菌株jy9及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種菌株其及應(yīng)用。針對環(huán)境污染物生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】苯胺廢水或受苯胺污染的環(huán)境在強(qiáng)酸堿性、高濃度以及高鹽時(shí)降解率差的問題，提供了一種更高效的苯胺降解菌株及其應(yīng)用。菌株P(guān)seudomonas?Otitidis?JY9，保藏編號CGMCC?No.7787，可應(yīng)用于苯胺類化合物降解，尤其在苯胺降解時(shí)適用的降解培養(yǎng)條件是：溫度10℃～45℃，pH2～pH11；苯胺濃度≤5000mg/L。特別是在苯胺濃度2000mg/L，30℃、pH5.0～7.0條件下菌株CGMCC?No.7787對苯胺降解率超過98.50%。本菌株具有耐鹽性，NaCl含量≤5mg/L，尤其是≤4mg/L時(shí)能保持對苯胺的高效降解能力。此外該菌株在降解苯胺時(shí)加入共代謝底物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素中的一種或幾種可提高降解率。菌株CGMCC?No.7787還可應(yīng)用于苯胺類化合物的降解。
【專利說明】菌株JY9及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了ー種菌株JY9其及應(yīng)用，特別是一種苯胺及苯胺類化合物降解菌株及其應(yīng)用，屬于微生物、環(huán)境微生物、環(huán)境污染物生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]苯胺是化工行業(yè)中最重要的中間體之一，廣泛應(yīng)用于橡膠、除草剤、印染、煉油、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機(jī)樹脂、油漆、香水、制革、塑料等行業(yè)。作為ー種“三致物質(zhì)”，苯胺通過任何途徑暴露于環(huán)境中都會成為嚴(yán)重的環(huán)境問題，危害環(huán)境安全與人類健康，而作為一種難降解芳香化合物，其對自然環(huán)境的破壞是持久性的。1989年苯胺已被中國列為“環(huán)境優(yōu)先控制污染物”物質(zhì)之一。
[0003]現(xiàn)階段處理苯胺廢水的方法包括物理法、化學(xué)法、生物法。其中生物法主要利用微生物代謝，氧化分解廢水中的可溶性有機(jī)物及部分不溶的有機(jī)物，并轉(zhuǎn)化成無害的穩(wěn)定物質(zhì)，從而使水質(zhì)得到?jīng)坊?。生物處理技術(shù)具有較高的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢、無二次污染的特點(diǎn)，隨著高效降解菌的分離篩選和生物處理工藝的改進(jìn)完善，生物法處理苯胺廢水顯示出相當(dāng)?shù)母偁巸?yōu)勢和應(yīng)用潛力，而其中的主體即高效降解菌的篩選成為修復(fù)苯胺污染的生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵。
[0004]目前，現(xiàn)有技術(shù)中已篩選到多株高效降解菌，人民利用人工富集培養(yǎng)等技術(shù)，已經(jīng)分離得到很多能降解或者轉(zhuǎn)化苯胺的多種微生物菌種，大多數(shù)分離自一般廢水生物處理系統(tǒng)。但是，一般苯胺廢水以及受苯胺污染的環(huán)境具有高鹽、高濃度以及強(qiáng)酸堿性等特點(diǎn)，而一般廢水環(huán)境中分離的微生物的最適生長條件為低鹽與中性PH，其在苯胺廢水的高鹽以及、酸性、堿性條件下生長受抑制，對苯胺的降解效率也受到極大抑制。因此目前見諸報(bào)道的苯胺降解菌在高鹽及、酸性、堿性環(huán)境下的降解效率均不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有降解苯胺存在的問題，提供一種假單胞菌菌株，以及該菌株在苯胺降解中的應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種菌株JY9:菌株P(guān)seudomonas Otitidis,保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心(簡稱CGMCCJi1:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編10010)，保藏日期2013年6月20日，保藏編號CGMCC N0.7787。
[0007]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787是革蘭氏陰性好氧桿菌，在鑒定培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)純培養(yǎng)條件下，菌落呈淡黃色，較濕潤，邊緣整齊，圓形，小而凸起，正反顔色一致，氧化酶試驗(yàn)陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，明膠水解試驗(yàn)陽性，淀粉水解試驗(yàn)陰性，可代謝精氨酸和組氨酸脫氨，可以以苯こ胺為卩隹ー碳氮源。不能利用甘油或鹿糖。PseudomonasOtitidis CGMCC N0.7787 的 16SrDNA 的 Genebank 登錄號為 KF159806。
[0008]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787 能夠應(yīng)用于苯胺降解。[0009]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787應(yīng)用于苯胺降解適用的溫度條件是10°C~45°C。優(yōu)選的溫度條件是15°C~45°C，20°C~40°C。
[0010]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787應(yīng)用于苯胺降解適用的酸堿條件是pH2~pHll。優(yōu)選為pH4~9，pH5~7。
[0011]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787應(yīng)用于苯胺降解適用的苯胺濃度條件是苯胺濃度≤5000mg/L。優(yōu)選的苯胺濃度是1000mg/L~3500mg/L，1000mg/L~3000mg/L及1000mg/L ~2000mg/L。
[0012]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787應(yīng)用于苯胺降解適用的苯胺濃度條件是NaCl含量< 5mg/L。優(yōu)選的苯胺濃度是NaCl含量ν 4mg/L，NaCl含量≤ 3mg/L。
[0013]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787應(yīng)用于苯胺降解適用的降解培養(yǎng)優(yōu)選的條件:苯胺濃度1000mg/L~3000mg/L，溫度20°C~40°C，pH4~9 ;或者是苯胺濃度2000mg/L ~3000mg/L，溫度 25°C~30°C，pH5 ~I ;或者是苯胺濃度 2000mg/L，溫度 30°C，pH7, NaCl 含量≤ 4mg/L。
[0014]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787應(yīng)用于苯胺降解適用的降解培養(yǎng)條件是:碳氮源是苯胺，或者碳氮源是苯胺與其他共代謝底物，所述其他共代謝底物是葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素中的ー種或幾種。
[0015]根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，本發(fā)明所提供Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787能夠應(yīng)用于苯胺廢水生物處理與環(huán)境修復(fù)工程中的苯胺降解。優(yōu)化的條件是在20°C~40°C、pH4~PH9、苯胺濃度不高于3500mg/L、鹽分不高于4%時(shí)，苯胺降解效率更優(yōu)。另ー個(gè)更優(yōu)化的條件是Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787生長環(huán)境中加入0.l%(w/v)的共代謝底物葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素中的任ー種或幾種，能夠提高苯胺廢水生物處理效率。
[0016]菌株P(guān)seudomonas Otitidis CGMCC N0.7787能夠應(yīng)用于苯胺降解的原因在于能夠促使苯環(huán)的裂解。而苯胺類化合物降解的關(guān)鍵在于苯環(huán)的裂解，微生物對苯胺類化合物的降解原理在于微生物產(chǎn)生合適的酶將苯環(huán)裂解，苯環(huán)裂解后再被轉(zhuǎn)化為其他中間產(chǎn)物，最后將裂解后的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可被微生物細(xì)胞利用的物質(zhì)，最終代謝為簡單的化合物，完成苯胺類化合物的降解。此菌株能夠降解苯胺，表明該菌能夠產(chǎn)生裂解苯環(huán)的酶，能夠降解苯胺類化合物。因此菌株P(guān)seudomonas Otitidis CGMCC N0.7787能夠應(yīng)用于苯胺類化合物的降解。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:(1)提供了一種新菌株P(guān)seudomonasOtitidis CGMCC N0.7787 ; (2)菌株 Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787 能夠降解苯胺及苯胺類化合物；(3)在苯胺濃度2000mg/L30°C、pH5.0~7.0條件下菌株P(guān)seudomonasOtitidis CGMCC N0.7787 對苯胺降解率達(dá)到超過 98.50% ; (4)菌株P(guān)seudomonas OtitidisCGMCC N0.7787能夠耐受一定濃度的鹽分，在鹽分不高于4%時(shí)能夠降解3500mg/L以下的苯胺溶液。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1 是 Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787 培養(yǎng)圖。
[0019]圖2 是 Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787 對苯胺的降解曲線。
[0020]圖3是Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787對苯胺降解前后的液相色譜圖。其中，圖2各圖代表的意思為:A、苯胺濃度，樣品稀釋100倍；B、降解48h，樣品稀釋10倍；C、降解72h，樣品未稀釋。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例、試驗(yàn)例對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)ー步說明。
[0022]實(shí)施例一
[0023]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787 的分離馴化。
[0024]1、樣品
[0025]土壤樣品:取自大慶油田油井附近受油類污染的土壌，過篩備用。
[0026]2、培養(yǎng)基
[0027]分離培養(yǎng)基:常用分離培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、肉膏湯培養(yǎng)基、肉浸湯培養(yǎng)基。
[0028]馴化培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加苯胺500mg/L、750mg/L、1000mg/L。
[0029]無機(jī)鹽培養(yǎng)基:Na2HPO42.52g、KH2PO4 0.5g、MgSO4 ? 7H20 0.4g, (NH4)2SO4 0.5g微量元素液5mL、蒸餾水lOOOmL，pH7.0 ;其中微量元素液成份:EDTA 0.6g、ZnSO4 ? 7H20
0.22g、CaCl2 0.05g、MnCl2 ? 4H200.05g、FeSO4 ? 7H20 0.049g、(NH4)2Mo7O24 ? 4H20 0.01g、CuSO4 ? 5H200.016g、CoCl2 ? 6H20 0.02g、蒸餾水 1000mL, pH7.0。
[0030]3、分離純化和馴化培養(yǎng)操作:
[0031]取土壤樣品IOg于90mL分離培養(yǎng)基中，30°C, 150rpm條件下培養(yǎng)2h,靜置。待土壤沉降完全后取上層液IOmL接種到馴化培養(yǎng)基(苯胺500mg/L)，30°C、150rpm條件下培養(yǎng)；一星期后轉(zhuǎn)培養(yǎng)，將IOmL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到馴化培養(yǎng)基(苯胺750mg/L)中，依照上述條件培養(yǎng)，一星期后再轉(zhuǎn)接至馴化培養(yǎng)基(苯胺1000mg/L)。馴化結(jié)束后，將培養(yǎng)物經(jīng)梯度稀釋涂布于添加苯胺的無機(jī)鹽瓊脂平板，得到生長較好的單菌落，通過劃線分離獲得純培養(yǎng)，編號為JY9。
[0032]圖1是菌落培養(yǎng)形態(tài)照片。在LB培養(yǎng)基純培養(yǎng)條件下，菌株JY9的菌落形態(tài)為淡黃色、較濕潤光滑、邊緣整齊、圓形、小而凸起、正反顔色一致；革蘭氏染色陰性，細(xì)胞呈短桿狀；氧化酶試驗(yàn)陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，明膠水解試驗(yàn)陽性，淀粉水解試驗(yàn)陰性；可代謝精氨酸和組氨酸脫氨，可以以苯こ胺為唯一碳氮源，不能利用甘油或蔗糖。菌株JY9經(jīng)鑒定為 Pseudomonas Otitidis 菌株。
[0033]Pseudomonas Otitidis JY9 的 16SrDNA 已提交 Genebank,登錄號 KF159806。
[0034]測試?yán)?br> [0035]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787 降解能力測試。
[0036]1、測試培養(yǎng)基與材料
[0037]測試培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加苯胺2000mg/L ;無機(jī)鹽培養(yǎng)基同實(shí)施例一。
[0038]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787菌懸液:將菌株JY9接種到含苯胺濃度為1000mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，直到0D600值接近于I。
[0039]2、測試操作
[0040]將Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787 菌懸液接種至測試培養(yǎng)基，30°C、160rpm 搖床培養(yǎng)；分別測定接 種后 5h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、62h、72h、82h時(shí)培養(yǎng)基中剩余苯胺濃度并計(jì)算苯胺降解率，測試結(jié)果見圖2。[0041]圖2是Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787對苯胺的降解曲線圖。由圖2可以看出:Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787對苯胺有顯著的降解作用；接種IOh內(nèi)降解菌迅速適應(yīng)降解環(huán)境，接種60h以后降解率達(dá)到90%以上。
[0042]HPLC檢測培養(yǎng)基組分，HPLC分析檢測條件為紫外檢測波長230nm ;流動(dòng)相:甲醇:水=70:30 (v/v);流速:1.0ml/min ;柱溫:30°C。檢測結(jié)果見圖3。
[0043]圖3是Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787對苯胺降解前后的液相色譜圖。圖2A——苯胺濃度，樣品稀釋100倍；圖2B——降解48h，樣品稀釋10倍；圖2C——降解72h，樣品未稀釋。
[0044]本測試?yán)f明Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787的篩選是以降解苯胺為篩選目的，所獲得的菌株可利用苯胺作為唯一碳源與氮源進(jìn)行生長繁殖，即可以降解苯胺。
[0045]試驗(yàn)例一
[0046]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787降解苯胺試驗(yàn)，苯胺濃度對細(xì)菌生長和苯胺降解率的影響。
[0047]1、培養(yǎng)基與材料
[0048]基礎(chǔ)培養(yǎng)基:MSM培養(yǎng)基；
[0049]試驗(yàn)培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加苯胺，苯胺濃度如表1所示；
[0050]Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787 菌懸液:同測試?yán)弧?br> [0051]2、培養(yǎng)測試操作
[0052]向試驗(yàn)培養(yǎng)基中分別接種Pseudomonas Otitidis CGMCC N0.7787菌懸液,調(diào)節(jié)至pH7.0，30°C、160rpm搖床培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束測定培養(yǎng)基中剩余苯胺濃度并計(jì)算苯胺降解率，測定菌液濃度0D600，結(jié)果見表1。
[0053]表1苯胺濃度對細(xì)菌生長和苯胺降解率的影響
[0054]
【權(quán)利要求】
1.菌株P(guān)seudomonasOtitidis JY9,保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保藏編號CGMCC N0.7787，保藏日期2013年6月20日。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株CGMCCN0.7787應(yīng)用于苯胺類化合物降解。
3.如權(quán)利要求1所述的菌株CGMCCN0.7787應(yīng)用于苯胺降解。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:適用的降解培養(yǎng)條件是:溫度10°C~45°C，pH2 ~pHll。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:適用的降解培養(yǎng)條件是:苯胺濃度≤ 5000mg/L。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述降解培養(yǎng)條件是:苯胺濃度1000mg/L~3000mg/L，溫度20で~40で，pH4~9。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述降解培養(yǎng)條件是:苯胺濃度2000mg/L ~3000mg/L，溫度 25°C~30°C，pH5 ~7。
8.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:適用的降解培養(yǎng)條件是=NaCl含量<5mg/L。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述降解培養(yǎng)條件是:苯胺濃度2000mg/L，溫度 30°C，pH7，NaCl 含量≤ 4mg/L。
10.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述降解培養(yǎng)條件是:碳氮源是苯胺，或者碳氮源是苯胺與其他共代謝底物，所述其他共代謝底物是葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母粉、蛋白胨、尿素中的ー種或幾種。
【文檔編號】C12R1/38GK103497909SQ201310379188
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】劉慶華, 王金玉, 李旭東 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所