(wú)Rnase水，55-60°C放置10分鐘使RNA溶解；_70°C保存，為除去基因組DNA污染，全部RNA均用無(wú)RNA酶的DNA酶I消化；
(C)、使用B1metra公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，檢測(cè)CK15角蛋白基因在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織及其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)，反應(yīng)體系如下:總體積20 μ 1，SYBR PremixEX Taq 10 μ 1，引物各0.2 μ 1，DNA I μ 1，ddH20 2 μ 1，離心混勻，放入PCR儀中反應(yīng)，以β -actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用REST2009軟件分析，P〈0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CK15角蛋白在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織顯著上調(diào)；
本【具體實(shí)施方式】具有以下有益效果:它可以作為診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的特意標(biāo)志基因，使尿路上皮移行細(xì)胞癌更準(zhǔn)確、提高診斷的準(zhǔn)確性及早期無(wú)創(chuàng)性診斷及術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
[0010]實(shí)例1:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:使用B1metra公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，檢測(cè)CK15角蛋白基因在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織及其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)。反應(yīng)體系如下:總體積20 μ I, SYBR Premix EX Taq 10 μ 1，引物(20 μ Μ)各 0.2 μ 1，DNA I μ I, ddH20 8.2μ I,離心混勻，放入PCR儀中反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用REST2009軟件分析(Qiagen)，P<0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CK15角蛋白在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織顯著上調(diào)。
[0011]實(shí)施例2:
免疫檢測(cè):用商業(yè)生產(chǎn)或自行制備的CK15蛋白抗體進(jìn)行人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織組織染色，陽(yáng)性結(jié)果為人類尿路上皮移行細(xì)胞癌，取患者活檢標(biāo)本，用免疫組化ELISA方法檢測(cè)(尿)，陽(yáng)性反應(yīng)為人類尿路上皮移行細(xì)胞癌疑似患者，ELISA方法監(jiān)測(cè)(尿)，檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)Exfoliated尿路上皮，早期無(wú)創(chuàng)性診斷及術(shù)后復(fù)發(fā)的快速動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種CK15角蛋白及基因的應(yīng)用方法，其特征在于所述的CK15角蛋白及基因在尿路上皮移行細(xì)胞癌的早期診斷，手術(shù)后期隨訪等試劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種CK15角蛋白及基因的應(yīng)用方法，其特征在于所述用免疫檢測(cè)診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品包括:與CK15蛋白特異性結(jié)合的抗體及非抗體類結(jié)合體，它的應(yīng)用方法包括(A)、組織分離，手術(shù)切除待檢的尿路上皮組織，分離后，迅速提取病灶及周圍5cm以外正常組織，將待檢樣品組織塊剪成適當(dāng)大小印壓于玻片上，用4%多聚甲醒固定5?10分鐘，晾干； (B)、將制備好的樣品置于2%BSA或10%BSA中，于37°C孵育濕盒內(nèi)封閉30min； (C)、加入商業(yè)生產(chǎn)或自行制備的CK15蛋白的特異性抗體，用0.0lM pH7.4的PBS稀釋進(jìn)行1:100稀釋，于37 °C孵育30 min過(guò)夜孵育，然后用0.0lM濃度的PBST漂洗5 minX3次； (D)、加熒光標(biāo)記的CK15蛋白的二抗抗體，于37°C濕盒避光孵育301^11，再用0.0現(xiàn)的PBST避光漂洗5minX 3次，用甘油緩沖液封片并鏡檢，陽(yáng)性結(jié)果為人類尿路上皮移行細(xì)胞癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種CK15角蛋白及基因的應(yīng)用方法，其特征在于所述的診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品包括:用CK15角蛋白免疫檢測(cè)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR診斷尿路上皮移行細(xì)胞癌的產(chǎn)品，它的應(yīng)用方法為(a)、組織分離，手術(shù)切除待檢的尿路上皮組織，分離后，迅速提取病灶及周圍5cm以外正常組織，放入液氮保存，逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV ReverseTranscriptase, Takara C0.PCR 試劑 TaqDNA 聚合酶、dNTP，CK15 角蛋白基因的引物是 Forward: 5，-ggaagagatccgggacaaa-3，Reverse: 5，-tgtcaatctccaggacaacg-3，, PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為 456 bp,以 β -actin 作為內(nèi)參對(duì)照，其引物 Forward: 5’-agccatgtacgtagccatcc-3’Reverse:5f ~ tcacaatgcctgtggtacg-3’，β-actin 擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為 400bp ； (b)、總mRNA的抽提步驟具體如下:將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入ImlTRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，將勻漿樣品在室溫放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離，每使用Iml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘；4°C 1000Xg離心15分鐘使樣品分為三層:將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)如離心管，用異丙醇沉淀水相中的RNA ;每使用Iml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘；用75 %乙醇洗滌RNA沉淀，每使用Iml TRIzol至少加Iml 75 %乙醇，2_8°C不超過(guò)7500Xg離心5分鐘，棄上清；室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，加入25-200 μ I無(wú)Rnase水，55-60°C放置10分鐘使RNA溶解；-70°C保存，為除去基因組DNA污染，全部RNA均用無(wú)RNA酶的DNA酶I消化； (c)、使用B1metra公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，檢測(cè)CK15角蛋白基因在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織及其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)，反應(yīng)體系如下:總體積20 μ 1，SYBR PremixEX Taq 10 μ 1，引物各0.2 μ 1，DNA I μ 1，ddH20 2 μ 1，離心混勻，放入PCR儀中反應(yīng)，以β -actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用REST2009軟件分析，P〈0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CK15角蛋白在人類尿路上皮移行細(xì)胞癌組織顯著上調(diào)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104280547SQ201310348572
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】太光平, 趙三軍 申請(qǐng)人:云南師范大學(xué)