一種快速檢測(cè)金銀花成分摻偽量的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)金銀花成分摻偽的方法。該方法是利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)金銀花及其偽品山銀花的標(biāo)志性核酸位點(diǎn)進(jìn)行定量分析，已達(dá)到獲得中成藥、保健品、食品中金銀花成分摻偽結(jié)果。本發(fā)明的檢測(cè)方法在3h之內(nèi)即可完成金銀花成分摻偽鑒定工作，具有簡(jiǎn)單易行、靈敏度高、快速、費(fèi)用低、便于推廣等特點(diǎn)，為中藥摻偽鑒定開(kāi)辟了廣闊的前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速檢測(cè)金銀花成分摻偽量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及中成藥、食品、保健品中金銀花成分摻偽量的 檢測(cè)方法，是一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)金銀花及其偽品標(biāo)志性核酸位點(diǎn)定量檢測(cè)的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 來(lái)源純正、品質(zhì)優(yōu)良的藥用植物資源是中藥現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的重要前提之 一。近年來(lái)不斷出現(xiàn)中藥材摻偽事件，不僅損害了中醫(yī)藥的信譽(yù)和消費(fèi)者的信心，更使誤 病害人，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明以大宗藥材金銀花為材料，基于DNA條形碼標(biāo)記中 Sentinel-base位點(diǎn)，結(jié)合焦磷酸測(cè)序分析技術(shù)，建立快速、高通量、自動(dòng)化的金銀花摻偽鑒 別方法，為規(guī)范、監(jiān)管藥材市場(chǎng)提供技術(shù)支撐。
[0003] 焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing)是應(yīng)用于DNA序列分析的新一代技術(shù)。在遺 傳分析中，可以提供核酸序列信息的分子檢測(cè)技術(shù)是"黃金標(biāo)準(zhǔn)"，其權(quán)威性比其他DNA分 析方法如Northern雜交，基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR(Taqman探針）技術(shù)更好。其原理是：在 DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上 每一個(gè)dNTP聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè) 定DNA序列的目的。該技術(shù)用于測(cè)量短DNA鏈序列，是目前唯一能實(shí)時(shí)得到定量序列結(jié)果 的技術(shù)，兼有PCR技術(shù)的靈敏性和測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性，具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，自動(dòng)化程 度高，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，非常適合用于對(duì)蔬菜雜交品種種子純度的鑒定。迄今為止，尚未有 成功利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒定中藥摻偽量的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于公開(kāi)了一種金銀花成分摻偽量檢測(cè)方法，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本 發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：
[0005] 用于檢測(cè)金銀花成分摻偽量的PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序特異性引物，包 括引物正向序列：5' -Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3'，反向引物序列： 5' -AACAITTCCGCTCAGATCTAITT-3'，測(cè)序引物序列：5' -GATGAGAAATATAACGAATT-3'。
[0006] 本發(fā)明所述快速檢測(cè)金銀花成分摻偽量的方法，該方法以供試樣品基因組DNA為 模板，對(duì)已知目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，結(jié)合應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)標(biāo)志性核酸位點(diǎn)進(jìn) 行AQ分析及摻偽量計(jì)算，其包括如下步驟：
[0007] (1)采用引物正向、反向序列的2條PCR特異引物及G〇Taq?Master Mix，加入供 試樣品模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為50 μ L，其各 種成分分別為：2X GoTaq? Master Mix25 μ L，10 μ mol / L 引物各 1 μ L，模板 DNA2 μ L， 用滅菌去離子水補(bǔ)齊至50 μ L ;
[0008] 反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性10min，94°C變性30S，55°C退火30S，72°C延伸45S，循環(huán)50 次，最后72°C延伸7min，4°C保存；
[0009] (2)采用焦磷酸測(cè)序特異性引物，對(duì)供試樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分 析；其中的焦磷酸測(cè)序反應(yīng)體系：測(cè)序反應(yīng)的總體積為100 μ L，其中各種成分分別為：PCR 產(chǎn)物 50yL，Sepharose Beads3yL，Binding Buffer47yL，10ymol / L 測(cè)序引物 1·2μ?， Annealing Buffer38. 8 μ L ；
[0010] (3)測(cè)序時(shí)間8?lOmin，測(cè)序結(jié)束后使用"AQ"模式對(duì)標(biāo)志性核酸位點(diǎn)進(jìn)行分析， 通過(guò)觀察第二個(gè)測(cè)序堿基"T"和第三個(gè)測(cè)序堿基"G"的等位基因頻率判定樣品中金銀花含 量摻偽情況，其中"T"堿基頻率為樣品中金銀花偽品的含量，"G"堿基頻率為樣品中金銀花 正品的含量，兩者之和等于一。
[0011] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中的Binding Buffer47y L指的是：10mmol / L Tris-HCl, 2mol / L NaCl, I mmol / L EDTA，0· I % Tween20，ρΗ7· 6 的溶液；Annealing 1?11打6『38.8以1^指的是：2〇1111]1〇1/1^1'1'18-八〇，21111]1〇1/1^]\%八〇2，卩!17.6的溶液。
[0012] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中每條引物分別配制成濃度為ΙΟΟμπιοΙ / L的貯存 液，工作濃度為IOymol / L。
[0013] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，模板DNA指的是從待測(cè)樣品提取的基因組DNA。
[0014] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，焦磷酸測(cè)序全過(guò)程為：測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增的DNA模板相 結(jié)合。然后將其與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶，以及底物 APS和熒光素一起孵育；四種dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)之一被加入反應(yīng)體系，如與模 扳配對(duì)（A-T，C一G)，此dNTP與引物的末端形成共價(jià)鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)（PPi)釋放出 來(lái)。而且釋放出來(lái)的PPi的量與和模板結(jié)合的dNTP的量成正比；ATP硫酸化酶在三磷酸腺 苷雙磷酸酶存在的情況下催化PPi形成ΑΤΡ,ΑΤΡ驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素 的轉(zhuǎn)化，氧化熒光素發(fā)出與ATP量成正比的可見(jiàn)光信號(hào)，光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測(cè)，并由可 見(jiàn)光信號(hào)峰表示。每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比；然后加入下一種 dNTP。最終待測(cè)序列順序，即可從反應(yīng)光強(qiáng)的信號(hào)峰中讀出。
[0015] 為了能更加清楚的說(shuō)明本發(fā)明的測(cè)定方法，下面對(duì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法做以詳細(xì)的 說(shuō)明。
[0016] 1、原理
[0017] 本方法應(yīng)用一種新型的核酸測(cè)序方法其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒 光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP聚合與一次熒光 信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。本發(fā)明的 測(cè)序方法具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，自動(dòng)化程度高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
[0018] 2、引物設(shè)計(jì)
[0019] 本發(fā)明依據(jù)金銀花及其常見(jiàn)偽品的差異性片段設(shè)計(jì)2條PCR擴(kuò)增特異性引物和1 條焦磷酸測(cè)序引物。引物由上海生物工程公司合成。
[0020] 表1引物序列表如下：
[0021]

【權(quán)利要求】
1. 用于鑒定金銀花成分慘偽量的PCR擴(kuò)增及焦磯酸測(cè)序特異性引物，其特征在 于，包括引物正向序列；5' -Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3'，反向引物序列： 5, -AACATTTCCGCTCAGATCTATTT-3，，測(cè)序引物序列；5, -GATGAGAAATATAACGAATT-3，。
2. -種采用權(quán)利要求1所述特異性引物，快速鑒定金銀花成分慘偽量的方法，其特征 在于包括如下步驟： (1) 采用權(quán)利要求1所述的2條PCR特異引物及GoTaq? Master Mix,加入供試樣品 模板DM進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系；擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為50 y L，其各種成 分分別為；2XG〇Taq?Master Mix25yL，10ymol / L 引物各 luL，模板 DNA2iiL，用滅 菌去離子水補(bǔ)齊至50yL; 反應(yīng)程序；95°C預(yù)變性10min，94°C變性30S，55°C退火30S，72°C延伸45S，循環(huán)50次， 最后72C延伸7min，4°C保存； (2) 采用權(quán)利要求1所述的焦磯酸測(cè)序測(cè)序特異性引物，對(duì)供試樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行焦磯酸測(cè)序分析；其中的焦磯酸測(cè)序反應(yīng)體系；測(cè)序反應(yīng)的總體積為100 y以其中各 種成分分別為；PCR 產(chǎn)物 50 y L, Se地arose Beads3 y L, Binding Buffer47 y L, 10 y mol / L 測(cè)序引物 1. 2 y L, Annealing Buffer38. 8 y L ; 做測(cè)序時(shí)間8?lOmin，測(cè)序結(jié)束后使用"AQ"模式對(duì)標(biāo)志性核酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，通過(guò) 觀察第二個(gè)測(cè)序堿基"T"和第H個(gè)測(cè)序堿基"G"的等位基因頻率判定樣品中金銀花含量慘 偽情況，其中"T"堿基頻率為樣品中金銀花偽品的含量，"G"堿基頻率為樣品中金銀花正品 的含量，兩者之和等于一。
3. 如權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其中每條引物分別配制成濃度為100 y mol / L的膽 存液，工作濃度為10 y mol/Lo
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104419755SQ201310384569
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】蘭青闊, 王永, 劉征輝, 趙新, 朱珠, 徐石勇, 陳銳, 郭永澤 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所