一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，包括以下步驟：（1）將經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體進(jìn)行不同濃度梯度稀釋，得到不同稀釋度的稀釋液；（2）制備釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基；（3）選取合適的稀釋度的稀釋液，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟（2）制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)；（4）分別計數(shù)選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，再換算出在相應(yīng)培養(yǎng)基條件下酵母細(xì)胞的濃度，則待測液體中釀酒酵母亞致死細(xì)胞的數(shù)量等于非選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量減去選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明操作簡單、易掌握，成本低。
【專利說明】—種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及液體食品中微生物的檢測方法，特別涉及一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),是與人類關(guān)系最廣泛的一種微生物，與同為真核生物的動物和植物細(xì)胞具有很多相同的結(jié)構(gòu)，且易培養(yǎng)，在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中常被用作研究真核生物的模式生物，其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌。
[0003]釀酒酵母作為基礎(chǔ)生物學(xué)研究和食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的菌種，是良好的研究模型，但同時它也是液體食品中的常見污染菌種，并會因為酒精發(fā)酵和CO2氣體的產(chǎn)出而引起飲料等食品的腐敗。此外，當(dāng)前熱門的非熱殺菌的技術(shù)手段，如脈沖電場(PEF)技術(shù)等，在用于液體食品殺菌時仍存在著殺菌不徹底的現(xiàn)象，也就是說液體食品物料經(jīng)殺菌技術(shù)處理后的微生物存在著亞致死損傷狀態(tài)。而微生物的亞致死損傷是一種可逆損傷，在適宜條件下會恢復(fù)其原來活性。因此，對經(jīng)非熱殺菌處理后的食品進(jìn)行亞致死損傷細(xì)胞的定量檢測就顯得十分必要，因為亞致死損傷的細(xì)胞在適當(dāng)條件下可自我修復(fù)，重新恢復(fù)其活性，從而對相應(yīng)食品的衛(wèi)生安全及貨架期產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，故需進(jìn)一步強(qiáng)化滅菌條件才能滿足殺菌效果、達(dá)到衛(wèi)生要求，從而延長非熱殺菌產(chǎn)品貨架期。從另一方面講，釀酒酵母細(xì)胞在亞致死應(yīng)激條件下會作出相應(yīng)的反應(yīng)應(yīng)答，從而產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，且有些代謝產(chǎn)物對人類發(fā)揮著重要作用，如酵母細(xì)胞在高鹽條件下會大量積累海藻糖等物質(zhì)。因此，如何最大限度地獲取亞致死損傷狀態(tài)細(xì)胞則成了當(dāng)前迫切需要解決的問題，而對亞致死損傷細(xì)胞進(jìn)行定量檢測則可以有效優(yōu)化亞致死損傷的處理條件。
[0004]許多研究表明，釀酒酵母細(xì)胞經(jīng)PEF技術(shù)等手段處理后往往會產(chǎn)生亞致死損傷細(xì)胞，而對于亞致死損傷的細(xì)胞，一般可以通過流式細(xì)胞儀結(jié)合熒光染色技術(shù)來實現(xiàn)在線檢測其存在與否，但該方法技術(shù)在設(shè)備方面投資成本較高，而且對操作技術(shù)的要求也相對較高，關(guān)鍵是不能對亞致死損 傷細(xì)胞進(jìn)行初步定量分析。另外，對亞致死損傷細(xì)胞進(jìn)行選擇性篩選原理上也能定量檢測出其相對數(shù)量，但對于選擇性篩選條件的確定卻存在一定的困難。
[0005]中國發(fā)明專利200410017149.7公布了一種實時定量PCR檢測血液樣品中癌細(xì)胞的方法。中國發(fā)明專利200610048468.3公布了一種大腸桿菌近紅外光譜快速檢測技術(shù)。中國發(fā)明專利200810135561.7公布了一種醬油等調(diào)味品中菌落總數(shù)快速檢測方法。200810150350.0公布了一種環(huán)境水體中腸道病毒的定量檢測方法。中國發(fā)明專利201010173244.1公布了一種調(diào)味品中大腸菌群的快速檢測方法。中國發(fā)明專利201010173224.4公布了一種食品中大腸菌群的快速檢測方法。中國發(fā)明專利201010180339.6公布了一種利用流式細(xì)胞儀檢測腹腔吞噬細(xì)胞活性的方法。中國發(fā)明專利201110356426.7公布了一種有效殺滅高壓脈沖電場處理食品中亞致死微生物延長貨架期的方法。但是上述專利涉及的方法存在如下問題:(I)上述專利基本上都是針對完整的細(xì)胞(即未受損傷的)進(jìn)行表征檢測，而沒有針對應(yīng)激處理條件下亞致死損傷細(xì)胞進(jìn)行定量檢測；(2)上述專利中所述方法有些雖然能用于亞致死損傷細(xì)胞的檢測，但在使用過程中往往成本較高，而且操作也較復(fù)雜，關(guān)鍵是不能對亞致死損傷細(xì)胞進(jìn)行初步定量分析，如流式細(xì)胞儀檢測需要結(jié)合染色技術(shù)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的檢測方法，能夠定量檢測分析亞致死損傷細(xì)胞數(shù)量，操作程序簡單、價廉、適于規(guī)?；瘧?yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0008]一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，包括以下步驟:
[0009](I)將經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體進(jìn)行不同濃度梯度稀釋，得到不同稀釋度的稀釋液；
[0010](2)制備釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基;
[0011]所述釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下:
[0012]在麥芽汁營養(yǎng)瓊脂中加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，得到溶劑；然后加入氯化鈉固體，充分溶解后分裝滅菌，冷卻至45?50°C得釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基；所述氯化鈉固體 與溶劑的質(zhì)量體積比為4.0%?4.5%g/L ；
[0013](3)選取合適的稀釋度的稀釋液，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)；
[0014](4)分別計數(shù)選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，再換算出在相應(yīng)培養(yǎng)基條件下酵母細(xì)胞的濃度，則待測液體中釀酒酵母亞致死細(xì)胞的數(shù)量等于非選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量減去選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量。
[0015]所述非選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下:
[0016]在麥芽汁營養(yǎng)瓊脂中加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，分裝滅菌，冷卻至45?50°C即得非選擇性培養(yǎng)基。
[0017]每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)，具體為:
[0018]吸取稀釋液加入到無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度的稀釋液分別加入兩個無菌培養(yǎng)皿中，分別在兩個無菌培養(yǎng)皿加入步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基，充分搖勻，待選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基全部凝固后，置于25V?30°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)(72±2)h。
[0019]無菌培養(yǎng)皿中的稀釋液與選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:15?20。
[0020]無菌培養(yǎng)皿中的稀釋液與非選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:15?20。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0022](I)本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)無法定量檢測釀酒酵母亞致死細(xì)胞的問題。
[0023](2)本發(fā)明的方法工藝簡單，可操作性強(qiáng)，能夠大規(guī)模應(yīng)用，通過利用NaCl濃度與培養(yǎng)基中的水分活度的線性關(guān)系，獲得亞致死損傷細(xì)胞生長的臨界水分活度(對應(yīng)的氯化鈉濃度為4.0%?4.5% (w/v),即氯化鈉固體與溶劑的質(zhì)量體積比為4.0%?4.5%g/L)，使得正常細(xì)胞能在該水分活度下生長，而亞致死損傷細(xì)胞不能生長繁殖；采用臨界水分活度下的非選擇性培養(yǎng)基使工藝簡單化，可操作性強(qiáng)。
[0024](3)本發(fā)明的方法設(shè)備投入少，成本低，所有操作過程中使用的都是些常見的儀器和器皿，且相關(guān)試劑也很普通易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為麥芽汁營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中NaCl含量與水分活度的擬合曲線。
[0026]圖2為不同水分活度下酵母細(xì)胞的生長情況。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0028]本發(fā)明首先通過實驗得到NaCl濃度與培養(yǎng)基中的水分活度的關(guān)系，具體實驗結(jié)果見圖1，由圖1可知，培養(yǎng)基中NaCl含量高低可明顯改變培養(yǎng)基中的水分活度，且呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，而水分活度對微生物的生長繁殖有著顯著的影響?；谏鲜鼋Y(jié)果，通過采用氯化鈉等無機(jī)鹽來不斷調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的水分活度，可以獲得亞致死損傷細(xì)胞生長的臨界水分活度對應(yīng)的氯化鈉濃度為4.0%?4.5% (w/v)(見圖2)，在臨界水分活度下，正常細(xì)胞能生長，而亞致死損傷細(xì)胞不能生長繁殖，本發(fā)明利用上述結(jié)果，可以簡化定量檢測釀酒酵母亞致死細(xì)胞的工藝步驟。
[0029]實施例1
[0030]本實施例采用的待.測液體的制備過程如下:
[0031]準(zhǔn)確稱取0.50g maurivinTM系列的葡萄酒活性干酵母，加入到200mL糖水溶液(白砂糖與蒸餾水的固液比為2%)中，36°C保溫40min，期間不斷攪拌均勻，讓活性干酵母充分復(fù)水活化。酵母活化液在4000rpm離心lOmin，離心室溫度為2V，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。在無菌操作臺上將收集的細(xì)胞沉淀重懸于200mL含0.024%氯化鈉的無菌鹽水中，即得細(xì)胞
重懸液。
[0032]利用華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院自行設(shè)計研制的高壓脈沖電場處理系統(tǒng)對重懸的酵母細(xì)胞液進(jìn)行處理。處理前，先用75%乙醇溶液對處理室和管路等進(jìn)行清洗消毒，再用無菌水清洗去除殘留的乙醇溶液。脈沖電場處理參數(shù)條件設(shè)置為:頻率1000Hz，脈寬40 μ s，場強(qiáng)10kV/cm，流速40mL/min，處理I次，處理完后將處理液靜置冷卻至室溫，得到釀酒酵母細(xì)胞電場處理液，即本實施例的經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體。
[0033]本實施例的脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，包括以下步驟:
[0034](I)在無菌操作臺上將經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到不同稀釋度的稀釋液；
[0035](2)制備釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基;
[0036]所述釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下:
[0037]準(zhǔn)確稱取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基145.1g,加蒸餾水1L，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，得到溶劑；然后加入氯化鈉固體，充分溶解后分裝滅菌，冷卻至45°C得釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基；所述氯化鈉固體與溶劑的質(zhì)量體積比為4.0%g/L ；
[0038]所述非選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下:
[0039]準(zhǔn)確稱取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基145.1g (廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn))，加蒸餾水1L，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，然后分裝滅菌，冷卻至45°C即得非選擇性培養(yǎng)基；
[0040](3)選取合適的3個稀釋度的稀釋液，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)；
[0041]其中，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)，具體為:
[0042]吸取稀釋液加入到無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度的稀釋液分別加入兩個無菌培養(yǎng)皿中，分別在兩個無菌培養(yǎng)皿加入步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基，充分搖勻，注意不要將培養(yǎng)基搖至皿蓋上，無菌培養(yǎng)皿中的稀釋液與選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:15，稀釋液與非選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:15。
[0043]待選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基全部凝固后，置于25°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 70h ；
[0044](4)培養(yǎng)結(jié)束后，分別計數(shù)選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，再換算出在相應(yīng)培養(yǎng)基條件下酵母細(xì)胞的濃度，則待測液體中釀酒酵母亞致死細(xì)胞的數(shù)量等于非選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量減去選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量；本實施例最后計算出的釀酒酵母亞致死細(xì)胞數(shù)量約為3.39X 104CFU/ mL,占細(xì)胞總數(shù)的0.60%。
[0045]實施例2
[0046]本實施例采用的待測液體的制備過程如下:
[0047]準(zhǔn)確稱取0.70g maurivinTM系列的葡萄酒活性干酵母，加入到300mL糖水溶液(白砂糖與蒸餾水的固液比為2%)中，38°C保溫30min，期間不斷攪拌均勻，讓活性干酵母充分復(fù)水活化。酵母活化液在4000rpm離心lOmin，離心室溫度為5°C，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。在無菌操作臺上將收集的細(xì)胞沉淀重懸于300mL含0.024%氯化鈉的無菌鹽水中，即得細(xì)胞
重懸液。
[0048]利用華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院自行設(shè)計研制的高壓脈沖電場處理系統(tǒng)對重懸的酵母細(xì)胞液進(jìn)行處理。處理前，先用75%乙醇溶液對處理室和管路等進(jìn)行清洗消毒，再用無菌水清洗去除殘留的乙醇溶液。脈沖電場處理參數(shù)條件設(shè)置為:頻率1000Hz，脈寬I μ s，場強(qiáng)20kV/cm，流速20mL/min，處理2次，處理完后將處理液靜置冷卻至室溫，得到釀酒酵母細(xì)胞電場處理液，即本實施例的經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體。
[0049]本實施例的脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，包括以下步驟:
[0050](I)在無菌操作臺上將經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到不同稀釋度的稀釋液；
[0051](2)制備釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基;
[0052]所述釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下:
[0053]準(zhǔn)確稱取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基145.1g,加蒸餾水1L，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，得到溶劑；然后加入氯化鈉固體，充分溶解后分裝滅菌，冷卻至50°C得釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基；所述氯化鈉固體與溶劑的質(zhì)量體積比為4.5%g/L ；
[0054]所述非選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下:
[0055]準(zhǔn)確稱取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基145.1g (廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn))，加蒸餾水1L，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，然后分裝滅菌，冷卻至50°C即得非選擇性培養(yǎng)基；
[0056](3)選取合適的3個稀釋度的稀釋液，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)；
[0057]其中，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)，具體為:
[0058]吸取稀釋液加入到無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度的稀釋液分別加入兩個無菌培養(yǎng)皿中，分別在兩個無菌培養(yǎng)皿加入步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基，充分搖勻，注意不要將培養(yǎng)基搖至皿蓋上，無菌培養(yǎng)皿中的稀釋液與選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:20，稀釋液與非選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:20。
[0059]待選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基全部凝固后，置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 74h ；
[0060](4)培養(yǎng)結(jié)束后，分別計數(shù)選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，再換算出在相應(yīng)培養(yǎng)基條件下酵母細(xì)胞的濃度，則待測液體中釀酒酵母亞致死細(xì)胞的數(shù)量等于非選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量減去選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量；本實施例最后計算出的釀酒酵母亞致死細(xì)胞數(shù)量約為3.23X 106CFU/mL,占細(xì)胞總數(shù)的57.71%。
[0061]實施例3 [0062]本實施例采用的待測液體的制備過程如下:
[0063]準(zhǔn)確稱取1.0g maurivinTM系列的葡萄酒活性干酵母,加入到400mL糖水溶液(白砂糖與蒸餾水的固液比為2%)中，40°C保溫20min，期間不斷攪拌均勻，讓活性干酵母充分復(fù)水活化。酵母活化液在4000rpm離心5min，離心室溫度為8°C，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。在無菌操作臺上將收集的細(xì)胞沉淀重懸于400mL含0.025%氯化鈉的無菌鹽水中，即得細(xì)胞重懸液。
[0064]利用華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院自行設(shè)計研制的高壓脈沖電場處理系統(tǒng)對重懸的酵母細(xì)胞液進(jìn)行處理。處理前，先用75%乙醇溶液對處理室和管路等進(jìn)行清洗消毒，再用無菌水清洗去除殘留的乙醇溶液。脈沖電場處理參數(shù)條件設(shè)置為:頻率1000Hz，脈寬20 μ s，場強(qiáng)40kV/cm，流速60mL/min，處理3次，處理完后將處理液靜置冷卻至室溫，得到釀酒酵母細(xì)胞電場處理液，即本實施例的經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體。
[0065]本實施例的脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，包括以下步驟:
[0066](I)在無菌操作臺上將經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到不同稀釋度的稀釋液；
[0067](2)制備釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基;
[0068]所述釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下:
[0069]準(zhǔn)確稱取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基145.1g,加蒸餾水1L，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，得到溶劑；然后加入氯化鈉固體，充分溶解后分裝滅菌，冷卻至48°C得釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基；所述氯化鈉固體與溶劑的質(zhì)量體積比為4.3%g/L ；
[0070]所述非選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下:
[0071]準(zhǔn)確稱取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基145.1g (廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn))，加蒸餾水1L，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，然后分裝滅菌，冷卻至43°C即得非選擇性培養(yǎng)基；
[0072](3)選取合適的3個稀釋度的稀釋液，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)；
[0073]其中，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)，具體為:
[0074]吸取稀釋液加入到無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度的稀釋液分別加入兩個無菌培養(yǎng)皿中，分別在兩個無菌培養(yǎng)皿加入步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基，充分搖勻，注意不要將培養(yǎng)基搖至皿蓋上，無菌培養(yǎng)皿中的稀釋液與選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:18，稀釋液與非選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:18。
[0075]待選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基全部凝固后，置于28°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 72h ；
[0076](4)培養(yǎng)結(jié)束后，分別計數(shù)選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，再換算出在相應(yīng)培養(yǎng)基條件下酵母細(xì)胞的 濃度，則待測液體中釀酒酵母亞致死細(xì)胞的數(shù)量等于非選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量減去選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量；本實施例最后計算出的釀酒酵母亞致死細(xì)胞數(shù)量約為5.01X106CFU/mL,占細(xì)胞總數(shù)的89.48%。
[0077]上述實施例為本發(fā) 明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受所述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將經(jīng)脈沖電場處理過的待測液體進(jìn)行不同濃度梯度稀釋，得到不同稀釋度的稀釋液； (2)制備釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基； 所述釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下: 在麥芽汁營養(yǎng)瓊脂中加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，得到溶劑；然后加入氯化鈉固體，充分溶解后分裝滅菌，冷卻至45?50°C得釀酒酵母亞致死細(xì)胞的臨界水分活度下的選擇性培養(yǎng)基；所述氯化鈉固體與溶劑的質(zhì)量體積比為4.0%?4.5%g/L ； (3)選取合適的稀釋度的稀釋液，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)； (4)分別計數(shù)選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，再換算出在相應(yīng)培養(yǎng)基條件下酵母細(xì)胞的濃度，則待測液體中釀酒酵母亞致死細(xì)胞的數(shù)量等于非選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量減去選擇性培養(yǎng)基換算出的細(xì)胞數(shù)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，其特征在于，所述非選擇性培養(yǎng)基的制備過程如下: 在麥芽汁營養(yǎng)瓊脂中加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹訜嶂练序v，分裝滅菌，冷卻至45?50°C即得非選擇性培養(yǎng)基。.
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，其特征在于，每個稀釋度的稀釋液分別用步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)培養(yǎng)，具體為: 吸取稀釋液加入到無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度的稀釋液分別加入兩個無菌培養(yǎng)皿中，分別在兩個無菌培養(yǎng)皿加入步驟(2)制備的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基，充分搖勻，待選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基全部凝固后，置于25V?30°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)(72±2)h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，其特征在于，無菌培養(yǎng)皿中的稀釋液與選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:15?20。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脈沖電場作用下釀酒酵母亞致死細(xì)胞的定量檢測方法，其特征在于，無菌培養(yǎng)皿中的稀釋液與非選擇性培養(yǎng)基的體積比為1:15?20。
【文檔編號】C12Q1/06GK103436590SQ201310373444
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】曾新安, 王滿生, 孫大文, 韓忠, 劉志偉 申請人:華南理工大學(xué)