神經(jīng)干細胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及神經(jīng)干細胞的制備方法。具體而言，本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細胞獲得神經(jīng)干細胞的方法，將間充質(zhì)干細胞在第一、第二、第三培養(yǎng)基中依次進行培養(yǎng)從而獲得神經(jīng)干細胞。最終獲得的神經(jīng)干細胞表達早期神經(jīng)干細胞的標(biāo)志，且能分化為有功能的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞。
【專利說明】神經(jīng)干細胞的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，涉及一種神經(jīng)干細胞的制備方法。更具體 而言，本發(fā)明涉及一種將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為神經(jīng)干細胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的發(fā)病率逐年上升，主要表現(xiàn)為神經(jīng)細胞的功能異?；蚣毎?的進行性丟失，是臨床常見的難治性疾病。對于機體自身而言，功能異常的神經(jīng)細胞很難自 行修復(fù)，而機體自身有限的神經(jīng)再生能力亦不能滿足修復(fù)損傷或細胞替代所需細胞數(shù)量的 需求。目前，對于這些難治性疾病，臨床上一般采用細胞營養(yǎng)療法或藥物治療，但是收效甚 微，尚未有安全有效的治療方法。因此，對于神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的治療成為臨床上一大難 題。
[0003] 隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細胞移植療法應(yīng)運而生，受到人們的廣泛關(guān)注。干細胞是 一類具有自我更新和分化潛能的細胞。我們可以在體外分離獲得自體、同種異體或異種的 干細胞，將其回輸給患者，治療相關(guān)疾病。干細胞移植療法的提出為多種難治性或高發(fā)性疾 病的治療提供了新的途徑，也為神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的患者帶來了新的希望。
[0004] 神經(jīng)干細胞（Neural stem cells,NSCs)是一種多能成體干細胞，能進一步分化為 終末神經(jīng)細胞類型，如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。若將NSCs移植到損傷或病 變部位，通過其在機體環(huán)境內(nèi)的自發(fā)分化，替代功能受損或者凋亡的神經(jīng)細胞，有望攻克上 述醫(yī)學(xué)難題，徹底治愈此類疾病。研究表明，直接將NSCs移植入受損小鼠損傷區(qū)域后，能明 顯減少神經(jīng)凋亡，改善神經(jīng)系統(tǒng)的運動功能，促進損傷區(qū)域的恢復(fù)，明顯改善由神經(jīng)元丟失 所導(dǎo)致的認知功能障礙，因此NSCs是干細胞替代治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想種子細胞來源。
[0005] 然而，NSCs的臨床應(yīng)用還存在諸多問題。首先，NSCs的來源困難，數(shù)量有限。目 前，NSCs可由胚胎干細胞（Embryonic stem cells, ESCs)或誘導(dǎo)性多能干細胞（induced Pluripotent stem cells, iPSCs)分化而來，也可直接從成體神經(jīng)組織中分離獲得。然而 ESCs和iPSCs的使用存在倫理及免疫排斥問題，且由于缺乏嚴格的篩選體系，ESCs或iPSCs 來源的NSCs可能含有未分化完全的多能干細胞，其使用存在致瘤的風(fēng)險。有學(xué)者嘗試從 胚胎或者成體腦組織中分離NSCs，但胚胎NSCs的使用同樣不能回避倫理問題；在成體組織 中，NSCs主要存在于大腦半球的海馬及室管膜下區(qū)，不易分離提取，因此無論從胚胎還是成 體組織中獲得的NSCs，其來源有限，難以獲得足夠數(shù)量的細胞，不能滿足臨床治療的需求。 其次，雖然干細胞的免疫原性較低，但是異體來源的NSCs移植仍然存在免疫排斥問題，極 大的影響移植的效果。最后，存在于成體腦組織不同區(qū)域的NSCs因分化階段不同，具有不 同的特性，這就對臨床用藥方案的制定及療效的評估造成了一定的障礙，極大地限制了該 療法的推廣應(yīng)用。因此，尋找一種NSCs的新來源是目前急需解決的問題。
[0006] 干細胞是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的原始細胞，是細胞移植的理想 細胞。在個體發(fā)育過程中，存在各種形式的干細胞，如胚胎干細胞、多能干細胞以及各種組 織中的定向干細胞，如造血干細胞、神經(jīng)干細胞等，但在實際應(yīng)用上卻面臨倫理的挑戰(zhàn)或取 材的限制。間充質(zhì)干細胞(MSC)是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種亞全能干細 胞群，因其在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化為多種組織細胞，且具有免疫原性低、移植后能形成穩(wěn) 定嵌合等特點，故可作為一種理想的供異基因移植的細胞。因為MSC亞全能干細胞可獲得 向內(nèi)胚層組織分化的潛在能力、容易取材、來源更為豐富且不受倫理限制及沒有成瘤危險， 因此使用間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)獲得神經(jīng)干細胞在臨床上具有更高的應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種神經(jīng)干細胞的制備方法，其包括步驟：
[0008] 1)獲得間充質(zhì)干細胞；
[0009] 2)將間充質(zhì)干細胞在第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0010] 3)之后轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0011] 4)之后轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0012] 5)收集神經(jīng)干細胞。
[0013] 在一些具體的實施方式中，采用本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得間充質(zhì)干細胞。
[0014] 在一些具體的實施方式中，間充質(zhì)干細胞是人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞。
[0015] 在一些具體的實施方式中，間充質(zhì)干細胞是使用本領(lǐng)域公知的分離培養(yǎng)方法獲得 的第3-5代間充質(zhì)干細胞。在另一些具體的實施方式中，也可以使用市售的第3-5代間充 質(zhì)干細胞。
[0016] 在一些具體的實施方式中，將間充質(zhì)干細胞接種于第一培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6-10天， 優(yōu)選8天，此時細胞體積變大，由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀蛹毎螒B(tài)。
[0017] 在一些具體的實施方式中，將完成步驟2)的細胞轉(zhuǎn)接于第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-9 天，優(yōu)選7天，細胞體積變小，形態(tài)趨于一致。
[0018] 在一些具體的實施方式中，將完成步驟3)的細胞轉(zhuǎn)接于第三培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-9 天，優(yōu)選7天，得到神經(jīng)干細胞，此時細胞胞體圓縮，邊緣透亮，鐵壁不牢，容易脫離培養(yǎng)瓶 底部懸浮生長。
[0019] 在一些具體的實施方式中，步驟2)至步驟4)的培養(yǎng)條件為：在37°C、50ml/L C02、 空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種制備神經(jīng)干細胞的試劑盒，其包括第一培養(yǎng)基、 第二培養(yǎng)基和第三培養(yǎng)基，其中：
[0021] 所述第一培養(yǎng)基包括：動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、150-250ml/L血清替代物、5-15ml/L 非必須氨基酸、0. 05-0. 15mmol/L β -巰基乙醇、0. 5-1. 5mmol/L L-谷氨酰胺和0-10ng/ml 堿性成纖維細胞生長因子。
[0022] 所述第二培養(yǎng)基包括：動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5-15ml/L N2添加劑、10-30ml/L B27 添加劑、〇. 05-0. 15mmol/L β -巰基乙醇和0. 5-1. 5mmol/L L-谷氨酰胺。
[0023] 所述第三培養(yǎng)基包括：動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5-15ml/L N2添加劑、10-30ml/L B27 添加劑、〇. 05-0. 15mmol/L β -巰基乙醇、0. 5-1. 5mmol/L L-谷氨酰胺、15_25ng/ml 堿性成 纖維細胞生長因子和15_25ng/ml表皮細胞生長因子。
[0024] 在一些具體的實施方式中，第一培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Knockout DMEM或 Knockout DMEM/F12 培養(yǎng)基。
[0025] 在一些具體的實施方式中，第二培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為體積比為1 :1的 Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0026] 在一些具體的實施方式中，第三培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為體積比為1 :1的 Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0027] 在一些具體的實施方式中，第一培養(yǎng)基由如下組成：Knockout DMEM或Knockout DMEM/F12培養(yǎng)基、200ml/L Knockout血清替代物、10ml/L非必須氨基酸、0. lmmol/LP -巰 基乙醇、lmmol/L L-谷氨酰胺和 3-5ng/ml b-FGF，優(yōu)選 4ng/ml b-FGF。
[0028] 在一些具體的實施方式中，第二培養(yǎng)基由如下組成：體積比為1 :1的Neurobasal 培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基、10ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺和 0. lmmol/L β -疏基乙醇。
[0029] 在一些具體的實施方式中，第三培養(yǎng)基由如下組成：體積比為1 :1的Neurobasal 培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基、10ml/L Ν2添加劑、20ml/L Β27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、 0.1mmol/Li3-疏基乙醇、20ng/ml bFGF 和 20ng/ml EGF。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種根據(jù)上述方法獲得的神經(jīng)干細胞，其細胞表面標(biāo) 志物為Soxl陽性、Pax6陽性、巢蛋白陽性和波形蛋白陽性。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供上述方法獲得的神經(jīng)干細胞在制備用于治療腦損傷或 神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物中的用途。其中，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病選自帕金森和阿爾茨海 默病。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種神經(jīng)元的制備方法，其包括步驟：
[0033] 1)獲得間充質(zhì)干細胞；
[0034] 2)將間充質(zhì)干細胞在第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0035] 3)之后轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0036] 4)之后轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0037] 5)獲得神經(jīng)干細胞；
[0038] 6)將神經(jīng)干細胞在第四培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0039] 7)獲得神經(jīng)元；
[0040] 其中
[0041] 第四培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、10ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、0. 5 μ mol/L維甲酸、10ml/L胎牛血清、50ml/L馬血清和 10ng/ml腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組成。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞的制備方法，其包括步驟：
[0043] 1)獲得間充質(zhì)干細胞；
[0044] 2)將間充質(zhì)干細胞在第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0045] 3)之后轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0046] 4)之后轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0047] 5)獲得神經(jīng)干細胞；
[0048] 6)將神經(jīng)干細胞在第五培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0049] 7)獲得神經(jīng)膠質(zhì)細胞；
[0050] 其中
[0051] 第五培養(yǎng)基由 DMEM/F12、Neurobasal 培養(yǎng)基、lOml/L N2 添加劑、20ml/L B27 添加 劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、0. 5 μ mol/L維甲酸、10ml/L胎牛血清、50ml/L馬血清和10ng/ml 血小板衍生生長因子組成。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052] 圖1 :第3代人脂肪來源間充質(zhì)干細胞形態(tài)。
[0053] 圖2:人脂肪來源間充質(zhì)干細胞免疫表型鑒定。人脂肪來源間充質(zhì)干細胞表達 Flkl、CD29、CD44、CD105、及 HLA-ABC，不表達 CD31、CD34、CD106 及 HLA-DR (橫坐標(biāo)為熒光 強度，以10為底數(shù)；縱坐標(biāo)為計數(shù))。
[0054] 圖3A :第3代人脂肪來源間充質(zhì)干細胞形態(tài)。
[0055] 圖3B :人脂肪來源間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)8天后細胞形態(tài)。
[0056] 圖3C :培養(yǎng)基A培養(yǎng)8天后細胞在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)7天后細胞形態(tài)。
[0057] 圖3D 經(jīng)培養(yǎng)基A和B培養(yǎng)后細胞在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)7天后細胞形態(tài)。
[0058] 圖4 :免疫熒光染色鑒定人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞及誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細胞中 Soxl、Pax6、巢蛋白（Nestin)及波形蛋白（Vimentin)的表達情況。
[0059] 圖5A :人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞和誘導(dǎo)獲得的細胞中神經(jīng)干細胞標(biāo)志基因 Soxl的表達情況。
[0060] 圖5B :人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞和誘導(dǎo)獲得的細胞中神經(jīng)干細胞標(biāo)志基因 Pax6的表達情況。
[0061] 圖5C :人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞和誘導(dǎo)獲得的細胞中神經(jīng)干細胞標(biāo)志基因巢 蛋白的表達情況。
[0062] 圖:人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞和誘導(dǎo)獲得的細胞中神經(jīng)干細胞標(biāo)志基因波 形蛋白的表達情況。
[0063] 圖6A :誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化潛能鑒定，神經(jīng)元樣細胞形態(tài)。
[0064] 圖6B :誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化潛能鑒定，神經(jīng)元樣細胞形態(tài)。
[0065] 圖6C:誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化潛能鑒定，分化后的神經(jīng)元樣細胞 MAP2染色(綠色)。
[0066] 圖7A :誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化潛能鑒定，星形膠質(zhì)細胞樣細 胞形態(tài)。
[0067] 圖7B :誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化潛能鑒定，少突膠質(zhì)細胞樣細 胞形態(tài)。
[0068] 圖7C :誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化潛能鑒定，GFAP染色(綠色)。 [0069] 圖7D :誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化潛能鑒定，04染色(綠色)。
[0070] 圖8A :采用膜片鉗技術(shù)檢測神經(jīng)元的電生理特征，未誘導(dǎo)的人脂肪源性間充質(zhì)干 細胞未檢測到任何電流。
[0071] 圖8B :采用膜片鉗技術(shù)檢測神經(jīng)元的電生理特征，分化后的神經(jīng)元細胞在刺激電 壓的作用下能產(chǎn)生一組內(nèi)向電流。
[0072] 圖8C :采用膜片鉗技術(shù)檢測神經(jīng)元的電生理特征，在細胞外液中加入500nmol/L 的鈉離子阻斷劑TTX后，該內(nèi)向電流可被阻斷。
[0073] 圖9 :分化后的神經(jīng)膠質(zhì)細胞上清中神經(jīng)營養(yǎng)因子的24小時分泌量檢測。

【具體實施方式】
[0074] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不意味著用于限定本發(fā)明。下述實施 例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊 說明，均為自常規(guī)生化試劑商購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實 驗，結(jié)果取平均值。
[0075] 實驗材料
[0076] 青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶-EDTA購自GIBCO公司；
[0077] Trizol 購自美國 Invitrogen 公司；
[0078] Oligo dT、M_MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和RNA酶抑制劑購自日本Takara 公司；
[0079] 兔抗人SoxU兔抗人Pax6、小鼠抗人Nestin、山羊抗人GFAP、小鼠抗人04、小鼠抗 人MAP2抗體均購自Abcam公司；
[0080] 小鼠抗人Vimentin購自Santa Cruz公司；
[0081] 異硫氰酸標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG、異硫氰酸標(biāo)記的山羊抗兔IgG、異硫氰酸標(biāo)記的 兔抗山羊IgG購自Santa cruz公司；
[0082] Knockout DMEM 或 Knockout DMEM/F12 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基、Neurobasal 培 養(yǎng)基、Knockout血清替代物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、N2supplement、B27supplement均購 自GIBCO公司；
[0083] 表皮細胞生長因子（EGF)、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)購自Pepro Tech公 司；
[0084] 維甲酸（Retinoic acid，RA)購自 Sigma 公司。
[0085] 實施例
[0086] 實施例1、培養(yǎng)基的制備
[0087] 培養(yǎng)基A、B、C、D和E的配制：
[0088] 第一培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A)由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成。動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng) 基為Knockout DMEM或Knockout DMEM/F12;溶質(zhì)及其在動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度如 下：200ml/L Knockout血清替代物、10ml/L非必須氨基酸、0· lmmol/L β -疏基乙醇、Immol/ L L-谷氨酰胺、4ng/ml b-FGF。
[0089] 第二培養(yǎng)基(培養(yǎng)基B)由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成。動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 為體積比為1 :1的Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基；溶質(zhì)及其在動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中的濃度如下：l〇ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、0. Immol/ Li3-巰基乙醇。
[0090] 第三培養(yǎng)基(培養(yǎng)基C)由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成。動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 為體積比為1 :1的Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基；溶質(zhì)及其在動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中的濃度如下：l〇ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、0. Immol/ L3-疏基乙醇、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF。
[0091] 第四培養(yǎng)基(培養(yǎng)基D)由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成。動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 為體積比為1 :1的Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基；溶質(zhì)及其在動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中的濃度如下：l〇ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、0. 5ymol/ L 維甲酸（Retinoic acid，RA)、10ml/L 胎牛血清、50ml/L 馬血清和 10ng/ml BDNF (腦源性 神經(jīng)營養(yǎng)因子)。
[0092] 第五培養(yǎng)基(培養(yǎng)基E)由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成。動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng) 基為體積比為1 :1的Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基；所述溶質(zhì)及其在動物細胞 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度如下：l〇ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、 0· 5 μ mol/L 維甲酸（Retinoic acid，RA)、10ml/L 胎牛血清、50ml/L 馬血清和 10ng/ml 血小 板衍生生長因子（PDGF-BB )。
[0093] 實施例2、人神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0094] 步驟一、獲得第3代間充質(zhì)干細胞
[0095] 1、將采用吸脂術(shù)采集出來的脂肪組織用D-Hank's (或PBS)洗去血細胞和麻醉藥， 2g/L II型膠原酶37°C消化30min，100目篩網(wǎng)過濾并收集濾液。
[0096] 2、用D_Hank' s液重懸步驟1獲得的細胞并重復(fù)洗漆2遍以除去I父原酶，室溫 1200rpm離心lOmin，收集細胞。
[0097] 3、將步驟2的細胞以2X IO6個/ml的密度接種于裝有擴增培養(yǎng)液(一個配方的實 例為含 580ml/L DMEM/F12、400ml/L MCDB、20ml/L 胎牛血清、I X l(T9mol/L 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋 白-硒添加劑（ITS)、I X l(T9mol/L地塞米松、I X l(T4mol/L2-磷酸抗壞血酸、20ng/mL白介 素-6、10ng/mL EGF、10ng/mL PDGF-BB，lOOU/mL 青霉素和 100 μ g/mL 鏈霉素)的 T75 細胞培 養(yǎng)瓶中，在37°C、50ml/L CO2、空氣相對濕度為95 %的培養(yǎng)箱培養(yǎng)36hr后（24-48hr均可)棄 去培養(yǎng)液(含未貼壁的細胞)，并補充新的擴增培養(yǎng)液，以后每3d半量更換新的擴增培養(yǎng)液， 當(dāng)細胞達70%-80%匯合時，用lg/L胰蛋白酶（Gibco公司）常規(guī)消化，細胞按照1 :3進行傳 代，得到第1代間充質(zhì)細胞。
[0098] 所述擴增培養(yǎng)液并不限于本實施例使用的擴增培養(yǎng)液，其它間充質(zhì)干細胞適用的 擴增培養(yǎng)液均可以使用。
[0099] 4、將第1代間充質(zhì)細胞在擴增培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3d(在37°C、50ml/L CO2、空氣相對 濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng))，達70%-80%匯合，用0-他1^'8液洗2遍，用以/1胰蛋白酶 (Gibco公司）常規(guī)消化，細胞按照1 :3進行傳代，得到第2代間充質(zhì)細胞。
[0100] 5、將第2代間充質(zhì)細胞在擴增培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3d(在37°C、50ml/L CO2、空氣相對 濕度為95 %的培養(yǎng)箱培養(yǎng))，達70%-80%匯合，用D-Hank' s液洗2遍，然后用lg/L的胰蛋 白酶（Gibco公司）常規(guī)消化，室溫1200rpm離心6min，收集細胞。
[0101] 6、將步驟5的細胞以IX IO6個/孔的密度接種于裝有擴增培養(yǎng)液的6孔板(購自 Nunclon公司）中，在37°C、50ml/L CO2、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6hr，待細胞 貼壁后棄除培養(yǎng)基，用D-Hank' s洗2遍，記作第3代間充質(zhì)干細胞。
[0102] 步驟二、采用培養(yǎng)基組合進行誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得神經(jīng)干細胞
[0103] 1、在6孔板中加入培養(yǎng)基A，每孔2ml。
[0104] 2、在步驟1的6孔板中接種第3代間充質(zhì)干細胞，使其在培養(yǎng)基中的濃度為3 X IO5 個/ml，在37°C、50ml/L CO2、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8d，隔天換液。
[0105] 3、吸棄步驟2的6孔板中的培養(yǎng)基A，加入培養(yǎng)基B，每孔2ml，培養(yǎng)7天，隔天換 液。
[0106] 4、吸棄步驟3的6孔板中的培養(yǎng)基B，加入培養(yǎng)基C，每孔2ml，培養(yǎng)7天，隔天換 液。
[0107] 實施例3、對獲得的神經(jīng)干細胞終末分化能力的鑒定
[0108] 1、向神經(jīng)元分化：將實施例2步驟二最終獲得的細胞種在多聚鳥甘酸/層粘連蛋 白（PDL/laminin)包被的6孔板中，每孔5父10 5細胞，加入第四培養(yǎng)基（即培養(yǎng)基0)，每2天 換液，共培養(yǎng)12-16天，如14天。
[0109] 2、向神經(jīng)膠質(zhì)分化：將實施例2步驟二最終獲得的細胞種在多聚鳥甘酸/層粘連 蛋白（PDL/laminin)包被的6孔板中，每孔5X IO5細胞，加入培養(yǎng)基E，每2天換液，共培養(yǎng) 12-16天，如14天。
[0110] 實施例4、誘導(dǎo)效果的鑒定
[0111] 1、第3代間充質(zhì)干細胞的免疫表型測定
[0112] 步驟一得到的人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞的細胞形態(tài)見圖1。
[0113] 用間接免疫熒光法檢測第3代間充質(zhì)干細胞的表型，用異硫氰酸熒光素（FITC)標(biāo) 記的小鼠抗人 CD29、CD34、CD31、CD44、CD105、CD106、Flk-1、HLA-ABC 和 HLA-DR 抗體(抗體 均購自BD公司）標(biāo)記后進行流式檢測，流式細胞儀為ACCURI C6 (Becton Dickinson)。
[0114] 結(jié)果見圖2,橫坐標(biāo)表示細胞熒光強度，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)；Pl表示所選細胞 群體。表型結(jié)果顯示，第3代人脂肪來源間充質(zhì)干細胞表達FlkU⑶29、⑶44、⑶105及 HLA-ABC，不表達⑶31，⑶34、⑶106及HLA-DR。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所獲得的脂肪來源 間充質(zhì)干細胞的特有表型是Flk-I陽性。
[0115] 2、人間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細胞的鑒定
[0116] (1)形態(tài)鑒定
[0117] 人脂肪來源的第三代間充質(zhì)干細胞（圖3A)在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)8d后，細胞形態(tài)發(fā) 生一定改變：主要表現(xiàn)為細胞體積變大，邊界不清，形成形態(tài)一致的扁平狀細胞(見圖3B)。 這些細胞在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)7天后，細胞回縮，體積變小，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)少量胞膜皺縮的凋 亡細胞。細胞在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)7天后，細胞獲得一致的細胞形態(tài)（圖3C)。隨后，在培養(yǎng)基 C中培養(yǎng)7天的細胞胞體回縮透亮，呈兩極狀態(tài)，細胞間間隙增大，未見明顯的連接（圖3D)。 這一結(jié)果表明經(jīng)過誘導(dǎo)之后細胞呈現(xiàn)神經(jīng)干細胞的典型形態(tài)。
[0118] (2)免疫熒光染色鑒定
[0119] 將實施例2步驟二中最終獲得的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)進行免疫 突光染色，檢測神經(jīng)干細胞標(biāo)志Soxl、Pax6、巢蛋白（Nestin)、波形蛋白（Vimentin)的表達 情況。
[0120] 具體檢測方法如下：細胞以80%冰乙醇固定，PBS清洗后以含10g/L BSA封閉 30min ;然后用抗 Soxl、Pax6、Nestin、Vimentin (工作濃度均為 I :100、1 :100、1 :100、1 :100 稀釋）的一抗4°C孵育過夜；用PBS緩沖液清洗后，再以異硫氰酸(綠色熒光）標(biāo)記的二抗室 溫孵育Ih ;用PBS緩沖液清洗后用H〇echst33342染色液（Sigma)復(fù)染細胞核(藍色熒光)， 在突光顯微鏡下觀察（Olympus)。
[0121] 結(jié)果表明，第3代間充質(zhì)干細胞表達Pax6和Vimentin,不表達Soxl和Nestin。采 用培養(yǎng)基組合誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞均表達Soxl、Pax6、Nestin和Vimentin (結(jié)果見圖4)。這 意味著，采用培養(yǎng)基組合誘導(dǎo)培養(yǎng)后細胞為Soxl陽性、Pax6陽性、Nestin陽性和Vimentin 陽性。
[0122] (3)實時定量PCR分析
[0123] 取實施例2步驟二最終獲得的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)，提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR鑒定神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達情況。采用人GAPDH作 為各基因的對照，所用的引物如下：
[0124] 表1.實時定量PCR所用的引物
[0125]

【權(quán)利要求】
1. 一種神經(jīng)干細胞的制備方法，其包括步驟： 1) 獲得間充質(zhì)干細胞； 2) 將間充質(zhì)干細胞在第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 3) 之后轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 4) 之后轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 5) 獲得神經(jīng)干細胞， 其中優(yōu)選所述間充質(zhì)干細胞是人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞；更優(yōu)選人脂肪來源的 Flk-1陽性的間充質(zhì)干細胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)干細胞的制備方法，其中所述間充質(zhì)干細胞是第3-5代 的間充質(zhì)干細胞；優(yōu)選第3代間充質(zhì)干細胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)干細胞的制備方法，其中 將間充質(zhì)干細胞接種于第一培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6-10天，優(yōu)選8天， 將完成步驟2)的細胞轉(zhuǎn)接于第二培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-9天，優(yōu)選7天， 將完成步驟3)的細胞轉(zhuǎn)接于第三培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-9天，優(yōu)選7天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)干細胞的制備方法，其中步驟2)至步驟4)的培養(yǎng)條件 為：在37°C、50ml/L C02、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5. -種制備神經(jīng)干細胞的試劑盒，其包括： 第一培養(yǎng)基； 第二培養(yǎng)基；和 第三培養(yǎng)基， 其中所述第一培養(yǎng)基包括：動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、150_250ml/L血清替代物、5-15ml/ L非必須氨基酸、0. 05-0. 15mmol/LP -巰基乙醇、0. 5-1. 5mmol/L L-谷氨酰胺和0-10ng/ ml堿性成纖維細胞生長因子；第一培養(yǎng)基的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為Knockout DMEM或 Knockout DMEM/F12 ； 所述第二培養(yǎng)基包括：動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5_15ml/L N2添加劑、10-30ml/L B27添加 劑、0. 05-0. 15mmol/L 0 -巰基乙醇和0. 5-1. 5mmol/L L-谷氨酰胺；第二培養(yǎng)基的動物細胞 基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為體積比為1 :1的Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基； 所述第三培養(yǎng)基包括：動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5_15ml/L N2添加劑、10-30ml/L B27添加 劑、0. 05-0. 15mmol/L 0 -巰基乙醇、0. 5-1. 5mmol/L L-谷氨酰胺、15_25ng/ml 堿性成纖維 細胞生長因子和15-25ng/ml表皮細胞生長因子；第三培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為體積比 為1 :1的Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基。
6. -種制備神經(jīng)干細胞的試劑盒，其由第一培養(yǎng)基、第二培養(yǎng)基和第三培養(yǎng)基組成，其 中 第一培養(yǎng)基為：補充有200ml/L Knockout血清替代物、10ml/L非必須氨基酸、 0. lmmol/LP -巰基乙醇、lmmol/L L-谷氨酰胺和3-5ng/ml堿性成纖維細胞生長因子的 Knockout DMEM培養(yǎng)基或Knockout DMEM/F12培養(yǎng)基；其中堿性成纖維細胞生長因子優(yōu)選 為 4ng/ml ; 第二培養(yǎng)基為：體積比為1 :1的Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基，其中補充有 10ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺和0. lmmol/LP -巰基乙醇； 第三培養(yǎng)基為：體積比為1 :1的Neurobasal培養(yǎng)基與DMEM/F12培養(yǎng)基，其中補充有 10ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、0. lmmol/LP-巰基乙醇、 20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子和20ng/ml表皮細胞生長因子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的神經(jīng)干細胞，所述神經(jīng)干細胞表達早期神經(jīng)干細胞 的標(biāo)志物；神經(jīng)干細胞優(yōu)選為Soxl陽性、Pax6陽性、巢蛋白陽性和波形蛋白陽性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)干細胞在制備用于治療腦損傷或神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病 的藥物中的用途，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病優(yōu)選地選自帕金森和阿爾茨海默病。
9. 一種神經(jīng)元的制備方法，其包括步驟： 1) 獲得間充質(zhì)干細胞； 2) 將間充質(zhì)干細胞在第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 3) 之后轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 4) 之后轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 5) 獲得神經(jīng)干細胞； 6) 將神經(jīng)干細胞在第四培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)； 7) 獲得神經(jīng)元； 其中 第四培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、10ml/L N2添加劑、20ml/L B27添 加劑、lmmol/L L-谷氨酰胺、0? 5 y mol/L維甲酸、10ml/L胎牛血清、50ml/L馬血清和10ng/ ml腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組成。
10. -種神經(jīng)膠質(zhì)細胞的制備方法，其包括步驟： 1) 獲得間充質(zhì)干細胞； 2) 將間充質(zhì)干細胞在第一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 3) 之后轉(zhuǎn)入第二培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 4) 之后轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； 5) 獲得神經(jīng)干細胞； 6) 將神經(jīng)干細胞在第五培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)； 7) 獲得神經(jīng)膠質(zhì)細胞； 其中 第五培養(yǎng)基由DMEM/F12、Neurobasal培養(yǎng)基、10ml/L N2添加劑、20ml/L B27添加劑、 lmmol/L L-谷氨酰胺、0? 5 y mol/L維甲酸、10ml/L胎牛血清、50ml/L馬血清和10ng/ml血 小板衍生生長因子組成。
【文檔編號】C12N5/0793GK104419661SQ201310380429
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】趙春華 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所