重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白及該蛋白抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白及其重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，屬于生物科學(xué)和運載蛋白【技術(shù)領(lǐng)域】重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法包括以下步驟：NGAL抗原表位的分析；重組NGAL的合成；重組NGAL的分離純化；制備兔抗重組NGAL蛋白抗體；收集、分離得到含有抗體的抗血清，純化抗體，即得到抗NGAL蛋白抗體。采用該制備方法解決了天然全長蛋白制備多抗產(chǎn)量低的問題，同時采用本發(fā)明的制備工藝制備的抗體其特異性良好，解決了現(xiàn)有的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體不能全部滿足用于免疫印跡、免疫組織化學(xué)實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗的問題。
【專利說明】重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白及該蛋白抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物科學(xué)和運載蛋白【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白及其重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中性粒細(xì)胞明13父酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)又稱人脂質(zhì)運載蛋白2或曬鐵蛋白，是1993年由Kjeldsen等人在中性粒細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)的。在生理狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮黏液細(xì)胞等分泌少量NGAL，而腦和周圍神經(jīng)、結(jié)腸、子宮和卵巢、胎盤、甲狀腺等組織細(xì)胞中NGAL的表達(dá)呈陰性。
[0003]NGAL的生理功能尚不完全清楚，可能參與不同的生理、病理過程，涉及胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞凋亡、炎癥免疫應(yīng)答、脂質(zhì)代謝等。在胚胎期，NGAL發(fā)揮類似生長因子的作用，參與各類組織發(fā)育、生長及分化，促進(jìn)乳腺癌、食管癌等腫瘤細(xì)胞增殖。NGAL與MMP-9以二硫鍵形成12500bp的復(fù)合物，延長MMP的蛋白水解活性，促進(jìn)MMP-9對細(xì)胞基底膜的降解，從而侵潤周圍基質(zhì)，介導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。過去研究認(rèn)為，NGAL促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但近年來研究發(fā)現(xiàn)NGAL還是一類應(yīng)激蛋白，在外界有害物質(zhì)刺激下，細(xì)胞分泌NGAL是一種機(jī)體自身防御機(jī)制，使組織細(xì)胞免于凋亡。NGAL還是一類新的急性期反應(yīng)蛋白，作為介導(dǎo)鐵離子像胞內(nèi)運輸?shù)男滦洼d體，通過競爭性奪取螯合物中的鐵來阻止細(xì)菌對鐵的吸收，從而抑制細(xì)菌生長。
[0004]近年研究發(fā)現(xiàn)，NGAL與急性腎損傷(acute kidney in jury, AKI)及各種原因引起的CKD密切相關(guān)，是預(yù)測AKI的一個新型標(biāo)記物，同時也是監(jiān)測CKD進(jìn)展和腎功能損害的生物學(xué)指標(biāo)，從而為CKD的臨床診斷與治療檢測找到了新的方法。
[0005]鑒于NGAL具有診斷意義，目前有很多公司研發(fā)和生產(chǎn)了 NGAL體外診斷試劑盒。2005年由丹麥的BioPorto公司首先推出了 NGAL的ELISA商品檢測試劑盒，可用于血清、血漿、尿液等樣本中的NGAL檢測。到現(xiàn)在已經(jīng)有多家公司在國家食品藥品監(jiān)督管理局以及美國FDA注冊了 NGAL檢測試劑盒，其檢測方法都是基于免疫分析方法。在這些檢測產(chǎn)品的開發(fā)過程中抗體是試劑盒制備必不可少的原料。但是現(xiàn)有的這些抗體的特異性和靈敏度較差，表達(dá)蛋白的序列多選用全長序列，全長序列其表達(dá)產(chǎn)量低，容易導(dǎo)致制備多抗量不足，從而限制該檢測指標(biāo)試劑盒的開發(fā)及大規(guī)模的推廣和應(yīng)用，影響試劑盒的品質(zhì)。因此研究開發(fā)高品質(zhì)的抗體對試劑盒的性能及該指標(biāo)檢測的推廣應(yīng)用有著至關(guān)重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供了一種重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白以及適用于作為NGAL試劑盒的抗體的制備方法。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0008]一種重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白，該蛋白的基因序列為序列表中SEQ ID N0.1 所述。
[0009]一種要求重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白NGAL抗原表位分析:通過抗原表位分析選擇目的片段用作蛋白重組表達(dá)，所述目的片段為序列表中SEQ ID N0.1所述蛋白質(zhì)序列；
[0011](2)重組NGAL的合成:將選定的目的片段通過PCR擴(kuò)增后插入到表達(dá)載體，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)座，最后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，病毒在復(fù)制的同時，目的蛋白也將得到表達(dá)；
[0012](3)重組NGAL的分離純化:采用Ni柱純化，包括蛋白提取和蛋白純化；
[0013](4)制備兔抗重組NGAL抗體:用步驟(3)純化后的重組NGAL作為抗原去免疫兔子,得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。
[0014]進(jìn)一步地，所述步驟(4)后，對抗重組NGAL抗體的抗血清進(jìn)行分離純化，得到抗重組NGAL抗體干粉。
[0015]進(jìn)一步地，所述NGAL蛋白質(zhì)序列的引物f目息為:
[0016]上游引物:5’TACGGGATCCGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATG3’(SEQ ID N0.2)
[0017]下游引物:5’GCTAGTCGACGCCGTCGATACACTGGTCG3’ (SEQ ID N0.3)。
[0018]優(yōu)選地，所述步驟(2)中表達(dá)載體選自為pFastBacTMl、pFastBacTM ΗΤΑ、pFastBacTM HTB、pFastBacTM HTC 和 pFastBacTM Dual。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟(2)中轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞系，所述昆蟲細(xì)胞系為昆蟲sf9細(xì)胞系。
[0020]進(jìn)一步地，所述步驟(3)中蛋白提取為:收集培養(yǎng)的細(xì)胞系，離心棄上清；沉淀細(xì)胞用NTA-O緩沖溶液溶解；向緩沖體系中加入溶菌酶，置冰上處理一段時間；將反應(yīng)體系倒入燒杯中于冰上超聲處理；后用離心機(jī)離心取上清再離心一次，后過0.22 μ m的濾膜；蛋白純化為:取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗滌Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O緩沖溶液洗滌Ni柱；后用NiS04洗滌Ni柱，流干；再用NTA-O緩沖溶液洗滌Ni柱至流出液與NTA-O緩沖溶液pH值相同；以lmL/min速度上樣；用NTA-O緩沖溶液洗滌至G250不變藍(lán)為止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至檢測G250不變藍(lán)為止，分別收集流出液體，跑膠分析溶液中重組NGAL純度。
[0021]進(jìn)一步地，所述步驟(4)兔抗重組NGAL抗體的制備為:取重組NGAL與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量為500 μ g/只，首次免疫注射后第2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫注射，以后每隔兩周加強(qiáng)免疫注射一次，每次加強(qiáng)免疫注射劑量與首次免疫注射劑量相同，加強(qiáng)免疫時取重組NGAL與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量為500 μ g/只，靜脈采血，得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。
[0022]優(yōu)選地，所述步驟(4)可以采用羊來制備羊抗重組NGAL抗體。
[0023]進(jìn)一步地，所述抗重組NGAL抗體的抗血清進(jìn)行分離純化為:1)制備NGAL親和層析柱:將NGAL蛋白與壓積CNBr-Sepharose4B混合,依次經(jīng)過交聯(lián)、清洗、封閉、再次清洗、裝柱、平衡，得到NGAL親和層析柱；2)親和層析:將NGAL抗體溶液通過I)所制備的親和層析柱，去除非特異性吸附后進(jìn)行解吸，分段收集解吸液；3)抗體獲取:將2)收集解吸液，透析，冷凍干燥，得到NGAL抗體干粉。[0024]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0025]本發(fā)明通過對NGAL的免疫原性分析，把兩端沒有免疫原性的位點去掉，同時采用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)對選定的序列進(jìn)行表達(dá)，重組NGAL的表達(dá)量會大幅度提聞，同時制備的多抗量充足，適合用做診斷試劑原料的開發(fā)。同時，采用昆蟲細(xì)胞系表達(dá)重組NGAL，相較于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)而言，昆蟲細(xì)胞系表達(dá)系統(tǒng)可以對重組蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，使其特性與天然蛋白更接近，保證了制備出來的抗體能特異性的識別和結(jié)合樣本中的天然NGAL蛋白。另外，昆蟲細(xì)胞的內(nèi)源性蛋白與人類蛋白同源性極低，即可以保證蛋白的翻譯后修飾又能避免抗體的特異性差。采用本發(fā)明的方法制備出來的抗體可以非常好的用作診斷試劑的原料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實施例得到的重組NGAL與對比實驗制備的NGAL表達(dá)量對比的SDS-PAGE 膠圖；
[0027]圖2為本發(fā)明實施例制備的重組NGAL抗體與對比實驗制備的NGAL抗體特異性實驗對比的Western Blot結(jié)果圖。 【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0029]實施例1
[0030]一、重組NGAL的表達(dá)
[0031]1.克隆序列表中SEQ ID N0.1的序列，其采用的引物為:
[0032]上游引物:5’TACGGGATCCGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATG3’(SEQ ID N0.2)
[0033]下游引物:5’GCTAGTCGACGCCGTCGATACACTGGTCG3’(SEQ ID N0.3)
[0034]用此引物對體外擴(kuò)增出序列SEQ ID N0.1中的重組NGAL片段序列。
[0035]2.將擴(kuò)增的SEQ ID N0.1中的重組NGAL片段插入到表達(dá)載體pFastBacTM Dual。首先用BamHI和SalI對pFastBacTM Dual質(zhì)粒進(jìn)行消化處理，使其暴露出可以與NGAL片段進(jìn)行堿基互補配對的黏性末端，然后在連接酶的作用下形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。后將環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中。
[0036]3.質(zhì)粒驗證。在得到Amp抗性轉(zhuǎn)化株后，挑取10個轉(zhuǎn)化株，在含有100 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，使用BamHI和SalI消化處理質(zhì)粒DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分析重組質(zhì)粒是否插入正確的位點，同時用PCR方法對陽性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分析，最后，將找到的陽性重組子進(jìn)行測序，驗證轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的正確性。
[0037]4.重組桿?？寺〉闹苽?。提取陽性重組子的質(zhì)粒DNA，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入DHlOBacTMEcoli，轉(zhuǎn)變?yōu)闂U粒。利用藍(lán)/白斑法篩選出含有重組桿粒的克隆。在LB培養(yǎng)集中培養(yǎng)含有重組桿粒的大腸桿菌，抽提重組桿粒，并凍干保存，備用。
[0038]5.昆蟲細(xì)胞sf9的轉(zhuǎn)染以及桿狀病毒粒子的收集。①sf9細(xì)胞計數(shù)，取12.5cm2新細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶加入9 X 105個細(xì)胞，并以全培培養(yǎng)12-24h，使細(xì)胞貼壁；②溶解2 μ g純化重組桿狀病毒重組質(zhì)粒于100 μ L無添加成分的Grace’s Medium中將轉(zhuǎn)染試劑充分搖勻后，取10 μ L加入100 μ L無添加成分的Grace’s Medium中，混勻；@將②和③所得溶液混勻，室溫孵育30min，同時以2mL含10%FBS的Grace’s Medium洗滌待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并棄去洗漆液；⑤取0.8mL無添加成分的Grace’ s Medium加入④所得質(zhì)粒于轉(zhuǎn)染劑的混合液中，輕輕混勻，總體積約lmL，加入④步洗滌完成的待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，27°C繼續(xù)培養(yǎng)5h移除質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑混合物，加入2mL含10%FBS的Grace’s Medium，27°C孵育，直至病變現(xiàn)象產(chǎn)生；⑦5天后，IOOOrpm離心IOmin收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒粒子，轉(zhuǎn)移上清到凍干管中，貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱中避光保存。由于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有突出的優(yōu)點:表達(dá)水平高、易于放大、生產(chǎn)的蛋白帶有適當(dāng)?shù)姆g后修飾，而且細(xì)胞生長條件簡單等優(yōu)勢。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組NGAL其特性與天然蛋白更接近，且蛋白表達(dá)產(chǎn)量高。
[0039]6.桿狀病毒病毒粒子的擴(kuò)增及重組NGAL蛋白的表達(dá)。①取適當(dāng)體積的桿狀病毒粒子原液加入到匯聚度90%的新鮮傳代的sf9細(xì)胞中，27°C恒溫培養(yǎng)箱中，靜置lh，每隔15min輕輕晃動一次；②去掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入新鮮的含Medium,27°C恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3天后，IOOOrpm離心IOmin收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒粒子，轉(zhuǎn)移上清液到凍干管中，貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱中避光存放；④得到的病毒粒子可重復(fù)上述①-③步驟，以獲得更高滴度的病毒粒子；⑤加入高滴度的桿狀病毒病毒粒子到匯聚度達(dá)95%的新鮮傳代的sf9細(xì)胞中，27°C恒溫培養(yǎng)箱中，靜置lh，每隔15min輕輕晃動一次；⑥去掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入新鮮的含10%FBS的Grace’ s Medium，27°C恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)?’⑦40-44h后，輕輕倒盡細(xì)胞上清培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上靜置30min ;⑧收集細(xì)胞裂解液，加入等體積的2 X SDS凝膠加樣緩沖液上樣緩沖液，混勻，100°C保持IOmin SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。
[0040]二、蛋白的分離純化
[0041]本實施例中重組NGAL的分離純化包括蛋白質(zhì)的提取和蛋白質(zhì)純化兩個部分，分別如下:
[0042]1.蛋白質(zhì)提取。①采用上述“重組NGAL蛋白的表達(dá)”方法在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)重組NGAL蛋白；②收集細(xì)胞 培養(yǎng)液，倒入500mL離心管中，于8000rpm離心30min，棄上清；③向細(xì)胞中加入PH8.0的NTA-O緩沖液，以每2L細(xì)胞培養(yǎng)液加入IOOmL緩沖液計向③步的反應(yīng)體系中加入一定量的溶菌酶混勻，溶菌酶的用量為1:200，后置于冰上30min;⑤將上述反應(yīng)體系倒入50mL燒杯內(nèi)，于冰上超聲波處理，超聲波處理方式為:工作時間3S，間隔時間4S，如此重復(fù)99次，超聲波的功率小于200W 將超聲波處理完成的樣本于16000rpm離心30min,保留上清；⑦將上清于16000rpm,4°C,離心20min 將離心完成的上清過0.22 μ m微孔濾膜。
[0043]2.蛋白質(zhì)純化。①取Ni柱流干，后用水洗3-5個柱體積，再用0.1M的EDTA溶液洗3個柱體積，之后再用水洗3-5個柱體積，然后再用pH8.0的NTA-O緩沖液洗3個柱體積，之后再用0.1M NiS04溶液洗5個柱體積并流干；②用pH4.2的0.2M醋酸鈉平衡液洗3個柱體積，之后再用PH8.0的NTA-O緩沖液洗柱子，直到流出液與洗脫液的pH —致時，停止洗脫；③用lmL/min的流速將提取的蛋白質(zhì)溶液上柱子上樣完成后用pH8.0的NTA-O緩沖液洗柱子至G250不變藍(lán)為止；⑤后分別用20mM、60mM、200mM和500mM的咪唑溶液洗脫柱子，直至檢測G250不變藍(lán)為止，洗脫過程中分別收集流出的液體，并將液體測定濃度后冷凍干燥既得重組NGAL蛋白干粉。[0044]三.抗體制備
[0045]用分離純化得到的蛋白質(zhì)免疫兔子，制備抗重組NGAL多克隆抗體，具體的操作流程如下:①準(zhǔn)備2月齡、體重1.5±0.5kg的雄性健康新西蘭大白兔，隨機(jī)分組，待免疫。免疫前一周，分別于耳靜脈采血留作陰性對照取一定量重組NGAL蛋白粉末用無菌PBS緩沖液配制成濃度為lmg/mL溶液，并與等量的弗氏完全佐劑充分乳化后注射免疫事先準(zhǔn)備好的大白兔，注射量為0.5mg/只首次免疫注射后第二周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫注射，以后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，免疫所有的試劑為lmg/mL重組NGAL蛋白PBS緩沖液于等體積不完全弗氏佐劑混合,加強(qiáng)免疫注射量為0.5mg/只，共免疫六次，至第三次免疫開始，每次免疫7-10天后耳靜脈采血,并用Western Blot實驗驗證抗體的特異性。
[0046]四.抗重組NGAL抗體分離純化
[0047]抗體分離純化主要包括以下幾個步驟:①NGAL親和層析柱的制備:將NGAL蛋白(購自R&D公司)與壓積CNBr_Sepharose4B (Pharmacia產(chǎn)品)按照5_7mg/mL比例混合，4攝氏度搖動18小時，使其交聯(lián)。然后用0.lmol/L pH8.0碳酸鹽緩沖液清洗3此，加等量0.lmol/L乙醇胺-HC14攝氏度搖動I小時，以封閉殘留的活化基團(tuán)。最后用0.0lmol/LTris-HCl(TB)清洗、裝柱、平衡，柱子的容積選用IOmL ;②親和層析:將制備得到的兔多抗血清以IOmL/小時流速通過步驟①制備的親和層析柱、依次用lmol/L NaCl-TB,
0.5%NP-40-TB、TB和雙蒸水清洗，以去除非特異性吸附。然后用3mol/L KSCNlOmL/小時進(jìn)行解吸。紫外檢測分段收集解吸液。③抗體獲取:將②收集解吸液，透析，冷凍干燥，既得NGAL抗體干粉。
[0048]對比實驗:
[0049]對比實驗中采用NGAL全長序列序列，其余步驟和上述步驟系一致。從圖1中可以看出采用本發(fā)明的方法，利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)截斷表達(dá)NGAL片段其制備的重組蛋白的量明顯高于對比實施例，重組的重組蛋`白量非常有利于后期抗體的制備。圖1中A為對比實施例，B為本實施例。
[0050]從圖2中可以看出，采用本發(fā)明的方法制備的抗體其特異性要明顯優(yōu)于對比實施例所制備的抗體，這就保證了采用本發(fā)明的方法所制備出來的抗體能適用于各種實驗過程。圖2中A為本實施例制備的抗體，B為對比實施例制備的抗體。
[0051]實施例2
[0052]該實施例與實施例1不同的是抗體制備步驟與實施例1不同。其抗體制備步驟為:
[0053]抗體制備
[0054]用分離純化得到的蛋白質(zhì)免疫山羊，制備抗重組NGAL多克隆抗體，具體的操作流程如下:①雄性健康青壯波爾山羊，體重15KG以上，隨機(jī)分組，待免疫。免疫前一周，分別于頸靜脈采血留作陰性對照取一定量重組NGAL蛋白粉末用無菌PBS緩沖液配制成濃度為lmg/mL溶液，并與等量的弗氏完全佐劑充分乳化后注射免疫事先準(zhǔn)備好的大白兔，注射量為0.6-0.Smg/只；③首次免疫注射三周后進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫注射，以后每隔三周加強(qiáng)免疫一次，免疫所有的試劑為lmg/mL重組NGAL蛋白PBS緩沖液于等體積不完全弗氏佐劑混合,加強(qiáng)免疫注射量為0.6mg/只，共免疫六次，至第四次免疫開始,每次免疫7-10天后頸靜脈采血，并用Western Blot實驗驗證抗體的特異性。[0055]對比實驗:
[0056]對比實驗中采用NGAL全長序列，其余步驟和上述步驟系一致。
[0057]從實驗結(jié)果可知，采用本發(fā)明的方法制備的重組蛋白的量要明顯多于對比實施實驗，且制備得到的抗體其特異性也優(yōu)于對比實驗，保證采用本發(fā)明所制備出來的抗體能充分滿足各種實驗的需求。
[0058]最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.一種重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白，其特征在于，該蛋白的基因序列為SEQ ID N0.1 所示。
2.一種要求I所述的重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白NGAL抗原表位分析:通過抗原表位分析選擇目的片段用作蛋白重組表達(dá)，所述目的片段為序列表中SEQ ID N0.1所述蛋白質(zhì)序列； (2)重組NGAL的合成:將選定的目的片段通過PCR擴(kuò)增后插入到表達(dá)載體，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)座，最后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，病毒在復(fù)制的同時，目的蛋白也將得到表達(dá)； (3)重組NGAL的分離純化:采用Ni柱純化，包括蛋白提取和蛋白純化； (4)制備兔抗重組NGAL抗體:用步驟(3)純化后的重組NGAL作為抗原去免疫兔子，得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)后，對抗重組NGAL抗體的抗血清進(jìn)行分離純化，得到抗重組NGAL抗體干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述NGAL蛋白質(zhì)序列的引物信息為SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的 重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于,所述步驟(2)中表達(dá)載體選自為pFastBacTM UpFastBacTM HTA、pFastBacTMHTB、pFastBacTM HTC 和 pFastBacTM Dual。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞系，所述昆蟲細(xì)胞系為昆蟲sf9細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或6所述的重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中蛋白提取為:收集培養(yǎng)的細(xì)胞系，離心棄上清；沉淀細(xì)胞用NTA-O緩沖溶液溶解；向緩沖體系中加入溶菌酶，置冰上處理一段時間；將反應(yīng)體系倒入燒杯中于冰上超聲處理；后用離心機(jī)離心取上清再離心一次，后過0.22 μ m的濾膜；蛋白純化為:取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗滌Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O緩沖溶液洗滌Ni柱；后用NiS04洗滌Ni柱，流干；再用NTA-O緩沖溶液洗滌Ni柱至流出液與NTA-O緩沖溶液pH值相同；以lmL/min速度上樣；用NTA-O緩沖溶液洗滌至G250不變藍(lán)為止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至檢測G250不變藍(lán)為止，分別收集流出液體，跑膠分析溶液中重組NGAL純度。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)兔抗重組NGAL抗體的制備為:取重組NGAL與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量為500 μ g/只，首次免疫注射后第2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫注射，以后每隔兩周加強(qiáng)免疫注射一次，每次加強(qiáng)免疫注射劑量與首次免疫注射劑量相同，加強(qiáng)免疫時取重組NGAL與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量為500 μ g/只，靜脈采血，得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)可以采用羊來制備羊抗重組NGAL抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述抗重組NGAL抗體的抗血清進(jìn)行分離純化為:I)制備NGAL親和層析柱:將NGAL蛋白與壓積CNBr-Sepharose4B混合,依次經(jīng)過交聯(lián)、清洗、封閉、再次清洗、裝柱、平衡，得到NGAL親和層析柱；2)親和層析fNGAL抗體溶液通過I)所制備的親和層析柱，去除非特異性吸附后進(jìn)行解吸，分段收集解吸液；3)抗體獲取:將2)收集解吸液，透析，冷凍干燥，得到 NGAL抗體干粉。
【文檔編號】C12N15/12GK103451187SQ201310362187
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】華權(quán)高, 劉瑾, 易汪雪, 閆彩霞, 馬峰, 沈鶴霄, 舒芹 申請人:武漢華美生物工程有限公司