改良的黃燈籠辣椒葉片基因組dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改良的黃燈籠辣椒葉片基因組DNA提取方法，針對(duì)黃燈籠辣椒葉片中富含酚類、糖類和蛋白的特點(diǎn)，利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黃燈籠辣椒基因組DNA提取中幾個(gè)重要成分的濃度，篩選出一種可獲得高質(zhì)量DNA分子的提取方法，解決常規(guī)方法提取的DNA分子雜質(zhì)較多、產(chǎn)率較低、易降解、易褐變、所用試劑毒性較大，影響下一步分子生物學(xué)研究的難題。采用本發(fā)明的方法得到的DNA純度較高。DNA完整性較好、無(wú)斷裂、無(wú)降解現(xiàn)象。
【專利說(shuō)明】改良的黃燈籠辣椒葉片基因組DNA提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種改良的黃燈籠辣椒葉片基因組DNA提取方法，具體涉及利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黃燈籠辣椒基因組DNA提取中幾個(gè)重要成分的濃度，旨在篩選出一種可獲得高質(zhì)量DNA分子的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海南黃燈籠椒(Capsicumchinense Jacquin)為爺科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)多年生草本植物,起源于南美亞馬遜流域,又稱黃辣椒、黃帝椒等，植物分類學(xué)上屬于中國(guó)辣椒(Capsicum chinense)，是海南特有的地方珍稀辣椒品種，在海南有著悠久的栽培和食用歷史，主要分布于海南島東南、西南沿海地區(qū)，喜高溫、強(qiáng)光，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，枝葉茂盛，成熟果實(shí)黃色或金黃色，形狀似燈籠，含有豐富的維生素C、胡蘿卜素、礦物質(zhì)、氨基酸及微量元素。另外，海南黃燈籠椒含有豐富的辣椒素類物質(zhì)，具有極強(qiáng)的辣味，其鮮果辣度17萬(wàn)SHU左右，同時(shí)還含有其它芳香類物質(zhì)，是加工辣椒醬和提取辣椒素的最佳原料之一，黃燈籠椒辣椒醬已成為海南知名的旅游產(chǎn)品，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎，辣椒素的藥理活性作用被世界各國(guó)廣泛重視，能抑制胃酸分泌，刺激堿性粘液分泌，有助于預(yù)防和治療胃潰瘍；能加速能量和脂類的新陳代謝，減少體內(nèi)脂肪積累；可阻止有關(guān)細(xì)胞的新陳代謝，降低癌癥細(xì)胞的發(fā)生率?？傊?，海南黃燈籠椒具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，在飲食和醫(yī)藥產(chǎn)品上應(yīng)用廣泛，是海南最具開發(fā)潛力的特色蔬菜作物。
[0003]基因組DNA提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。常用的DNA提取方法主要有十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法、十二烷基硫酸鈉(SDS)法和高鹽低pH法。SDS法操作簡(jiǎn)單，但所得產(chǎn)物含雜質(zhì)較多；CTAB可破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，并能與核酸形成復(fù)合物，進(jìn)而從富含多酚和多糖的植物組織中分離出高質(zhì)量基因組DNA ;高鹽pH法提取DNA產(chǎn)率較低，且會(huì)殘留較多的小分子物質(zhì)。由于不同材料所含的物質(zhì)成分及各種成分的含量差異較大，因此，對(duì)于不同植物基因組DNA提取應(yīng)采取不同的方法。
[0004]高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇的前提，是實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性和重復(fù)性好的保證。模板質(zhì)量將直接影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)。酚類物質(zhì)和多糖是影響植物基因組DNA提取的2個(gè)重要因素，常導(dǎo)致DNA分子降解，嚴(yán)重影響DNA純度和產(chǎn)量。黃燈籠辣椒葉片富含糖類、蛋白質(zhì)和酚類等物質(zhì)，酚類物質(zhì)容易發(fā)生氧化，與DNA結(jié)合形成黃色或黑褐色沉淀，難以溶解，DNA純度較低，難以滿足黃燈籠辣椒分子生物學(xué)研究需求。有效去除多糖、蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)等，是提取高質(zhì)量DNA分子的關(guān)鍵。目前有效去除植物多糖、酚類物質(zhì)的DNA提取方法主要有兩種:一種是CsCl密度梯度離心法；一種是CTAB法，前者儀器設(shè)備要求較高，費(fèi)時(shí)間，成本高；后者操作較為簡(jiǎn)單，適用于大多數(shù)植物DNA提取，應(yīng)用日趨廣泛。因此，需要采用改良的CTAB法優(yōu)化黃燈籠辣椒基因組DNA的提取，快速、經(jīng)濟(jì)、安全、高效地提取黃燈籠辣椒基因組DNA分子。
[0005]聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為清潔劑，具有吸附作用，能吸附多糖將其除去。二硫蘇糖醇(DTT)是一種還原劑，有抗氧化作用，能有效的防止酚類氧化成醌，避免了 DNA褐變的發(fā)生，但DTT的刺激性氣味要小，毒性也比巰基乙醇低很多。用改良的CTAB法優(yōu)化黃燈籠辣椒基因組DNA提取中幾個(gè)重要成分(CTAB、PVP和DTT)的濃度，有助于篩選出可獲得高質(zhì)量DNA分子的提取方法，為進(jìn)一步開展黃燈籠辣椒分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是針對(duì)黃燈籠辣椒葉片中富含酚類、糖類和蛋白的特點(diǎn)，利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黃燈籠辣椒基因組DNA提取中幾個(gè)重要成分的濃度，篩選出一種可獲得高質(zhì)量DNA分子的提取方法，解決常規(guī)方法提取的DNA分子雜質(zhì)較多、產(chǎn)率較低、易降解、易褐變、所用試劑毒性較大，如文獻(xiàn)(向詢，宋小麗，施倩倩.DNA-AFLP分析用辣椒基因組DNA提取方法的優(yōu)化.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，6 (2):48-51)，影響下一步分子生物學(xué)研究的難題。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]改良的黃燈籠辣椒葉片基因組DNA提取方法，包括以下步驟:
[0009](1)配制CTAB-3提取液，高溫滅菌后，65°C預(yù)熱；CTAB_3提取液為:0.1mol T1TrispH7.5,0.05mol L_1EDTApH8.0,0.7mol L^1NaCl, 2% CTAB，0.5% PVP，0.2% DDT ;其中，百分比為質(zhì)量百分比濃度；
[0010](2)利用液氮將幼嫩的黃燈籠辣椒葉片研磨成粉末裝入2.0mL離心管中，樣品達(dá)到1/4處為宜，每管加入預(yù)熱的CTAB-3提取液700 μ L置于65°C恒溫水浴箱中60min每隔IOmin輕輕搖動(dòng)一次；
[0011](3)加入苯酚、氯仿、異戊醇混合液700 μ L充分混勻15min，動(dòng)作緩慢，4°C 12000rpm離心6min ;苯酹/氯仿/異戍醇體積比為25: 24:1 ；
[0012](4)吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿、異戊醇混合液充分混勻15min,動(dòng)作緩慢，4°C 12000rpm離心6min ;氯仿、異戍醇體積比為24:1 ；
[0013](5)吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕混勻，置-20°C冰箱30min沉淀；
[0014](6)用滅菌牙簽挑出DNA絮狀沉淀，置1.5mL離心管中，采用70%乙醇漂洗兩遍，然后晾干；
[0015](7)加入100 μ L滅菌超純水，4°C冰箱溶解。
[0016]改良的CTAB法提取黃燈籠辣椒基因組DNA具有一下特點(diǎn):(I)DNA沉淀為絮狀物，利用滅菌后的牙簽挑取絮狀DNA代替離心沉淀，這樣得到的DNA純度較高。(2)提取的DNA完整性較好，無(wú)斷裂、無(wú)降解現(xiàn)象。(3)此方法能有效地去除蛋白質(zhì)，獲得的DNA純度更高。
(4)在提取液中加入DTT的同時(shí)加入0.5-1%的PVP，可有效去除多糖，抑制酚類物質(zhì)被氧化成為棕色，保證了提取的DNA分子色澤為白色。(5)利用DTT取代巰基乙醇，一方面可以有效抑制酚類物質(zhì)氧化，另外，DTT有抗氧化的作用，與巰基乙醇的作用相似，但DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多，可以大大降低對(duì)環(huán)境的污染。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1:黃燈籠辣椒葉片基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】[0018]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0019]實(shí)施例1
[0020]( I)采用L423正交設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)處理，配制DNA提取液，分別提取黃燈籠辣椒葉片基因組DNA分子(2)利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)提取的DNA分子，根據(jù)條帶情況檢測(cè)DNA有無(wú)降解及雜質(zhì)是否徹底去除。(3)利用核酸蛋白儀檢測(cè)提取的DNA在260nm和280nm處的吸光值，根據(jù)0D260/0D280值判斷提取的DNA純度。
[0021]本技術(shù)方案所需儀器設(shè)備:高速冷凍離心機(jī)，恒溫水槽，電泳儀，水平電泳槽，核酸蛋白分析儀，凝膠成像系統(tǒng)。
[0022]本技術(shù)方案所需試劑:EDTA、NaCl, Tris, CTAB, PVP、DDT、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、瓊脂糖、甲酰胺、溴酚藍(lán)、二甲苯腈。
[0023]采用本技術(shù)方案提取黃燈籠辣椒葉片基因組DNA的詳細(xì)步驟如下:
[0024](I)配制CTAB提取液，高溫滅菌后，65°C預(yù)熱；
[0025](2)利用液氮將幼嫩的黃燈籠辣椒葉片研磨成粉末裝入2.0mL離心管中，樣品達(dá)到1/4處為宜，每管加入預(yù)熱的CTAB提取液700 μ L置于65°C恒溫水浴箱中60min (每隔IOmin輕輕搖動(dòng)一次);
[0026](3)加入苯酚/氯仿/異戊醇700 μ L充分混勻15min，動(dòng)作緩慢，4°C 12000rpm離心 6min ；
[0027](4)吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇充分混勻15min，動(dòng)作緩慢，4°C 12000rpm 離心 6min ；
[0028](5)吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕混勻，置-20°C冰箱30min沉淀；
[0029](6)用滅菌的牙簽挑出DNA絮狀沉淀，置1.5mL離心管中，采用70%乙醇漂洗兩遍，然后晾干；
[0030](7)加入100 μ L滅菌超純水，4°C冰箱溶解；
[0031](8)吸取5μ LDNA溶液，加入2.5 μ L指示劑，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶情況判別DNA有無(wú)降解及雜質(zhì)是否徹底去除；
[0032](9)利用核酸蛋白儀檢測(cè)提取的DNA在260nm和280nm處的吸光值，根據(jù)0D260/0D280值判斷提取的DNA純度。
[0033]其中，(I) DNA提取液采用L423正交設(shè)計(jì)分別進(jìn)行配制，包括3因素(CTAB濃度，PVP濃度和 DDT 濃度)，2 水平(1% CTAB,2% CTAB ；0.5% PVP, 1% PVP ；0.1% DDT, 0.2% DDT)，共需配制4種不同的CTAB提取液(CTAB-l，CTAB-2，CTAB-3和CTAB-4)，不同提取液組成如下(表1)。
[0034]表1不同DNA提取緩沖液體系組成
【權(quán)利要求】
1.一種改良的黃燈籠辣椒葉片基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)配制CTAB-3提取液，高溫滅菌后，65°C預(yù)熱;CTAB_3提取液為:0.1mol T1TrispH7.5,0.05mol L-1EDTA pH8.0,0.7mol L-1NaCl, 2% CTAB，0.5% PVP，0.2% DDT ;其中，百分比為質(zhì)量百分比濃度； (2)利用液氮將幼嫩的黃燈籠辣椒葉片研磨成粉末裝入2.0mL離心管中，樣品達(dá)到1/4處為宜，每管加入預(yù)熱的CTAB-3提取液700 μ L置于65°C恒溫水浴箱中60min每隔IOmin輕輕搖動(dòng)一次； (3)加入苯酚、氯仿、異戊醇混合液700μ L充分混勻15min，動(dòng)作緩慢，4°C 12000rpm離心6min ;苯酹/氯仿/異戍醇體積比為25: 24:1 ; (4)吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿、異戊醇混合液充分混勻15min，動(dòng)作緩慢，4°C 12000rpm離心6min ;氯仿、異戍醇體積比為24: I ； (5)吸取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕混勻，置-20°C冰箱30min沉淀； (6)用滅菌牙簽挑出DNA絮狀沉淀，置1.5mL離心管中，采用70%乙醇漂洗兩遍，然后晾干；
(7)加入100μ L滅菌超純水，4°C冰箱溶解。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103898090SQ201310366833
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月21日
【發(fā)明者】劉子記, 朱婕, 曹振木, 楊衍, 牛玉, 詹園鳳 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所