一種褐飛虱不同齡期體內(nèi)類酵母共生菌檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種褐飛虱不同齡期體內(nèi)類酵母共生菌檢測方法。選取不同齡期的褐飛虱，針對(duì)多種類酵母共生菌，結(jié)合變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測。齡期為1及2齡、3齡、4齡、5齡、剛羽化成蟲。酵母共生菌為Noda菌（Hypomyceschrysospermus）、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、假絲酵母(Candidaquercitrusa)。本發(fā)明利用DGGE和qPCR技術(shù)檢測了褐飛虱不同齡期多種類酵母共生菌的變化規(guī)律，為今后研究類酵母共生菌與褐飛虱生長發(fā)育之間的聯(lián)系提供了有效的工具。
【專利說明】一種褐飛虱不同齡期體內(nèi)類酵母共生菌檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明通過結(jié)合變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)對(duì)褐飛虱不同齡期時(shí)多種類酵母共生菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律進(jìn)行研究，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]褐飛風(fēng)屬于同翅目飛風(fēng)科，是危害東南亞國家和我國南方稻區(qū)最嚴(yán)重的水稻害蟲之一，對(duì)農(nóng)作物的危害除刺吸汁液和產(chǎn)卵危害外，還傳播水稻條紋葉枯病、黑條矮縮病、小麥叢矮病和玉米粗縮病等病毒病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，因此急需一種經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的方式來遏制褐飛虱的發(fā)生和危害。
[0003]同其他同翅目昆蟲一樣，褐飛虱體內(nèi)存在共生菌，類酵母共生菌(Yeast-likeSymbiotes, YLS)是飛虱體內(nèi)的優(yōu)勢菌群。YLS主要聚集在腹部脂肪體和卵中，并隨卵垂直傳遞給下一代。YLS還參與氮素循環(huán)，為寄主提供氨基酸、固醇類物質(zhì)以及蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，并對(duì)稻飛虱生長、發(fā)育、繁殖、致害性變化等起到重要作用。經(jīng)過高溫或抗生素減菌處理后，發(fā)現(xiàn)缺共生菌的飛虱若蟲的齡期明顯比正常若蟲長，且存活率也比正常若蟲低。隨著褐飛虱若蟲的生長發(fā)育，褐飛虱體內(nèi)共生菌的數(shù)量也隨之增加。這些結(jié)果表明類酵母共生菌與飛虱的生長發(fā)育息息相關(guān)，因此明確褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌具體的變化規(guī)律具有十分重要的意義。
[0004]然而，褐飛虱體內(nèi)的類酵母共生菌生存環(huán)境較為特殊，因此難以進(jìn)行離體培養(yǎng)。傳統(tǒng)研究主要基于顯微法觀察褐飛虱不同生長發(fā)育期類酵母共生菌的變化，但這種方法效率低且準(zhǔn)確性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的 不足，本發(fā)明提供了一種褐飛虱不同齡期體內(nèi)類酵母共生菌檢測方法。
[0006]褐飛虱是一種農(nóng)業(yè)害蟲，研究發(fā)現(xiàn)其生長發(fā)育和體內(nèi)的類酵母共生菌有密切的聯(lián)系，明確褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的變化規(guī)律具有十分重要的意義。尚未見有關(guān)利用分子生物學(xué)技術(shù)分析褐飛虱不同齡期類酵母共生菌的研究報(bào)道。
[0007]本發(fā)明首先收集不同齡期的褐飛虱作為研究對(duì)象，利用變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)技術(shù)和實(shí)時(shí)突光定量 PCR(Real-time Quantification PCR, qPCR)技術(shù)，特定地研究三種類酵母共生菌:Abt/a菌(Hypomyces chrysospermus),季也蒙畢赤酵母 ipichia guiIliermondii),假絲酵母{Candida querci trusa)在褐飛風(fēng)不同蟲齡之間的變化規(guī)律。
[0008]所述的類酵母共生菌為AbtZa菌(Jfypomyces chrysospermus)，季也蒙畢赤酵母{Pichia gui I Iiermondii),{Candida querci trusa) 0
[0009]所述的褐飛虱不同發(fā)育時(shí)期為1，2齡、3齡、4齡、5齡以及剛羽化雌成蟲。
[0010]所述的檢測不同齡期三種類酵母共生菌的方法過程如下:1)褐飛虱脂肪體中的類酵母共生菌進(jìn)行分離純化，并提取基因組，以上述提取的基因組為模板；
2)根據(jù)三種菌株的ISSrDNA的特征序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
3)利用變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)對(duì)多種菌株的變化規(guī)律定量分析。
[0011]利用DGGE和qPCR結(jié)合技術(shù)揭示了三種菌在褐飛虱不同齡期呈現(xiàn)相近的變化規(guī)律。在4齡若蟲期之前，不同共生菌的數(shù)量均隨著蟲齡的增加而增加，5齡若蟲期數(shù)量有顯著的下降趨勢，而到成蟲期數(shù)量又有顯著地回升。其中辦菌的數(shù)量在這三種共生菌中占有絕對(duì)優(yōu)勢。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明利用DGGE和qPCR技術(shù)檢測了褐飛虱不同齡期多種類酵母共生菌的變化規(guī)律，為今后研究類酵母共生菌與褐飛虱生長發(fā)育之間的聯(lián)系提供了有效的工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是三種菌在不同齡期的變性梯度凝膠電泳圖；A: Hypomyceschrysospermus，B: Pi chi a gui Ili ermondi i，C: Candi da querci trusa 0
[0014]圖2A良Hypomyces chrysospermus質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0015]圖2B是Pichia guiIliermondii質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0016]圖2C是Candida querci trusa質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0017]圖3A良Hypomyces chrysospermus菌特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0018]圖3B是Pichia guiIliermondii菌特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0019]圖^Candi da querci trusa菌特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0020]圖4A隻Hypomyces chrysospermus菌特異序列的懷解曲線圖。
[0021]圖4B IPichia gui I Iiermondii菌特異序列的熔解曲線圖。
[0022]圖4C是Candida querci trusa菌特異序列的懷解曲線圖。
[0023]具體實(shí)施方法
以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0024]實(shí)施例1:用變性梯度凝膠電泳對(duì)褐飛風(fēng)不同齡期三種菌(Mypomyceschrysospermus Λ Pi chi a gui Ili ermondi i Λ Candi da querci trusa )的半定量分析:
分別取褐飛虱I及2齡、3齡、4齡、5齡各500、400、300、200頭，取剛羽化雌成蟲100頭，對(duì)其脂肪體中的類酵母共生菌進(jìn)行分離純化，并提取基因組。以上述提取的基因組為模板，擴(kuò)增所用引物為依據(jù)3種菌獲得的DGGE序列設(shè)計(jì)的引物310F/310RQfypomyces chrysospermus ), 305F/305R (PicAia gui I liermondii ), 248F/248R (Candidaquerci trusa),為了提高DGGE的檢測效率，在三對(duì)上游引物的5’端添加約40個(gè)堿基的GC夾子(表1)。
[0025]表1三種菌的引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種褐飛虱不同齡期體內(nèi)類酵母共生菌檢測方法，其特征在于，選取不同齡期的褐飛虱，針對(duì)多種類酵母共生菌，結(jié)合變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的齡期為I及2齡、3齡、4齡、5齡、剛羽化成蟲。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母共生菌為AbtZa麗(Mypomyceschrysospermus ) > 季也蒙畢赤酵母{Pichia guiIliermondii)、假絲酵母{Candidaquercitrusa)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，過程如下: 1)將褐飛虱脂肪體中的類酵母共生菌進(jìn)行分離純化，并提取基因組，以上述提取的基因組為模板； 2)根據(jù)三種菌株的18SrDNA的特征序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)利用變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)對(duì)多種菌株的變化進(jìn)行定量分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK103468798SQ201310358330
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月17日
【發(fā)明者】馬正, 俞曉平, 曹偉, 侯云, 邊亞琳, 郝培應(yīng), 許益鵬, 申屠旭萍, 王正亮 申請(qǐng)人:中國計(jì)量學(xué)院