一種利用scar技術(shù)鑒別金龍膽草及其混淆品的scar引物及其方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用SCAR技術(shù)鑒別金龍膽草及其混淆品的SCAR引物及其方法，提取混淆品植物的基因組DNA，將樣品的基因組DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，其SCAR-PCR擴(kuò)增體系為：25μL體系中含有Mg2+2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，引物SC1、引物SC2各1.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：94℃變性1min、36℃復(fù)性1min、72℃延伸2min，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，4℃保存；擴(kuò)增結(jié)果有目的條帶的即為金龍膽草真品。方法更為客觀易行，時(shí)間短、準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好。
【專利說(shuō)明】—種利用SCAR技術(shù)鑒別金龍膽草及其混淆品的SCAR引物及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種利用SCAR技術(shù)鑒別金龍膽草及其混淆品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金龍膽草為菊科白酒草屬植物苦蒿ConyzabliniiL6vl.的干燥地上部分,分布于云南中、南部，四川攀西地區(qū)及貴州部分地區(qū)。系70年代四川省發(fā)掘的民間草藥，具有清熱化痰，止咳平喘，解毒利濕，涼血止血的功效，近年來(lái)的研究更報(bào)道其具有一定的抗腫瘤活性，應(yīng)用前景廣闊。
[0003]金龍膽草的民間俗稱為“苦蒿”，但名為“苦蒿”的植物卻不止一種，且部分植物在形態(tài)與化學(xué)成分上與金龍膽草相近，使得收購(gòu)藥材時(shí)很難識(shí)別混淆品，影響金龍膽草的品質(zhì)。中草藥傳統(tǒng)的鑒定方法主要是性狀或組織顯微鑒別，以及有效成分含量的指紋圖譜區(qū)分道地產(chǎn)品，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)或局限性，且需時(shí)較長(zhǎng)。隨著分子遺傳標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，利用分子手段進(jìn)行藥用植物的遺傳分析，可以使鑒別過(guò)程不受樣品形態(tài)、外部條件變化、發(fā)育時(shí)期、次生代謝物含量等因素的影響，更客觀、可靠得提供準(zhǔn)確鑒別。
[0004]RAPD技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種DNA分子標(biāo)記之一，可通過(guò)多個(gè)不同的隨機(jī)引物給出覆蓋整個(gè)基因組的多態(tài)性信息。因其具有快速、簡(jiǎn)便、高效、周期短等特點(diǎn)，近年來(lái)，在遺傳育種及遺傳多樣性等方面都得到了廣泛的運(yùn)用，尤其在尋找不同樣品間DNA的差異上被廣泛應(yīng)用。SCAR分子標(biāo)記，即序列特異擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是以RAH)技術(shù)為基礎(chǔ)的一種新型分子標(biāo)記，在對(duì)RAH)特異擴(kuò)增條帶測(cè)序的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，并利用此引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)樣品是否為混淆品。此方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，重復(fù)性好，且?guī)秃?jiǎn)單，可直觀利用“有或無(wú)”條帶觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，SCAR標(biāo)記已逐漸成為分子遺傳育種、植物品系鑒定的首選技術(shù)。
[0005]傳統(tǒng)鑒定技術(shù)主要以性狀或顯微、化學(xué)鑒別為主，存在一定的局限性，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分化學(xué)成分相近，外觀形態(tài)相似的金龍膽草及其混淆品。金龍膽草在外形上與白酒草屬植物白酒草，蒿屬植物艾草相似，同時(shí)由于民間俗名均為“苦蒿”，也易與青蒿混淆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種利用SCAR技術(shù)鑒別金龍膽草及其混淆品的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一種利用SCAR技術(shù)鑒別金龍膽草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物包括引物SCl和引物SC2，引物SCl和引物SC2序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
[0009]所述SCAR引物鑒別金龍膽草及其混淆品的方法，包括以下步驟:提取混淆品植物的基因組DNA，將樣品的基因組DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，其SCAR-PCR擴(kuò)增體系為:25 μ L體系中含有 Mg2+2.5mmol/L, dNTPs4.5mmol/L,引物 SC1、引物 SC2 各 1.5 μ mol/L, DNA 模板60ng，Taq酶1.5U ;擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán):94°C變性lmin、36°C復(fù)性lmin、72°C延伸2min,循環(huán)結(jié)束后72°C延伸IOmin, 4°C保存；擴(kuò)增結(jié)果有目的條帶的即
為金龍膽草真品。
[0010]本發(fā)明針對(duì)金龍膽草DNA序列的特異性，建立了金龍膽草基因組DNA的RAPD指紋圖譜，成功獲得一個(gè)特異SCAR標(biāo)記，應(yīng)用這個(gè)標(biāo)記，可以根據(jù)凝結(jié)電泳判定樣品是否為混淆品，方法更為客觀易行，時(shí)間短、準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1:18個(gè)金龍膽草樣品的基因組DNA凝膠電泳圖；
[0012]圖2:H37的RAPD特異擴(kuò)增圖譜；
[0013]圖3 =SCAR轉(zhuǎn)化后的金龍膽草特異擴(kuò)增圖譜；
[0014]圖4:左起為marker，1-3分別為白酒草、青蒿和艾草的RAPD擴(kuò)增譜圖
[0015]圖5:左起為marker，1-4分別為白酒草、青蒿、艾草和金龍膽草的SCAR擴(kuò)增譜圖
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0017]本發(fā)明涉及到的SCAR技術(shù)鑒別金龍膽草及其混淆品的方法，具體包括以下步驟:
[0018]1、采用改良的SDS 法提取18個(gè)不同地區(qū)采集的金龍膽草基因組DNA (圖1)，方法為取約0.15g新鮮葉片(干樣取三分之一重)置于研缽中以液氮快速研磨為粉末，將粉末快速轉(zhuǎn)移至 1.5mLEppendorf 管中，加入 800 μ L 提取緩沖液(1.4%SDS, IOOmmoI/LTris-HcI,50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，臨用前加入 0.1%14.4mol/LP -巰基乙醇及 2%PVP)，65°C水浴40min至溶液變?yōu)橥咙S色,加入150 μ IKAc,充分混勻,冰浴30min以沉淀蛋白質(zhì)；室溫下12000r/min離心15min，上清液加入200 μ I氯仿/異戊醇(24:1)混勻，12000r/min離心lOmin，反復(fù)操作2-3次；上清液加入0.6倍體積異丙醇(_20°C預(yù)冷)，-20°C冷卻30min ;離心5min收集沉淀。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA分子量，以λ DNA/HindIII為Maker，核酸蛋白儀(Bio-Rad公司)測(cè)定DNA濃度和蛋白質(zhì)殘留。
[0019]表1供試實(shí)驗(yàn)材料
[0020]
【權(quán)利要求】
1.一種利用SCAR技術(shù)鑒別金龍膽草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物包括引物SCl和引物SC2，引物SCl和引物SC2序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述SCAR引物鑒別金龍膽草及其混淆品的方法，其特征在于，包括以下步驟:提取混淆品植物的基因組DNA，將樣品的基因組DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，其SCAR-PCR 擴(kuò)增體系為:25 μ L 體系中含有 Mg2+2.5mmol/L, dNTPs4.5mmol/L,引物 SC1、引物SC2各1.5 μ mol/L, DNA模板60ng, Taq酶1.5U ;擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min,然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán):94°C變性lmin、36°C復(fù)性lmin、72°C延伸2min，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸10min，4°C保存；擴(kuò)增結(jié)果有目的 條帶的即為金龍膽草真品。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103589783SQ201310373522
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】陳惠 , 劉姍, 孫榮, 唐自鐘, 高靜雷, 李成磊, 韓學(xué)易, 吳琦, 黃曉燕 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)