硫化葉菌病毒脫氧尿苷焦磷酸酶和此酶應(yīng)用研究的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了病毒脫氧尿苷焦磷酸酶和編碼這種酶的多核苷酸，以及該酶的應(yīng)用，該脫氧尿苷焦磷酸酶分離自硫化葉菌病毒Z。脫氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase）是一種重要的DNA修飾酶，能夠降低細(xì)胞中的dUTP／dTTP比例，防止DNA復(fù)制過程中dUTP濃度過高而引起錯誤摻入，提高DNA復(fù)制的穩(wěn)定性。
【專利說明】硫化葉菌病毒脫氧尿苷焦磷酸酶和此酶應(yīng)用研究
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，描述了一種來源于硫化葉菌病毒的脫氧尿苷焦磷酸酶，編碼此酶的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生這種酶的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脫氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)是一種重要的DNA修飾酶，廣泛存在于各種生物有機(jī)體中，可特意水解dUTP產(chǎn)生dUMP和ppi，dUMP經(jīng)甲基化變?yōu)樾叵汆奏っ撗鹾颂呛塑杖姿?dTTP)，而dTTP又是合成DNA的主要成分之一。因此，dUTPase在生物體中具有雙重基本功能:(I)降低細(xì)胞中的dUTP / dTTP比例，防止DNA復(fù)制過程中dUTP濃度過高而引起錯誤摻入，提供DNA復(fù)制的穩(wěn)定性；(2)為DNA的合成提供必需病毒編碼的原料dTTP。dUTPase具有種屬特異性，且與病毒的毒力和高效復(fù)制密切相關(guān)。
[0003]英國學(xué)者M(jìn)cGeoch在比較了不同來源的脫氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)的氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)，來源于任何物種的dUTPase，雖然分子量大小不一，但其氨基酸序列中都有含有dUTPase的5個典型的高度保守的基序，分別為motif I (AGFDL)、rnotif 2 (GKSS)、motif 3 (GIIDFGYTG)、motif 4(GQKFAQL)和 motif 5 (RGDKGFGS)。其中 motif 3 被認(rèn)為是dUTPase的酶活性催化中心。McGeehan根據(jù)dUTPase的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)可將其分為三個亞類:1型包括除大多數(shù)皰疹病毒外幾乎所有來源的dUTPase (包括細(xì)菌、真菌、植物和后生動物以及一系列的病毒:痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒以及無脊椎動物、魚類和兩棲動物的皰疹病毒)；11型則包括哺乳動物和禽類的皰疹病毒所編碼的dUTPase。I型和II型雖然都有5個相似的保守motif，特異性底物都為dUTP，但它們在基因長度、motif排列、空間結(jié)構(gòu)上有較大的差別。I型dUTPase通常為150個氨基酸殘基，天然晶體結(jié)構(gòu)由三個亞單位構(gòu)成的同源三聚體(homotrimer)組成,五個保守motif排列順序為1.2.3.4.5 ;而II型dUTPase氨基酸殘基數(shù)則是I型的兩倍,天然晶體結(jié)構(gòu)為單體(monomer),并且其motif排列順序為3.1.2.4.5。此外，研究表明，線蟲等少數(shù)生物上編碼的dUTPase在結(jié)構(gòu)上與前兩者有很大的不同，沒有5個明顯的保守motif，而且其水解底物除了 dUTP還包括dUDP，暫歸屬于III型。分析和了解dUTPase的分類及結(jié)構(gòu)特性有助于通過分類及結(jié)構(gòu)特點實現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白到功能蛋白的研究的深入。
[0004]所有生物都有相當(dāng)數(shù)量的基因編碼脫氧尿苷焦磷酸酶，主要是由于此酶是一種重要的DNA修飾酶，降低細(xì)胞中的dUTP / dTTP比例，防止DNA復(fù)制過程中dUTP濃度過高而引起錯誤摻入，提供DNA復(fù)制的穩(wěn)定性，因此脫氧尿苷焦磷酸酶也成為了科學(xué)界研究的一個熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供硫化葉菌病毒脫氧尿苷焦磷酸酶，即包含有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物；該脫氧尿苷焦磷酸酶分離自高溫硫化葉菌病毒Z (騰沖熱泉分離)，包括其保守性變異多肽、多肽的活性片段。本專利提供了完整的高溫硫化葉菌菌病毒Z脫氧尿苷焦磷酸酶的基因及其蛋白質(zhì)序列。
[0006]本發(fā)明中所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列至少70%的相同性。
[0007]本發(fā)明中所述脫氧尿苷焦磷酸酶具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明的目的有以下幾種:
(1)本發(fā)明提供編碼硫化葉菌病毒Z脫氧尿苷焦磷酸酶的多核苷酸，其包含選自下組中的一種:
(a).編碼具有SEQID N0.1所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷
酸；
(b).與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；或
(c).與(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。
[0008]本發(fā)明中所述多核苷酸具有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。同時本發(fā)明中所述多核苷酸序列包含有SEQ ID N0.2中90-432位的序列。
[0009](2)本發(fā)明提供含有編碼脫氧尿苷焦磷酸酶的多核苷酸的重組載體，其是由前文所述的多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體構(gòu)建而成的重組載體。
[0010](3)硫化葉菌病毒Z脫氧尿苷焦磷酸酶特殊的應(yīng)用價值，該酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中可以使非特異性條帶消失，同時還具有平時PCR沒有結(jié)果加入此脫氧尿苷焦磷酸酶可以得到預(yù)期結(jié)果。
[0011]將本發(fā)明的脫氧尿苷焦磷酸酶蛋白序列進(jìn)行保守區(qū)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)有多個保守結(jié)構(gòu)域。其中30~144aa屬于trimeric-dUTPase超家族成員。并且在96aa、97aa、98aa、110aa、115aa 和 120 aa 附近為活性位點；在 30aa、68aa、72aa、92aa、105aa、llOaa、113aa、120aa、130aa、137aa、142aa附近為三聚復(fù)合體結(jié)合位點。包含于脫氧尿苷焦磷酸酶中的trimeric-dUTPase超家族同源三聚體motifll、motif III和motif V共同構(gòu)成了酶的活性口袋，特別是C末端motifV的甘氨酸富集區(qū)，局布有許多與ATPase和GTPase相似的核甘酸結(jié)合蛋白易感序列，三聚體dUTPase的C瑞并不影響酶與底物的識別，但卻是酶發(fā)揮催化功能的必須組成部分。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1是脫氧尿苷焦磷酸酶基因Z-dUTPase的克隆片段PCR產(chǎn)物圖；
圖2是脫氧尿苷焦磷酸酶基因Z-dUTPase保守結(jié)構(gòu)域分析示意圖；
圖3是氧尿苷焦磷酸酶基因Z-dUTPase的相關(guān)酶切圖；
圖4是脫氧尿苷焦磷酸酶基因Z-dUTPase表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析檢測電泳圖；
圖5是脫氧尿苷焦磷酸酶基因Z-dUTPase純化示意圖；
圖6是焦磷酸(PPi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
圖7是脫氧尿苷焦磷酸酶基因Z-dUTPase對底物特異性反應(yīng)柱狀圖；
圖8是溫度對脫氧尿苷焦磷酸酶基因Z-dUTPase的影響圖；
圖9是pH值對脫氧尿苷焦磷酸酶基因Z-dUTPase的影響圖；
圖10是脫氧尿苷焦磷酸酶基因(Z-dUTPase)對Pfu DNA Polymerase及Taq DNApalymerase的影響圖；圖11是脫氧尿苷焦憐酸酶基因(Z-dUTPase)對Pfu DNA Polymerase及Taq DNApalymerase的影響圖；
圖12是脫氧尿苷焦磷酸酶基因(Z-dUTPase)對Ex Taq DNA Polymerase的影響圖；
圖13是脫氧尿苷焦磷酸酶基因(Z-dUTPase)氨基酸序列；
圖14是脫氧尿苷焦磷酸酶基因(Z-dUTPase)核苷酸序列。
【具體實施方式】
[0012]一、脫氧尿苷焦磷酸酶的克隆和表達(dá)
1、硫化葉菌病毒Z脫氧尿苷焦磷酸酶基因的擴(kuò)增
(1)(以病毒ZDNA為模板)硫化葉菌病毒Z脫氧尿苷焦磷酸酶基因的擴(kuò)增所用引物序列如下:
正向引物:5 ’ - CATGCCATGGACATGATTTTCAGTGATAGAG -3 ’
反向引物:5 ’ - CCCAAGCTTTGAGAGCTTGGCCGGCGTCAC -3 ’
(2)擴(kuò)增體系如下:
表1:擴(kuò)增反應(yīng)體系組分
【權(quán)利要求】
1.硫化葉菌病毒脫氧尿苷焦磷酸酶，其特征在于它包含有:SEQID N0.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧尿苷焦磷酸酶，其特征在于所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列至少70%的相同性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧尿苷焦磷酸酶，其特征在于具有SEQID N0.1所示的氨基酸序列。
4.一種編碼權(quán)利要求1所述脫氧尿苷焦磷酸酶的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種:(a).編碼具有SEQID N0.1所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸； (b).與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；或 (c).與(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸編碼具有SEQID N0.1所示氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸序列包含有SEQIDN0.2中30-144位的序列或SEQ ID N0.2中1-516位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于它是由權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體構(gòu)建而成的重組載體。
【文檔編號】C12N15/55GK103911357SQ201310350378
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】朱國東 申請人:云南民族大學(xué)