Hbv b 基因型1799g>c 突變作為分子標(biāo)記的應(yīng)用及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了HBV?B基因型1799G>C突變作為分子標(biāo)記的應(yīng)用及試劑盒，基于HBV?B基因型的1799位點(diǎn)突變同肝硬化/肝癌具有極高的相關(guān)性；第1799位G/C多態(tài)性作為分子標(biāo)記可以應(yīng)用于制備提示HBV?B基因型感染者疾病進(jìn)程趨勢(shì)的試劑或試劑盒；并作為制備提示HBV?B基因型感染者演變成肝硬化/肝癌進(jìn)程可能性的試劑或藥物的靶點(diǎn)；從而能夠在感染早期預(yù)測(cè)感染B基因型乙肝病毒的病程進(jìn)展，從而在感染初期協(xié)助治療患者，避免肝病進(jìn)程加速轉(zhuǎn)為嚴(yán)重肝病甚至肝癌，也有利于預(yù)后目標(biāo)的監(jiān)測(cè)。
【專利說(shuō)明】HBV B基因型1799G>C突變作為分子標(biāo)記的應(yīng)用及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于こ型肝炎病毒的防治【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及HBV B基因型1799G>C突變作為分子標(biāo)記的應(yīng)用及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]大量的文獻(xiàn)報(bào)道，こ型肝炎病毒(HBV)是我國(guó)肝硬化/肝癌發(fā)生的最主要因素，約90%以上的肝硬化/肝癌患者發(fā)現(xiàn)こ型肝炎病毒感染。我國(guó)是こ肝發(fā)病率最高的國(guó)家，所以對(duì)于こ肝病毒感染的早期診斷對(duì)肝病發(fā)展進(jìn)程控制顯得尤為重要。こ肝病毒感染后導(dǎo)致肝硬化/肝癌的機(jī)理尚未明確，但HBV整合至人類肝臟細(xì)胞的基因組內(nèi)所引發(fā)慢性肝病甚至肝硬化/肝癌的現(xiàn)象已得到充分證實(shí)。我國(guó)HBV感染以B型和C型為主，南方地區(qū)B型多于C型，北方地區(qū)C型多于B型。盡管HBV基因組突變與藥物治療性耐藥的關(guān)系、突變與HBeAg表達(dá)的關(guān)系、基因型與疾病預(yù)后的關(guān)系已有報(bào)道，然而HBV基因組BCP區(qū)(basic corepromoter)1799位堿基G>C突變與HBV感染、基因型以及肝硬化/肝癌的關(guān)系尚未見報(bào)道。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，僅發(fā)現(xiàn)個(gè)別研究提示該突變與B型HBV感染后HBeAg的假性轉(zhuǎn)陰相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供HBV B基因型1799G>C突變作為分子標(biāo)記的應(yīng)用及試劑盒，可以在感染初期提早發(fā)現(xiàn)，協(xié)助治療患者，避免肝病進(jìn)程加速轉(zhuǎn)為嚴(yán)重肝病甚至肝癌，也有利于預(yù)后目標(biāo)的監(jiān)測(cè)。
[0004]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0005]第1799位G/C多態(tài)性作為分子標(biāo)記在制備提示HBV B基因型感染者疾病進(jìn)程趨勢(shì)的試劑或試劑盒中的應(yīng)用 。
[0006]基于所述的試劑或試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA測(cè)序結(jié)果，依據(jù)第1799位G/C多態(tài)性給出的野生型或突變型的提示--第1799位為G則為野生型，第1799位為C則為突變型。
[0007]HBV B基因型第1799位的G>C突變?cè)谥苽涮崾綡BV B基因型感染者演變成肝硬化/肝癌進(jìn)程可能性的試劑或藥物中作為靶點(diǎn)的應(yīng)用。
[0008]所述的試劑或藥物作出提示還依賴于DNA測(cè)序結(jié)果。
[0009]ー種提示HBV B基因型感染者疾病進(jìn)程趨勢(shì)的試劑盒，包括基于HBV的PreS2、S區(qū)的分型檢測(cè)引物對(duì)、1799位點(diǎn)突變檢測(cè)引物對(duì)、以及含有DNA擴(kuò)增酶和底物的PCR反應(yīng)液；
[0010]該試劑盒還包括一個(gè)基于擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序結(jié)果的提示卡，提示卡提示第1799位為G則為野生型，第1799位為C則為突變型；其中突變型的感染者具有巨大可能性導(dǎo)致感染こ肝病毒后演變成肝硬化/肝癌。
[0011]所述的分型檢測(cè)引物對(duì)包括:
[0012]PreS2、S 外巢上游引物:atgtgtctgc ggcgttttat ；
[0013]PreS2、S 外巢下游引物:actttccaat caatagg ；[0014]PreS2、S 內(nèi)巢上游引物:gttgtaaaac gacggccagg ttgcccgttt gtc ；
[0015]PreS2、S 內(nèi)巢下游引物:actttccaat caatagg ；
[0016]所述的1799位點(diǎn)突變檢測(cè)引物對(duì)包括:
[0017]BCP 外巢上游引物:tcgcttcacc tctgcac ；
[0018]BCP外巢下游引物:aaaaaagtca gaaggcaaaa a ；
[0019]BCP 內(nèi)巢上游引物:gttgtaaaac gacggccaga atgtcaacga ccgacctt ；
[0020]BCP 內(nèi)巢下游引物:aaaaaagtca gaaggcaaaa a。
[0021]所述試劑盒的擴(kuò)增程序?yàn)?
[0022]第一輪外巢擴(kuò)增:95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸50s，40個(gè)循環(huán)數(shù)；72°C延伸5min ；
[0023]第二輪內(nèi)巢擴(kuò)增:95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸50s，30個(gè)循環(huán)數(shù)；72°C延伸5min。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0025]本發(fā)明提供的HBV B基因型1799G>C突變作為分子標(biāo)記的應(yīng)用及試劑盒，是基于HBV B基因型的1799位點(diǎn)突變同肝硬化/肝癌具有極高的相關(guān)性；該相關(guān)性是通過(guò)長(zhǎng)期的基因篩查發(fā)現(xiàn)的，并基于這ー現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，通過(guò)引物設(shè)計(jì)并結(jié)合金標(biāo)準(zhǔn)ーDNA測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)而建立試劑盒，通過(guò)HBV的PreS2、S區(qū)測(cè)序分型，進(jìn)而檢測(cè)B基因型HBV的1799位點(diǎn)多態(tài)性(是否突變)。
[0026]結(jié)果表明，第1799位G/C多態(tài)性作為分子標(biāo)記可以應(yīng)用于制備提示HBVB基因型感染者疾病進(jìn)程趨勢(shì)的試劑或試劑盒；并作為制備提示HBV B基因型感染者演變成肝硬化/肝癌進(jìn)程可能性的試劑或藥物的靶點(diǎn)；從而能夠在感染早期預(yù)測(cè)感染B基因型こ肝病毒的病程進(jìn)展，從而在感染初期協(xié)助治療患者，避免肝病進(jìn)程加速轉(zhuǎn)為嚴(yán)重肝病甚至肝癌，也有利于預(yù)后目標(biāo)的監(jiān)測(cè)?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為中國(guó)人群感染的HBV的序列比對(duì)結(jié)果圖；
[0028]圖2-1為PreS2、S區(qū)擴(kuò)增電泳結(jié)果圖；圖2_2為BCP區(qū)擴(kuò)增電泳結(jié)果圖，其中泳道1為第一輪外巢擴(kuò)增，泳道2為第二輪內(nèi)巢擴(kuò)增。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0030]針對(duì)HBV病毒，通過(guò)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)搜索中國(guó)人群感染的HBV的B基因型，B2基因亞型，C基因型，C1基因亞型，C2基因亞型的全基因組序列。
[0031]將所有各基因型及各基因亞型進(jìn)行Clustal比對(duì)，尋找PreS2、S基因區(qū)及BCP區(qū)的型間保守區(qū)，比對(duì)結(jié)果如圖1所示，其中箭頭標(biāo)示為1799位點(diǎn)。
[0032]1、分析設(shè)計(jì)擴(kuò)增區(qū)域和引物
[0033]在上述分析的基礎(chǔ)上，使用Primerf設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物如表1所示，相應(yīng)的擴(kuò)增程序如表2所示；目標(biāo)在于穩(wěn)定擴(kuò)增各HBV基因型的PreS2、S區(qū)分型檢測(cè)序列以及BCP區(qū)突變(1799位點(diǎn)突變)檢測(cè)序列。
[0034]表1分型檢測(cè)引物及BCP區(qū)突變檢測(cè)引物
【權(quán)利要求】
1.第1799位G/C多態(tài)性作為分子標(biāo)記在制備提示HBVB基因型感染者疾病進(jìn)程趨勢(shì)的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，基于所述的試劑或試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA測(cè)序結(jié)果，依據(jù)第1799位G/C多態(tài)性給出的野生型或突變型的提示:第1799位為G則為野生型，第1799位為C則為突變型。
3.HBV B基因型第1799位的G>C突變?cè)谥苽涮崾綡BV B基因型感染者演變成肝硬化/肝癌進(jìn)程可能性的試劑或藥物中作為靶點(diǎn)的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑或藥物作出提示還依賴于DNA測(cè)序結(jié)果。
5.ー種提示HBV B基因型感染者疾病進(jìn)程趨勢(shì)的試劑盒，其特征在于，包括基于HBV的PreS2、S區(qū)的分型檢測(cè)引物對(duì)、檢測(cè)1799位點(diǎn)突變的BCP區(qū)擴(kuò)增引物對(duì)、以及含有DNA擴(kuò)增酶和底物的PCR反應(yīng)液； 該試劑盒還包括一個(gè)基于擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序結(jié)果的提示卡，提示卡提示第1799位為G則為野生型，第1799位為C則為突變型；其中突變型的感染者具有巨大可能性導(dǎo)致感染乙肝病毒后演變成肝硬化/肝癌。
6.如權(quán)利要求5所述的提示HBVB基因型感染者疾病進(jìn)程趨勢(shì)的試劑盒，其特征在于，所述的分型檢測(cè)引物對(duì)包括: PreS2、S 外巢上游引物:atgtgtctgc ggcgttttat ； PreS2> S 外巢下游引物:actttccaat caatagg ； PreS2、S 內(nèi)巢上游引物:gttgtaaaac gacggccagg ttgcccgttt gtc ； PreS2、S 內(nèi)巢下游引物:actttccaat caatagg ； 所述的BCP區(qū)擴(kuò)增引物對(duì)包括: BCP 外巢上游引物:tcgcttcacc tctgcac ； BCP 外巢下游引物:aaaaaagtca gaaggcaaaa a;
BCP 內(nèi)—t?字5丨ネ勿:gttgtaaaac gacggccaga atgtcaacga ccgacctt ； BCP 內(nèi)巢下游引物:aaaaaagtca gaaggcaaaa a。
7.如權(quán)利要求6所述的提示HBVB基因型感染者疾病進(jìn)程趨勢(shì)的試劑盒，其特征在于，所述PreS2、S區(qū)的分型檢測(cè)引物對(duì)、BCP區(qū)擴(kuò)增引物對(duì)擴(kuò)增使用同樣巢式程序，其擴(kuò)增程序包括: 第一輪外巢擴(kuò)增:95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸50s，40個(gè)循環(huán)數(shù)；72°C延伸5min ； 第二輪內(nèi)巢擴(kuò)增:95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸50s，30個(gè)循環(huán)數(shù)；72°C延伸5min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103451319SQ201310370575
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】顏真, 包晗, 王偉華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)