一種檢測牛fanci基因缺失的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測牛FANCI基因缺失的方法及試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒中含有由引物對A和引物對B組成的引物對組，所述引物對A由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成，所述引物對B由序列表中的序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成。實驗證明，利用本發(fā)明所提供的引物對組，可快速快速、準確、高效的鑒定牛短脊柱綜合征（BS）遺傳缺陷。本發(fā)明為BS奶牛遺傳缺陷基因的分子篩查提供參考和借鑒，為在今后的育種工作中有計劃地降低BS遺傳缺陷基因頻率提供技術(shù)支撐，為奶牛場進行科學的選種選配提供依據(jù)。
【專利說明】-種檢測牛FANCI基因缺失的方法及試劑盒

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領域】，涉及一種用于檢測牛FANCI基因缺失的方法及試劑 盒，特別涉及一種用于檢測與牛短脊椎綜合征相關(guān)的FANCI基因是否缺失的診斷試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著基因組學研究的深入，人們逐漸認識到幾乎每一個動物都會攜帶一些隱性有 害基因，當它們純合時，表現(xiàn)出不同類型的患病癥狀。在奶牛育種中，由于后裔測定、基因組 選擇等現(xiàn)代育種技術(shù)的應用，在極大地提高了選擇準確性的同時，也潛在地提高了選擇強 度；同時又因為人工授精（Al)等繁殖生物技術(shù)的應用，使個別優(yōu)秀種公牛得到廣泛使用， 增加了群體的近交系數(shù)，降低了有效群體含量。2010年，加拿大奶牛網(wǎng)站（CDN)報道加拿大 荷斯坦牛平均近交系數(shù)已達到5. 87%，娟姍牛為5. 92%。在這種情況下，隱性有害基因純合 的概率增大，遺傳缺陷也隨之發(fā)生，因此每隔幾年就會有一種新的遺傳缺陷出現(xiàn)在某些牛 品種中。如在荷斯坦群體中，1990年以來就相繼報道了瓜氨酸血癥（CN)、牛尿苷酸合酶缺 乏癥（DUMPS)牛白細胞粘附缺陷癥（BLAD)、牛脊柱畸形綜合征（CVM)等奶牛遺傳缺陷。
[0003] 2006年，牛短脊柱綜合征（Brachyspina syndrome, BS)在丹麥荷斯坦牛群中被首 次報道，患病牛臨床表現(xiàn)為胚胎早期流產(chǎn)、發(fā)育遲緩、四肢細長、頸椎和胸椎嚴重縮短、內(nèi)臟 異常等綜合癥狀，并被初步推斷BS可能是新出現(xiàn)的一種隱性遺傳缺陷。該遺傳缺陷基因 的發(fā)現(xiàn)引起了各國奶牛育種協(xié)會和工作者的廣泛關(guān)注，隨后，2008年意大利、2010年德國、 2010年加拿大又相繼報道了 2、1、1頭BS患病死胎。對歐洲共發(fā)現(xiàn)的7個BS患病死胎進 行系譜分析，發(fā)現(xiàn)均可追溯到一頭共同祖先Sweat Haven Tradition (USAM1682485)，也進 一步證明了 BS不僅存在于歐洲荷斯坦牛群體中，同樣存在于北美群體中，另外考慮到BS患 病個體涉及到的主要育種家系，可以推斷出BS擴散范圍和影響程度很大。直到2012年，BS 遺傳缺陷才被成功的定位在BTA21的FANCI基因上。
[0004] BS的分子遺傳機制是牛21號染色體（BTA21)上FANCI (Fanconi anemia complementation-group I)基因上的一段3329bp的缺失突變，導致25、26、27外顯子的丟 失，在877位氨基酸位點處發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化：原本C末端的451個氨基酸的肽鏈被僅含26個 氨基酸的殘肽所取代。目前，BS致病基因可以追溯到一頭著名的美國種公牛Sweet Haven Tradition (USAM1682485)，出生于 1974 年，但主要通過其兩個兒子 Bis-May Tradition Cleitus (USAM1879085)和 Rothrock Tradition Leadman (USAM1983348)進行了擴散。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測牛短脊椎綜合征的引物對組。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于檢測牛短脊椎綜合征的引物對組，具體由引物對A和引物對 B組成，所述引物對A由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成，所述引物對B 由序列表中的序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成。
[0007] 在本發(fā)明中，所述檢測牛短脊椎綜合征具體為：檢測待測牛的基因組中FANCI基 因 （GenBank :AC_000178. 1 的第 9701-74362 位，具體網(wǎng)址如下：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AC_000178. l?report=genbank&from=21124257&to=21208316)是否存在 3329bp的大片段缺失。若采用所述引物對A擴增所得產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列6 所示，則所述待測牛的基因組中FANCI基因存在3329bp的大片段缺失，這說明所述待測牛 為牛短脊椎綜合征隱性攜帶者或牛短脊椎綜合征純合子。牛短脊椎綜合征純合子在胚胎早 期多數(shù)致死，在牛群中很少出現(xiàn)，而且BS純合子表型存在畸形，不需任何檢測手段即可進 行識別。本發(fā)明的目的就是篩查牛群中短脊椎綜合征隱性攜帶者。
[0008] 所述引物對組中的四條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比為1 :1 :1 :1。
[0009] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述引物對組中的每條單鏈DNA在多重PCR反應體系 中的終濃度均為240pM。
[0010] 其中，序列1由25個核苷酸組成；序列2由27個核苷酸組成；序列3為20個核苷 酸組成；序列4由20個核苷酸組成；序列5由3738個核苷酸組成；序列6由409個核苷酸 組成。
[0011] 含有所述引物對組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0012] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種制備所述引物對組的方法。
[0013] 本發(fā)明所提供的制備所述引物對組的方法，具體包括將所述引物對組中的四條單 鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0014] 本發(fā)明的還一個目的是提供一種制備所述試劑盒的方法。
[0015] 本發(fā)明所提供的制備所述試劑盒的方法，具體包括如下步驟：將所述引物對組中 的四條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)：PCR反應 緩沖液、DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶，具體如TaKaRa生物工程(大連）有限公司生產(chǎn)的 TaKaRa Taq聚合酶，其貨號為：R001B)和4種dNTP。
[0016] 所述引物對組，或所述試劑盒在制備檢測待測牛的基因組中FANCI基因是否缺失 的產(chǎn)品中應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測待測牛的基因組中FANCI基因是否缺失的 方法。
[0018] 本發(fā)明所提供的檢測待測牛的基因組中FANCI基因是否缺失的方法，具體可包括 如下步驟：
[0019] (al)以待測牛的基因組DNA為模板，以所述的引物對組進行多重PCR擴增，獲得 PCR產(chǎn)物；
[0020] (a2)檢測步驟（al)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測牛的基因組 中FANCI基因是否缺失：在PCR產(chǎn)物中含有大小為269bp的DNA片段(說明PCR反應本身沒 有問題，結(jié)果可信)的前提下，若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為409bp的DNA片段，則所述待測 牛的基因組中FANCI基因存在缺失，表明所述待測牛為牛短脊椎綜合征隱性攜帶者或牛短 脊椎綜合征純合子；若所述PCR產(chǎn)物中不含有大小為409bp的DNA片段，則所述待測牛的基 因組中FANCI基因中不存在缺失，表明所述待測牛為正常個體，并非牛短脊椎綜合征隱性 攜帶者或牛短脊椎綜合征純合子。
[0021] 在實際應用中，判斷PCR產(chǎn)物中是否含有目的DNA片段時，可通過將PCR產(chǎn)物進行 瓊脂糖凝膠電泳，看電泳圖譜上是否含有目的條帶：電泳圖譜上含有目的條帶，則PCR產(chǎn)物 中含有目的DNA片段；反之，則PCR產(chǎn)物中不含有目的DNA片段。
[0022] 在上述應用或方法中，所述缺失具體為缺失所述FANCI基因中序列5的第 231-3559 位。
[0023] 進一步，所述大小為409bp的DNA片段具體為序列表中序列6所不的DNA片段；所 述大小為269bp的DNA片段具體為序列表中序列7所示的DNA片段。
[0024] 在上述方法中，以所述引物對組進行多重PCR擴增的退火溫度具體為60°C。
[0025] 更加具體的，所述多重PCR的反應條件是：94°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C 退火45s，72°C延伸45s，進行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0026] 在本發(fā)明中，以上所有的所述待測牛均為奶牛，具體為荷斯坦牛，更加具體如北京 地區(qū)的荷斯坦公牛和荷斯坦母牛。
[0027] 實驗證明，利用本發(fā)明所提供的引物對組，采用價格低廉的普通DNA聚合酶(如 Taq DNA聚合酶）即可快速、準確、高效的鑒定牛短脊柱綜合征（BS)遺傳缺陷。本發(fā)明為BS 奶牛遺傳缺陷基因的分子篩查提供參考和借鑒，為在今后的育種工作中有計劃地降低BS 遺傳缺陷基因頻率提供技術(shù)支撐，為奶牛場進行科學的選種選配提供依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為利用實施例1制備的試劑盒，通過多重PCR擴增，檢測牛FANCI基因是否缺 失的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中，泳道M為pBR322DNA/MSPI ladder Marker ;泳道1、3、4和 5為正常牛(非BS遺傳缺陷牛）；泳道2為BS遺傳缺陷攜帶者。
[0029] 圖2為基于LA-Taq聚合酶的BY-F/BY-R引物（即文中所述的引物對A)單重PCR 檢測牛FANCI基因是否缺失的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中，泳道Ml為pBR322DNA/Mspl ;泳 道M2為Ikb DNA Ladder ;泳道AA為正常牛（非BS遺傳缺陷牛）;泳道AB為BS遺傳缺陷攜 帶者。

【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 實施例1、用于檢測牛短脊椎綜合征的試劑盒的制備
[0033] 本實施例中所提供的用于檢測牛短脊椎綜合征的試劑盒，為多重PCR檢測試劑 盒，含有用于檢測牛FANCI基因缺失的引物對A和內(nèi)參引物對B、PCR反應緩沖液、Taq DNA 聚合酶，以及4種dNTP。其中，用于檢測牛FANCI基因的引物對組具體如下：
[0034] 1、BY-F/BY-R 引物
[0035] 依據(jù) GenBank上牛的 FANCI 基因序列（GenBank :AC_000178. 1 的第 9701-74362 位， GenBank :AC_000178. 1 的具體網(wǎng)址參見如下：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AC _000178.1?r印ort=genbank&from=21124257&to=21208316)，并參考 Carole et al (2012) 針對FANCI基因設計的引物序列，確定了檢測BS遺傳缺陷牛的特異性引物BY :
[0036] 上游引物 BY-F (序列 1):5' -GCTCAAGTAGTTAGTTGCTCCACTG-3'（序列 5 的第 1-25 位）；
[0037] 下游引物 BY-R (序列 2) :5' -ATAAATAAATAAAGCAGGATGCTGAAA-3'（序列 5 的第 3712-3738位的反向互補序列）。
[0038] 當待測牛為健康牛（非BS遺傳缺陷牛）時，采用用如上引物對進行PCR擴增，理論 上目標產(chǎn)物為3738bp (序列5)，但由于目標產(chǎn)物過大，采用普通DNA聚合酶(如Taq DNA聚 合酶）進行PCR擴增，不能實現(xiàn)擴增，即無擴增產(chǎn)物。當待測牛為BS攜帶者時，采用如上引 物對進行PCR擴增，會得到大小為409bp的目的DNA片段(序列6)。
[0039] 2、mtATP-F/mtATP-R 引物
[0040] 依據(jù)牛的線粒體基因序列（NO :HQ184035. 1)，設計了內(nèi)標上下游引物：
[0041] 上游引物 mtATP-F (序列 3) :5' -TAAGTTAGAGATTGAGAGCC-3'（序列 7 的第 1-20 位）；
[0042] 下游引物 mtATP-R (序列 4):5'-GATAAGGGTTACGAGAGGGA-3'（序列 7 的第 250-269 位的反向互補序列）。
[0043] 以待測牛的基因組DNA為模板，采用以上引物對進行PCR擴增，其擴增片段長度為 269bp，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
[0044] 實施例2、用實施例1制備的試劑盒檢測牛短脊椎綜合征
[0045] 一、實施例1制備的試劑盒的多重PCR反應體系和反應程序的優(yōu)化
[0046] 1、牛總DNA的提取
[0047] 選擇北京市種公牛站的荷斯坦公牛(包括潛在BS遺傳缺陷攜帶者，即通過美國荷 斯坦協(xié)會網(wǎng)站進行系譜查證的BS攜帶者的后代）為實驗材料，從新鮮離體血液中提取總 DNA，用作PCR擴增模板。當然總DNA不僅可以從血液(例如，新鮮或冷凍的)中提取，也可以 從精液(例如，新鮮或冷凍的)、組織樣品（如耳組織等）或含有毛囊的牛毛樣品中提取、分離 和純化。
[0048] 2、BY-F/BY-R 引物單重 PCR 擴增
[0049] 本發(fā)明的發(fā)明人采用實施例1制備的試劑盒進行BY-F/BY-R引物單重PCR(TaqDNA 聚合酶)，并對反應程序進行了優(yōu)化。
[0050] 反應體系（25μ l):dNTP 混合物（4X2. 5mmol/L)2. 0μ I ;10X 擴增緩沖液(含 Mg2+) 2·5μ1;上游引物 BY-F (20pmol/L)0.3yl;下游引物 BY-R (20pmol/L)0.3yl;Taq DNA 聚合酶（3υ/μ 1) 0· 5μ 1 ;模板 DNA (30ng/y I) L 0μ I ;ddH20補足至 25μ 1。
[0051] 反應程序：94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，55±l(TC退火 30s，72°C延伸 30s，進 行35個循環(huán)；72°C延伸7min，然后4°C保存。
[0052] 結(jié)果顯示：采用實施例1制備的試劑盒進行BY-F/BY-R引物單重PCIUTaq DNA聚 合酶）的退火溫度以58°C為宜。
[0053] 3、mtATP-F/mtATP-R 引物引物單重 PCR 擴增
[0054] 本發(fā)明的發(fā)明人采用實施例1制備的試劑盒進行mtATP-F/mtATP-R引物單重PCR (Taq DNA聚合酶)，并對反應程序進行了優(yōu)化。
[0055] 反應體系（25μ l):dNTP 混合物（4X2. 5mmol/L)2. 0μ I ;10X 擴增緩沖液(含 Mg2+) 2·5μ1;上游引物 BY-F (20pmol/L)0.3yl;下游引物 BY-R (20pmol/L)0.3yl;Taq DNA 聚合酶（3υ/μ 1) 0· 5μ 1 ;模板 DNA (30ng/y I) L 0μ I ;ddH20補足至 25μ 1。
[0056] 反應程序：94°C預變性5min ;94°C變性30s，55±8°C退火30s，72°C延伸30s，進行 35個循環(huán)；72°C延伸7min，然后4°C保存。
[0057] 結(jié)果顯示：采用實施例1制備的試劑盒進行mtATP-F/mtATP-R引物單重PCR (Taq DNA聚合酶）的退火溫度以56°C為宜。
[0058] 4、多重PCR擴增條件優(yōu)化
[0059] 本發(fā)明的發(fā)明人采用實施例1制備的試劑盒進行引物對組的多重PCR (Taq DNA 聚合酶)，并對反應體系和反應程序進行了優(yōu)化，最終確定如下反應體系和反應程序：
[0060] 多重 PCR 反應體系（25μ I) :dNTP 混合物（4X2. 5mmol/L) 2· 0μ I ;10X 擴增緩沖 液（含 Mg2+) 2· 5 μ I ;引物 BY-F (20pmol/L) 0· 3 μ I ;引物 BY-R (20pmol/L) 0· 3 μ I ;引物 mtATP-F (20pmol/L)0.3yl;引物 mtATPR (20pmol/L)0.3yl;Taq DNA 聚合酶（3U/yl) 〇· 5μ I ;模板DNA (30ng/y I) L Ομ I ;ddH20 補足至 25μ 1。
[0061] 多重PCR反應條件為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火45s，72°C延伸 45s，進行35個循環(huán)；72°C延伸lOmin，然后4°C保存。
[0062] 二、實施例1制備的試劑盒的多重PCR反應擴增結(jié)果判定
[0063] 實施例1制備的多重PCR檢測試劑盒中，mtATP-F/mtATP-R引物作為內(nèi)標引物， 對PCR反應本身起到質(zhì)控作用，當擴增得到大小為269bp (序列7)的DNA片段時，實驗結(jié) 果可信。因此，對采用實施例1制備的試劑盒進行引物對組的多重PCR (Taq DNA聚合酶)， 結(jié)果判定標準如下：若PCR擴增得到大小為409bp的DNA片段(序列6)和269bp (序列7) 的DNA片段，則待測牛為BS遺傳缺陷基因攜帶者，（即基因組中FANCI基因缺失序列5的第 231-3559位）；若擴增沒有得到大小為409bp的DNA片段(序列6)，但存在269bp (序列7) 的DNA片段時，則待測牛為正常牛（即基因組中FANCI基因不缺失)。
[0064] 簡言之，待測?；蛐团卸ㄈ缦拢?br> [0065] 健康牛(非BS遺傳缺陷牛）：基因型為AA型，僅出現(xiàn)269bp內(nèi)標電泳帶；
[0066] BS隱性攜帶者：基因型為AB型，即出現(xiàn)269bp內(nèi)標帶和409bp電泳帶。
[0067] BS純合子在胚胎早期多數(shù)致死，在牛群中很少出現(xiàn)，本發(fā)明篩查隱性遺傳缺陷基 因 BS的目的就是找出BS隱性攜帶者。
[0068] 三、用實施例1制備的試劑盒檢測牛短脊椎綜合征的實際應用
[0069] 待測牛：北京地區(qū)的206頭荷斯坦公牛和136頭荷斯坦母牛。
[0070] 1、實施例1制備的試劑盒的多重PCR檢測
[0071] 提取待測牛的基因組DNA，以其為模板，利用實施例1制備的試劑盒，按照步驟一 4 的優(yōu)化后反應體系（DNA聚合酶為TaKaRa生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的TaKaRaTaq聚合 酶，是一種普通Taq酶，其貨號為：R001B)和反應程序進行多重PCR擴增。反應結(jié)束后，取 5μ I PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳檢測，并按照步驟二所述標準對結(jié)果進行判定。
[0072] 結(jié)果顯示：有10頭公牛和3頭母牛經(jīng)多重PCR擴增同時得到大小為269bp和 409bp的兩個目的條帶，判定這13頭牛為BS隱性攜帶者，計算公牛和母牛的BS攜帶率分別 為4. 85%、2. 21%。部分待測牛的PCR擴增結(jié)果如圖1所示。對所得到的269bp和409bp的 目的條帶分別進行序列測定，結(jié)果409bp的目的條帶的核苷酸序列正如序列6所示，269bp 的目的條帶的核苷酸序列正如序列7所示。
[0073] 2、系譜驗證
[0074] 通過系譜追蹤發(fā)現(xiàn)，經(jīng)步驟1鑒定為BS隱性攜帶者的10頭公牛的共同祖先是 Sweet Haven Tradition (USAM1682485)(及其兒子 Cleitus (USA1879085)，與國際上報道 的共同祖先一致，更加證實了所建立方法的準確性。
[0075] 3、基于LA-Taq聚合酶的BY-F/BY-R引物單重PCR檢測
[0076] 為了進一步證實本發(fā)明所提供的多重PCR檢測方法的準確可靠，本發(fā)明的發(fā)明人 又同時對作為待測牛的206頭荷斯坦公牛和136頭荷斯坦母牛進行了基于LA-Taq聚合酶 的BY-F/BY-R引物單重PCR檢測。其中，LA-Taq聚合酶購自TaKaRa生物工程(大連）有限 公司，貨號為：RR02MA，為一種擴增長片段的DNA聚合酶，采用該DNA聚合酶進行PCR擴增， 若待測牛為健康牛（非BS遺傳缺陷牛）可擴增得到與理論大小相符的3738bp的目的條帶 (序列5的第1-3738位)，若待測牛為BS隱性攜帶者則擴增得到409bp目的條帶(序列6)。
[0077] 反應體系（25μ I) :dNTP 混合物（4X2.5mmol/L)4.0y I ;10XLA PCR 緩沖液(含 Mg2+)2. 5μ 1 ;上游引物 BY-F(20pmol/L)0. 5μ 1 ;下游引物 BY-R(20pmol/L)0. 5μ I ;LA-Taq 0嫩聚合酶（5"4 1)0.3以1;模板0嫩（30叩/^1)1.(^1;(1(1!120補足至25 4 1。
[0078] 反應程序：94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，58°C退火 lmin，72°C延伸 2. 5min，進 行35個循環(huán)；72°C延伸lOmin，然后4°C保存。
[0079] 結(jié)果顯示：經(jīng)步驟1鑒定為BS隱性攜帶者的10頭公牛和3頭母牛經(jīng)以上單重PCR 擴增均得到了大小為409bp的目的條帶，而其余牛則僅得到大小為3738bp的目的條帶。部 分待測牛的PCR擴增結(jié)果如圖2所示。
[0080] 綜合以上1-3中三方面的結(jié)果，可見本發(fā)明利用實施例1制備的試劑盒采用多重 PCR檢測待測牛是否為BS遺傳缺陷攜帶者，其實驗結(jié)果可靠，且不必依賴于特殊的DNA聚合 酶--TaKaRa LA-Taq聚合酶。另外，本發(fā)明對我國荷斯坦牛進行了 BS遺傳缺陷基因的分 子診斷，并證實BS遺傳缺陷在我國荷斯坦牛群中存在一定比例，因此有必要對我國荷斯坦 牛群進行大規(guī)模的篩查，標識或淘汰BS遺傳缺陷基因攜帶者，降低BS新遺傳缺陷帶來的潛 在危害。
【權(quán)利要求】
1. 用于檢測牛短脊椎綜合征的引物對組，由引物對A和引物對B組成，所述引物對A由 序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成，所述引物對B由序列表中的序列3和 序列4所示的兩條單鏈DNA組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對組，其特征在于：所述引物對組中的四條單鏈DNA在 PCR反應體系中的摩爾比為1 :1 :1 :1。
3. 含有權(quán)利要求1或2所述引物對組的試劑盒。
4. 制備權(quán)利要求1或2所述引物對組的方法，包括將所述引物對組中的四條單鏈DNA 分別單獨包裝的步驟。
5. 權(quán)利要求3所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟：將所述引物對組中的四條單鏈 DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)：PCR反應緩沖液、DNA 聚合酶和4種dNTP。
6. 權(quán)利要求1或2所述引物對組，或權(quán)利要求3所述試劑盒在檢測待測牛的基因組中 FANCI基因是否缺失的產(chǎn)品中應用。
7. -種檢測待測牛的基因組中FANCI基因是否缺失的方法，包括如下步驟： (al)以待測牛的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1-3任一中所述的引物對組進行PCR 擴增，獲得PCR產(chǎn)物； (a2)檢測步驟（al)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測牛的基因組中 FANCI基因是否缺失：在PCR產(chǎn)物中含有大小為269bp的DNA片段的前提下，若所述PCR產(chǎn) 物中同時含有大小為409bp的DNA片段，則所述待測牛的基因組中FANCI基因存在缺失，若 所述PCR產(chǎn)物中不含有大小為409bp的DNA片段，則所述待測牛的基因組中FANCI基因不 存在缺失。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用或權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述缺失為缺 失所述FANCI基因中序列5的第231-3559位。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述大小為409bp的DNA片段為序 列表中序列6所示的DNA片段；所述大小為269bp的DNA片段為序列表中序列7所示的DNA 片段。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：以所述引物對組進行PCR擴增 的退火溫度為60°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419752SQ201310381613
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】李艷華, 朱玉林, 喬綠, 張勝利, 房靈昭, 劉林, 杜欣悅, 王海浪, 薛建華, 呂小青, 吳瑞杰, 劉振君 申請人:北京奶牛中心