高產(chǎn)超氧化物歧化酶的重組菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)超氧化物歧化酶的重組菌及其應(yīng)用。所述重組菌是在大腸桿菌（Escherichia?coli）菌株BW25113中導(dǎo)入重組質(zhì)粒pBAD-SOD得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒pBAD-SOD是在原核表達(dá)載體pBAD/HisA的多克隆位點(diǎn)插入超氧化物歧化酶編碼基因得到的。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的重組菌進(jìn)行液體發(fā)酵后的發(fā)酵液中，超氧化物歧化酶酶活可達(dá)11000—11857U/mL,是對(duì)照菌的近1.6倍。本發(fā)明在超氧化物歧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)及食品應(yīng)用方面具有重要意義。
【專利說(shuō)明】高產(chǎn)超氧化物歧化酶的重組菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及ー種高產(chǎn)超氧化物歧化酶的重組菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)廣泛存在于各類生物體中，是機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基的天然消除劑，對(duì)機(jī)體細(xì)胞起保護(hù)作用。因此，S0D在抗衰老以及預(yù)防腫瘤和抗炎等方面起著重要的生理作用，受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥日用化工，食品及生化界的極大關(guān)注。S0D在食品エ業(yè)主要應(yīng)用四方面:1)作為保健食品的功效因子或食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，添加到各種食品中；2)制成多種劑型的S0D或復(fù)合型食品；3)用作食品的天然抗氧化劑；4)以富含S0D的原料加工制成保健食品。此外，S0D添加于化妝品中可起到防曬，防止脂褐素的形成，防治皮膚病以及防治瘢痕形成等作用。
[0003]我國(guó)自上世紀(jì)八十年代以來(lái)，對(duì)S0D的應(yīng)用研究主要側(cè)重于動(dòng)植物S0D的提取和純化，國(guó)內(nèi)產(chǎn)品大部分是從動(dòng)物血液中制備的，但由于原材料有限及衛(wèi)生安全性等原因，導(dǎo)致制品產(chǎn)量有限，且血液制品的安全性風(fēng)險(xiǎn)加大，這種方法慢慢的被淘汰。利用基因工程是廣開(kāi)S0D酶源，降低成本和獲得具有天然活性的S0D有效途徑。
[0004]大腸桿菌K-12 (Escherichia coli K-12)品系被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物，國(guó)內(nèi)已有用于食品生產(chǎn)許可的事例(如用大腸桿菌K12生產(chǎn)凝乳酶)。因此選用此系列囷株，能夠保證食品安全性。
[0005]目前，還沒(méi)有利用大腸桿菌K-12品系高產(chǎn)超氧化物歧化酶的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供ー種高產(chǎn)超氧化物歧化酶的重組菌及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所提供的重組菌，是在大腸桿菌(Escherichia coli)菌株BW25113中導(dǎo)入重組質(zhì)粒pBAD-SOD得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒pBAD-SOD是在原核表達(dá)載體pBAD/HisA的多克隆位點(diǎn)(即Nhel和PstI酶切位點(diǎn)間)插入超氧化物歧化酶編碼基因得到的。
[0008]在上述重組菌中，所述超氧化物歧化酶具體可為序列表序列1所示蛋白。
[0009]在上述重組菌中，所述超氧化物歧化酶編碼基因可為序列表序列2所示基因。
[0010]所述重組菌具體可為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BW-pBAD-SOD,已于2013年7月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCN0.7934。
[0011]本發(fā)明保護(hù)上述任一所述重組菌在生產(chǎn)超氧化物歧化酶中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明還提供了ー種生產(chǎn)超氧化物歧化酶的方法，包括如下步驟:
[0013]將上述任一所述重組菌進(jìn)行液體發(fā)酵，得到所述超氧化物歧化酶；
[0014]所述液體發(fā)酵按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:
[0015]1)將所述重組菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，獲得初始發(fā)酵體系；[0016]2)將所述初始發(fā)酵體系于30— 37°C (如30、33或37°C )條件下攪拌培養(yǎng)至發(fā)酵液中菌體OD600值為40—45 (如40、42或45);
[0017]3)向發(fā)酵液中加入L-阿拉伯糖，于28— 30°C (如28、29或30°C )條件下攪拌培養(yǎng);
[0018]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度分別為:葡萄糖 10—20g/L (如 10,15 或 20g/L)，(NH4) 2HP044 — 8g/L (如 4、6 或 8g/L)，KH2P0413—
13.3g/L (如 13 或 13.3g/L) , MgS040.59— 1.2g/L (如 0.59,0.9 或 1.2g/L),檸檬酸1.7—2.0g/L (如 1.7 或 2.0g/L)，F(xiàn)eS0454.67—109.35mg/L (如 54.67,85 或 109.35mg/L)，ZnS0410.22—11.5mg/L (如 10.22 或 11.5mg/L)，CuS043.2— 6.4mg/L (如 3.2、5.0 或
6.4mg/L) , MnS043.2一5.4mg/L (如 3.2、4.3 或 5.4mg/L) , Na2B4070.8一1.22mg/L (如 0.8、
1.0 或 1.22mg/L)，CaCl210—13.66mg/L (如 10、12 或 13.66mg/L)，(NH4) 6M070240.5—lmg/L (如 0.5、0.75 或 lmg/L)；
[0019]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.8—7.0 (如6.8,6.9或7.0)。
[0020]在上述方法中，步驟3)中所述加入按每升所述發(fā)酵液中加入終濃度為1 一2g/L的所述L-阿拉伯糖進(jìn)行。
[0021]在上述方法中，步驟2)中的所述培養(yǎng)包括在發(fā)酵液中的葡萄糖耗盡吋，向所述發(fā)酵液中按200— 250mL/h的速率均速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基的步驟；
[0022]步驟3)中的所述培養(yǎng)包括向所述`發(fā)酵液中按300— 500mL/h的速率均速流加補(bǔ)料
培養(yǎng)基的步驟；
[0023]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中的終濃度分別為:葡萄糖 600—800g/L (如 600,700 或 800g/L)，MgS047.3— 9.73g/L (如 7.3、8.3 或 9.73g/L), FeS04109.4— 2 1 8.8mg/L(如 109.4、169 或 218.8mg/L), ZnS0420.44一25mg/L(如 20.44、23 或 25mg/L)，CuS046.4—12.8mg/L (如 6.4、9.0 或 12.8mg/L)，MnS046.3—10.8mg/L (如
6.3、8.4 或 10.8mg/L), Na2B407l.6一2.4mg/L (如 1.6、2.0 或 2.4mg/L), CaCl220一30.2mg/L (如 20、25 或 30.2mg/L)，(NH4) 6M070241 — 2mg/L (如 1、1.5 或 2mg/L)；
[0024]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的pH % 6.8—7.0 (如6.8、6.9或7.0)。
[0025]在上述方法中，步驟3)中所述培養(yǎng)的時(shí)間為6、7或8小時(shí)(如6、7或8小時(shí))；
[0026]和/或，步驟1)所述初始發(fā)酵體系中菌體的0D_值為1.3 — 1.5。
[0027]在上述方法中，所述液體發(fā)酵的發(fā)酵液中溶氧量為20% — 30%體積百分濃度，pH值為 6.8—7.0。
[0028]在上述方法中，步驟1)所述接種是通過(guò)將含有所述重組菌的種子液按照1: (9一19)(如1:9、1:14或1:19)的體積比接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)；
[0029]所述含有所述重組菌的種子液是將所述重組菌用如下種子培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)制備得到的:溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述種子培養(yǎng)基中的終濃度分別為:蛋白胨10 — 16g/L (如
10、13 或 16g/L),酵母膏 5—10g/L (如 5、8 或 10g/L),氯化鈉 5—10g/L (如 5、8 或 10g/L)，所述種子培養(yǎng)基的pH為6.8—7.0 (如6.8,6.9或7.0)。
[0030]上述過(guò)程中，發(fā)酵過(guò)程的初始培養(yǎng)基的體積一般在10-50升，具體的如20升或30
升等。`
[0031]實(shí)驗(yàn)證明，將超氧化物歧化酶的編碼基因連入原核表達(dá)載體pBAD/HisA的Nhel和PstI位點(diǎn)間獲得重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌K-12表達(dá)菌株BW25113中獲得的重組菌BW-pBAD-SOD,進(jìn)行液體發(fā)酵后的發(fā)酵液中，超氧化物歧化酶酶活可達(dá)11000— 11857U/mL,是對(duì)照菌(超氧化物歧化酶酶活6900— 7100U/mL)的近1.6倍。本發(fā)明在超氧化物歧化酶的エ業(yè)化生產(chǎn)及食品應(yīng)用方面具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為重組菌發(fā)酵液的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為 116KDa、66.2KDa、45KDa、35KDa、25KDa、18.4KDa、12.4KDa,泳道 2 為重組菌 BL21-S0D (對(duì)照菌)的發(fā)酵液的檢測(cè)結(jié)果，泳道3為重組菌BW-pBAD-SOD的發(fā)酵液的檢測(cè)結(jié)果。目的蛋白預(yù)測(cè)分子量為23kDa。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0034]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035]下述實(shí)施例中的結(jié)果如無(wú)特別說(shuō)明，均為三次重復(fù)的平均值。
[0036]下述實(shí)施例中超氧化物歧化酶酶活檢測(cè)的方法如下:
[0037]超氧化物歧化酶1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活(U)的定義為:25°C時(shí)抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時(shí)所需的蛋白量。
[0038]配制如下試劑:
[0039]A液:稱取6.019g三羥甲基氨基甲烷(Tris)加入1L水中，加入0.5mol/L的EDTA.Na2 溶液 2ml，調(diào) pH 至 8.2，備用。
[0040]B液:量取約30ml的蒸餾水，依次加入50 μ 1濃鹽酸，0.283g鄰笨三酚(焦性沒(méi)食子酸)，最后定容至50ml。
[0041]蒸餾水:二重石英蒸餾水。
[0042]0.5mol/L 的 EDTA.Na2 溶液:稱取 93.06g EDTA.Na2，加入 400ml 蒸餾水中，調(diào) pH至8.0,最后定容至500ml。
[0043]將A液作為空白調(diào)零的溶液，25°C，于10ml離心管中加入4.5ml A液，再量取10 μ 1Β液加入含有4.5ml A液的10ml離心管中，輕輕混勻，快速放入紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中，開(kāi)始計(jì)時(shí)，并讀取開(kāi)始計(jì)時(shí)的0D325nm值A(chǔ):，每隔30秒記錄ー個(gè)數(shù)值，依次為A2、A3、A4和A5，計(jì)時(shí)2分鐘，并記錄2分鐘時(shí)的0D325nm值A(chǔ)5，計(jì)算自氧化值Λ Α=(、-ん)/2 ；
[0044]25°C，于10ml離心管中加入4.5ml A液，再依次量取10 μ 1的待測(cè)溶液和Β液加入含有4.5ml A液的10ml離心管中，輕輕混勻，快速放入紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中，開(kāi)始計(jì)吋，并讀取開(kāi)始計(jì)時(shí)的0D325nm值A(chǔ)/，每隔30秒記錄ー個(gè)數(shù)值，依次為A2’、A3’、A4’和A5’，計(jì)時(shí)2分鐘，并記錄2分鐘時(shí)的0D325nm值A(chǔ)5’，計(jì)算待測(cè)溶液中的超氧化物歧化酶抑制鄰苯三酚自氧化速率厶4’=(、’-ん’)/2;
[0045]按照如下公式計(jì)算待測(cè)溶液中超氧化物歧化酶(S0D)的活力(U/mL):
[0046]
【權(quán)利要求】
1.ー種重組菌，是在大腸桿菌(Escherichia coli)菌株BW25113中導(dǎo)入重組質(zhì)粒pBAD-SOD得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒pBAD-SOD是在原核表達(dá)載體pBAD/HisA的多克隆位點(diǎn)插入超氧化物歧化酶編碼基因得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于:所述超氧化物歧化酶為序列表序列1所示蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組菌，其特征在于:所述超氧化物歧化酶編碼基因?yàn)樾蛄斜硇蛄?所不基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1一3中任一所述重組菌，其特征在于:所述重組菌為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC N0.7934的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BW-pBAD-S0Do
5.權(quán)利要求1一4中任一所述重組菌在生產(chǎn)超氧化物歧化酶中的應(yīng)用。
6.ー種生產(chǎn)超氧化物歧化酶的方法，包括如下步驟: 將權(quán)利要求1一4中任一所述重組菌進(jìn)行液體發(fā)酵，得到所述超氧化物歧化酶； 所述液體發(fā)酵按照包括如下步驟的方法進(jìn)行: 1)將所述重組菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，獲得初始發(fā)酵體系； 2)將所述初始發(fā)酵體系于30—37 °C條件下攪拌培養(yǎng)至發(fā)酵液中菌體0D600值為40—45 ； 3)向發(fā)酵液中加入L-阿拉伯糖，`于28—30°C條件下攪拌培養(yǎng)； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度分別為:葡萄糖10—20g/L, (NH4)2HP044 — 8g/L，KH2P0413 —13.3g/L，MgS040.59— 1.2g/L，檸檬酸 1.7—2.0g/L, FeS0454.67—109.35mg/L, ZnS0410.22—11.5mg/L, CuS043.2—6.4mg/L, MnS043.2—5.4mg/L, Na2B4070.8—1.22mg/L, CaCl210—13.66mg/L, (NH4) 6M070240.5—lmg/L ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.8 — 7.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述加入按每升所述發(fā)酵液中加入終濃度為1 一2g/L的所述L-阿拉伯糖進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:步驟2)中的所述培養(yǎng)包括在發(fā)酵液中的葡萄糖耗盡吋，向所述發(fā)酵液中按200— 250mL/h的速率均速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基的步驟； 步驟3)中的所述培養(yǎng)包括向所述發(fā)酵液中按300— 500mL/h的速率均速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基的步驟； 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中的終濃度分別為:葡萄糖600—800g/L, MgS047.3—9.73g/L, FeS04109.4—2 1 8.8/L, ZnS0420.44—25mg/L, CuS046.4—12.8mg/L, MnS046.3一10.8mg/L, Na2B407l.6一2.4mg/L, CaCl220一30.2mg/L, (NH4) 6M070241一2mg/L ;所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的pH為6.8 — 7.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求6—8中任一所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述培養(yǎng)的時(shí)間為6—8小時(shí)； 步驟1)所述初始發(fā)酵體系中菌體的0D_值為1.3 — 1.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求6—9中任一所述的方法,其特征在于: 步驟1)所述接種是通過(guò)將含有所述重組菌的種子液按照1: (9一 19)的體積比接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)；所述含有所述重組菌的種子液是將所述重組菌用如下種子培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)制備得到的:溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述種子培養(yǎng)基中的終濃度分別為:蛋白胨10 — 16g/L，酵母膏5—10g/L,氯化鈉5 — 10g/L，所述種子培養(yǎng)基的pH為6.8 — 7.0。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103451142SQ201310381625
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】左德全, 董志揚(yáng), 何永志, 姜廣, 董亮, 蔣光明 申請(qǐng)人:北京奇化美生物科技有限公司