一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒。該發(fā)明利用鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒特異性引物（如SEQ?NO.1-4）建立雙重PCR檢測(cè)方法，并組裝成試劑盒。所述試劑盒不僅能在同一體系中鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒，還能鑒別兩者的混合感染。所述試劑盒具有快速準(zhǔn)確、敏感性高、特異性好等特點(diǎn)，很好地解決了鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染在臨床上難以區(qū)分的問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒，專(zhuān)用于鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的鑒別診斷，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨病毒性肝炎(Duck viral h印atitis)又稱(chēng)鴨肝炎，俗稱(chēng)“背脖病”。5周齡以下的雛鴨對(duì)該病易感，其中3周齡內(nèi)的雛鴨最易感且死亡率高，部分可達(dá)90%以上。該病波及面廣、發(fā)病率高、危害嚴(yán)重，是影響我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。該病由鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起，分為A、B、C三個(gè)基因型，目前在我國(guó)流行的主要是A型和C型。
[0003]新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus, NDRV)感染是近幾年發(fā)生的一種嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的新型疾病。該病可感染不同品種、不同日齡的鴨群，但以3周齡內(nèi)的雛鴨感染最為常見(jiàn)，也最為嚴(yán)重，死亡率可達(dá)50%以上。新型鴨呼腸孤病毒與禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV)以及傳統(tǒng)的番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV)在基因序列、生物學(xué)特性、抗原相關(guān)性方面均存在較大差異。
[0004]鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒在發(fā)病特點(diǎn)、臨床癥狀、病變特征等方面十分相似，具有以侵害雛鴨為主、發(fā)病快、死亡率高、病變以肝臟出血為主等共同特點(diǎn)，在臨床上很難區(qū)分。而這兩種疾病的治療都以抗體注射為主，因此只有將兩者區(qū)分開(kāi)，給予相應(yīng)的抗體，才能取得很好的療效。利用PCR技術(shù)快速、準(zhǔn)確、敏感性高的特點(diǎn)，研制鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒檢測(cè)試劑 盒來(lái)區(qū)分這兩種疾病，這在實(shí)際生產(chǎn)中是急需的。但是目前還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是利用雙重PCR技術(shù)建立一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒，該試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、敏感性高、特異性好等特點(diǎn)，很好地解決了鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染在臨床上難以區(qū)分的問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒，其特征是，包括以下組分(50次量):
[0007]I) TRIZol (總 RNA 抽提試劑):50ml ；
[0008]2) RT 反應(yīng)液:900 μ L,包括 IOmmoI/L dNTP50 μ L、5XRT 緩沖液 200 μ L、20pmol/μ L 檢測(cè)引物 DHAl、DHA2、NDRl、NDR2 各 50 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 25 μ L、DEPC 水425μ L ；
[0009]3)反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV:50 μ L，濃度為 200U/ μ L ；
[0010]4妒0?反應(yīng)液450(^1^:(1(1!120400(^1^10\?0?緩沖液45(^1^5“4 1^ Taq DNA聚合酶50 μ L ;
[0011]5)陽(yáng)性質(zhì)粒:重組質(zhì)粒T-DHA和T-NDR混合物250 μ L，終濃度均為0.1ng/ μ L ；[0012]6 ) DEPC 處理水:2ml。
[0013]上述試劑均購(gòu)自大連寶生物(TAKARA)公司。
[0014]所述檢測(cè)引物DHAl、DHA2、NDRl、NDR2依次為:
[0015]DHAl (上游引物):5，-CTTTCYATCAATGACCARCG-3，(SEQ N0.1)
[0016]DHA2 (下游引物):5’-GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3’ (SEQ N0.2)
[0017](R = A 或者 G ;M = A 或者 C ;Y = C 或者 T ;H = A、T 或者 C ;D=G、A 或者 T)
[0018]上述引物用于檢測(cè)鴨甲肝病毒，擴(kuò)增片段大小為304bp ；
[0019]NDRl (上游引物):5’-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3’ (SEQ N0.3)
[0020]NDR2 (下游引物):5’-TCATGTCGCGCGTCGTAT-3’ (SEQ N0.4)
[0021]上述引物用于檢測(cè)新型鴨呼腸孤病毒，擴(kuò)增片段大小為148bp。
[0022]所述重組質(zhì)粒T-DHA的詳細(xì)制備方法:
[0023]按照TRIZol試劑說(shuō)明提取A型鴨甲肝病毒RNA，利用弓丨物DHA1/DHA2進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)條件如下:
[0024]RT 反應(yīng)體系(20μ L):10mmol/L dNTPl.0 μ L、5 X RT 緩沖液 4.0 μ L、20pmol/μ L 的引物 DHA21.0 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.5 μ URNA 模板 I μ L、DEPC 水 11.5 μ L ;置于 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，200U/μ L反轉(zhuǎn) 錄酶M-MLVl μ L于70°C 5min后加入；反應(yīng)程序:70°C 5min，42°C 30min,95°C 2min。
[0025]PCR 反應(yīng)體系(50μ L):ddH2039 y L、20pmol/y L 引物 DHAll.0 μ L、10XPCR 緩沖液
4.5 μ L、5U/ μ L Taq DNA聚合酶0.5 μ L、RT產(chǎn)物5.0 μ L ;置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序:95°C 2min預(yù)變性；94°C變性15sec、55°C退火15sec、72°C延伸20sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min。
[0026]回收目的條帶，與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，PCR鑒定陽(yáng)性后送上海博尚生物工程有限公司測(cè)序。序列正確的質(zhì)粒標(biāo)記為T(mén)-DHA作為鴨甲肝病毒的陽(yáng)性對(duì)照。
[0027]所述重組質(zhì)粒T-NDR的詳細(xì)制備方法:
[0028]按照TRIZol試劑說(shuō)明提取新型鴨呼腸孤病毒RNA，利用引物NDR1/NDR2進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)條件如下:
[0029]RT 反應(yīng)體系(20μ L):10mmol/L dNTPl.0 μ L、5 X RT 緩沖液 4.0 μ L、20pmol/μ L 引物 NDR1、NDR2 各 1.0 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、RNA 模板 I μ L、DEPC 水 10.5 μ L。置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶M-MLVl μ L于70°C 5min后加入；反應(yīng)程序:700C 5min，42°C 30min,95°C 2min。
[0030]PCR 反應(yīng)體系(50μ L):ddH2040y LU0XPCR 緩沖液 4.5μ L、5U/y L Taq DNA 聚合酶0.5 μ L、RT產(chǎn)物5.0 μ L。置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序:95°C 2min預(yù)變性；94°C變性 15sec、55°C退火 15sec、72°C延伸 20sec，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min。
[0031]回收目的條帶，與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，PCR鑒定陽(yáng)性后送上海博尚生物工程有限公司測(cè)序。序列正確的質(zhì)粒標(biāo)記為T(mén)-NDR作為新型鴨呼腸孤病毒的陽(yáng)性對(duì)照。
[0032]所述檢測(cè)試劑盒的操作步驟:
[0033]I) RNA提取:取200 μ L待測(cè)鴨的病料勻漿液，加入Iml TRIZol，充分震蕩，靜置IOmin后加入200 μ L氯仿,充分混勻，靜置5min后，12000rpm離心IOmin,取上清加入等體積的異丙醇，充分混勻后，放_(tái)20°C靜置至少lh。然后12000rpm離心15min，棄掉上清，加入75%酒精500 μ L，12000rpm離心5min，棄掉上清，RNA沉淀干燥后加入10 μ L DEPC處理水，
備用;
[0034]2) RT反應(yīng):取RT反應(yīng)液18 μ L，加入上述RNAl μ L，混勻后放PCR儀中70°C作用51^11，然后加入反轉(zhuǎn)錄酶1?1^14 1^，混勻后，放？0?儀中421: 30min,95°C 2min，結(jié)束后取出進(jìn)行后續(xù)的PCR反應(yīng)；
[0035]3) PCR反應(yīng):取PCR反應(yīng)液45 μ L，加入上述RT產(chǎn)物5 μ L，混勻后按下面的程序進(jìn)行反應(yīng):95°C 2min預(yù)變性；94°C變性15sec、55°C退火15sec、72°C延伸20sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min ；
[0036]4)陽(yáng)性對(duì)照:取PCR反應(yīng)液45 μ L，加入陽(yáng)性質(zhì)粒5 μ L，混勻后按下面的程序進(jìn)行反應(yīng):95°C 2min預(yù)變性；94°C變性15sec、55°C退火15sec、72°C延伸20sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min ；
[0037]5)電泳觀察:取5 μ L PCR產(chǎn)物加入1.5 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察，若出現(xiàn)約300bp的條帶，可判斷為鴨甲肝病毒陽(yáng)性；若出現(xiàn)約150bp的條帶，可判斷為新型鴨呼腸孤病毒陽(yáng)性；g300bp和150bp的條帶均出現(xiàn)，則可判斷為鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒混
合感染。
[0038]本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn):
[0039]1.本發(fā)明利用設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物在同一個(gè)體系中能區(qū)分鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒，具有省時(shí)、省力、成本低等優(yōu)點(diǎn)；
[0040]2.本發(fā)明對(duì)鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒RNA的最低檢出量均為lpg，具有敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)；
[0041]3.本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒不僅能鑒別出是鴨甲肝病毒感染還是新型鴨呼腸孤病毒感染，還能檢測(cè)出兩者混合感染，這在臨床上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1是檢測(cè)試劑盒對(duì)于A型鴨甲肝病毒的敏感性檢測(cè)結(jié)果。其中M.DNA MarkerDL2000 ；1-7 所對(duì)應(yīng)的病毒 RNA 的含量分別為 lng、lOOpg、10pg、lpg、0.lpg、0.0lpg、0.0Olpgo
[0043]圖2是檢測(cè)試劑盒對(duì)于B型鴨甲肝病毒的敏感性檢測(cè)結(jié)果。其中M.DNA MarkerDL2000 ；1-7 所對(duì)應(yīng)的病毒 RNA 的含量分別為 lng、lOOpg、10pg、lpg、0.lpg、0.0lpg、0.0Olpgo
[0044]圖3是檢測(cè)試劑盒對(duì)于C型鴨甲肝病毒的敏感性檢測(cè)結(jié)果。其中M.DNA MarkerDL2000 ；1-7 所對(duì)應(yīng)的病毒 RNA 的含量分別為 lng、lOOpg、10pg、lpg、0.lpg、0.0lpg、0.0Olpgo
[0045]圖4是檢測(cè)試劑盒對(duì)于新型呼腸孤病毒的敏感性檢測(cè)結(jié)果。其中M.DNA MarkerDL2000 ；1-7 所對(duì)應(yīng)的病毒 RNA 的含量分別為 lng、lOOpg、10pg、lpg、0.lpg、0.0lpg、0.0Olpgo
[0046]圖5是檢測(cè)試劑盒的特異性檢測(cè)結(jié)果。其中M.DNA Marker DL2000 ； 1-9所對(duì)應(yīng)的病毒分別為A型鴨甲肝病毒、B型鴨甲肝病毒、C型鴨甲肝病毒、新型鴨呼腸孤病毒、A型鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒混合物、番鴨呼腸孤病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、鴨副粘病毒。
[0047]圖6是檢測(cè)試劑盒對(duì)于鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒混合物的檢測(cè)結(jié)果。其中M.DNA Marker DL2000 ; 1_4所對(duì)應(yīng)的分別是A型鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒混合物、B型鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒混合物、C型鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒混合物、陰性對(duì)照。
[0048]圖7是檢測(cè)試劑盒對(duì)于A型鴨甲肝病毒的重復(fù)性試驗(yàn)。其中M.DNA MarkerDL2000 ; 1-3所對(duì)應(yīng)的三次重復(fù)檢測(cè)。
[0049]圖8是檢測(cè)試劑盒對(duì)于新型鴨呼腸孤病毒的重復(fù)性試驗(yàn)。其中M.DNA MarkerDL2000 ；1-3所對(duì)應(yīng)的三次重復(fù)檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0050]1.檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)
[0051 ] 根據(jù)Genbank中已登錄的DHAV的3D基因和NDRV的3S基因的保守序列利用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒的檢測(cè)；
[0052]用于DHAV檢測(cè)的簡(jiǎn)并引物是:
[0053]正鏈引物DHAl (上游引物):5’-CTTTCYATCAATGACCARCG-3’ (SEQ N0.1)
[0054]負(fù)鏈引物DHA2 (下游引物):5’-GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3’ (SEQ N0.2) [0055](R = A 或者 G ;M = A 或者 C ;Y = C 或者 T ;H = A、T 或者 C ;D=G、A 或者 T)
[0056]擴(kuò)增片段大小為304bp。
[0057]用于NDRV檢測(cè)的引物是:
[0058]正鏈引物NDRl (上游引物):5’-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3’ (SEQ N0.3)
[0059]負(fù)鏈引物NDR2 (下游引物):5’-TCATGTCGCGCGTCGTAT-3’ (SEQ N0.4)
[0060]擴(kuò)增片段大小為148bp。
[0061]2.反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0062]通過(guò)調(diào)整引物濃度、退火溫度、反應(yīng)時(shí)間等方面對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:
[0063]RT 反應(yīng)體系(20μ L):10mmol/L dNTPl.0 μ L、5 X RT 緩沖液 4.0 μ L、20pmol/μ L 檢測(cè)引物 DHAU DHA2、NDRU NDR2 各 1.0 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、RNA 模板 I μ L、DEPC水8.5 μ L。置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶M-MLVl μ L于70°C 5min后加入；反應(yīng)程序:70°C 5min，42°C 30min,95°C 2min。
[0064]PCR 反應(yīng)體系(50μ L):ddH2040y LUOXPCR 緩沖液 4.5μ L、5U/y L Taq DNA 聚合酶0.5 μ L、RT產(chǎn)物5.0 μ L。置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序:95°C 2min預(yù)變性；94°C變性 15sec、55°C退火 15sec、72°C延伸 20sec，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min。
[0065]3.雙重PCR的特異性
[0066]按照TRIZol試劑說(shuō)明分別提取鴨甲肝病毒(A、B、C三種基因型)、新型鴨呼腸孤病毒、番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨副粘病毒以及新型鴨呼腸孤病毒與鴨甲肝病毒(A、B、C三種基因型)混合物的RNA，并以此為模板利用上述反應(yīng)條件分別RT-PCR，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ L PCR產(chǎn)物加入1.5 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察。結(jié)果:該雙重PCR方法能從A型、B型和C型鴨甲肝病毒中擴(kuò)增到304bp的目的條帶，從新型鴨呼腸孤病毒中擴(kuò)增到148bp的目的條帶，從新型鴨呼腸孤病毒與鴨甲肝病毒(A、B、C三種基因型)混合物中擴(kuò)增到304bp和148bp兩條目的條帶，而對(duì)番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨副粘病毒擴(kuò)增不出任何條帶，如圖5-6所示。
[0067]4.雙重PCR的敏感性 [0068]按照TRIZol試劑說(shuō)明分別提取鴨甲肝病毒(A、B、C三種基因型)和新型鴨呼腸孤病毒的RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量，并將這些RNA都稀釋至lng/ μ L、lOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0.lpg/ μ L、0.0lpg/ μ L、0.0Olpg/ μ L 等七個(gè)濃度(即 RT-PCT 體系檢測(cè)的 RNA 含量分別為 lng、lOOpg、10pg、lpg、0.lpg、0.01pg、0.0Olpg)，然后進(jìn)行 RT-PCR。反應(yīng)結(jié)束后，各取5yL PCR產(chǎn)物加入1.5 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察。結(jié)果:A、B、C型鴨甲肝病毒RNA的最低檢出量均為lpg，新型鴨呼腸孤病毒RNA的最低檢出量也為lpg，如附圖1-4所示。
[0069]5.雙重PCR的重復(fù)性
[0070]利用該雙重PCR方法分別對(duì)A型DHAV陽(yáng)性和NDRV陽(yáng)性的病料進(jìn)行擴(kuò)增，各重復(fù)三次，確定其重復(fù)性。結(jié)果:三次重復(fù)均能擴(kuò)增出目的條帶，且條帶的亮度基本一致。如附圖7-8所示。
[0071]6.鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒(50次)，包括以下成分:
[0072]I)TRIZol:50ml ；
[0073]2) RT 反應(yīng)液:900 μ L，包括 IOmmoI/L dNTP50 μ L、5XRT 緩沖液 200 μ L、20pmol/μ L 檢測(cè)引物 DHAl、DHA2、NDRl、NDR2 各 50 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 25 μ L、DEPC 水425μ L ；
[0074]3)反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV:50 μ L，濃度為 200U/μ L ；
[0075]4妒0?反應(yīng)液450(^1^:(1(1!120400(^1^10\?0?緩沖液45(^1^5“4 1^ Taq DNA聚合酶50 μ L ;
[0076]5)陽(yáng)性質(zhì)粒:重組質(zhì)粒T-DHA和T-NDR混合物250 μ L，終濃度均為0.1ng/ μ L ；
[0077]6 ) DEPC 處理水:2ml。
[0078]7.試劑盒操作步驟:
[0079]I) RNA提取:取200 μ L待測(cè)鴨的病料勻漿液，加入Iml TRIZol，充分震蕩，靜置IOmin后加入200 μ L氯仿,充分混勻，靜置5min后，12000rpm離心IOmin,取上清加入等體積的異丙醇，充分混勻后，放_(tái)20°C靜置至少lh。然后12000rpm離心15min，棄掉上清，加入75%酒精500 μ L，12000rpm離心5min，棄掉上清，RNA沉淀干燥后加入10 μ L DEPC處理水，
備用;
[0080]2) RT反應(yīng):取RT反應(yīng)液18 μ L，加入上述RNAl μ L，混勻后放PCR儀中70°C作用51^11，然后加入反轉(zhuǎn)錄酶1?1^14 1^，混勻后，放？0?儀中421: 30min,95°C 2min，結(jié)束后取出進(jìn)行后續(xù)的PCR反應(yīng)；
[0081]3) PCR反應(yīng):取PCR反應(yīng)液45 μ L，加入上述RT產(chǎn)物5 μ L，混勻后按下面的程序進(jìn)行反應(yīng):95°C 2min預(yù)變性；94°C變性15sec、55°C退火15sec、72°C延伸20sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min ；[0082]4)陽(yáng)性對(duì)照:取PCR反應(yīng)液45 μ L，加入陽(yáng)性質(zhì)粒5 μ L，混勻后按下面的程序進(jìn)行反應(yīng):95°C 2min預(yù)變性；94°C變性15sec、55°C退火15sec、72°C延伸20sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 5min ；
[0083]5)電泳觀察:取5 μ L PCR產(chǎn)物加入1.5 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察，若出現(xiàn)約300bp的條帶，可判斷為鴨甲肝病毒陽(yáng)性；若出現(xiàn)約150bp的條帶，可判斷為新型鴨呼腸孤病毒陽(yáng)性；g300bp和150bp的條帶均出現(xiàn)，則可判斷為鴨甲肝病毒和新型鴨呼腸孤病毒混
合感染。
[0084]8.臨床應(yīng)用
[0085]臨床應(yīng)用檢驗(yàn)的樣品為不同時(shí)期不同鴨場(chǎng)送檢的樣品50份。應(yīng)用本試劑盒和病毒分離鑒定同時(shí)檢測(cè)送檢樣品，比較兩種方法的符合率。
[0086]本試劑盒檢出鴨甲肝病毒陽(yáng)性病料為27份，陽(yáng)性檢出率為54%，而病毒分離鑒定檢出陽(yáng)性病料25份，陽(yáng)性檢出率為50%，兩種方法的符合率為96% (如表1所示)。
[0087]表1試劑盒與病毒分離鑒定比較(鴨甲肝病毒)
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒，其特征是，該試劑盒不僅能鑒別出是鴨甲肝病毒感染還是新型鴨呼腸孤病毒感染，還能檢測(cè)出兩者混合感染；它包括下述引物，其中用于鴨甲肝病毒DHA檢測(cè)的引物為:
上游引物 DHAl:5’-CTTTCYATCAATGACCARCG-3’ ；
下游引物 DHA2:5’ -GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3’， 其中R = A或者G ;M = A或者C ;Y = C或者T ;H = A、T或者C ;D=G、A或者T ; 擴(kuò)增片段大小為304bp ； 用于新型鴨呼腸孤病毒NDRV檢測(cè)的引物為:
上游引物 NDRl:5’-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3’ ；
下游引物 NDR2:5’ -TCATGTCGCGCGTCGTAT-3’ ； 擴(kuò)增片段大小為148bp。
2.如權(quán)利要求1所述的一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒，其特征是，按50次量計(jì)包括以下組分:
1)TRIZol:50ml ；
2)RT反應(yīng)液:900 μ L，包括 IOmmoI/L dNTP50 μ L、5 X RT 緩沖液 200 μ L、20pmol/μ L 檢測(cè)引物 DHA1、DHA2、NDR1、NDR2 各 50 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 25 μ L、DEPC 水 425 μ L ； 3)反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV:50 μ L，濃度為200U/ μ L ； 4)卩0?反應(yīng)液450(^1^:(1(1!120400(^1^10\?0?緩沖液45(^1^5~4 1^ Taq DNA 聚合酶 50 μ L ; 5)陽(yáng)性質(zhì)粒:重組質(zhì)粒T-DHA和T-NDR混合物250μ L，終濃度均為0.1ng/ μ L ； 6)DEPC 處理水:2ml ο
3.如權(quán)利要求2所述的一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒，其特征是，所述重組質(zhì)粒T-DHA的制備方法為:提取A型鴨甲肝病毒RNA，利用引物DHA1/DHA2進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)條件如下: RT 反應(yīng)體系:10mmol/L dNTPL O μ L、5 X RT 緩沖液 4.0 μ L、20pmol/μ L 的引物DHA21.0 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、RNA 模板 I μ L、DEPC 水 11.5 μ L ;置于 PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，200U/yL反轉(zhuǎn)錄酶5min后加入；反應(yīng)程序:70°C 5min，42°C 30min,95°C 2min ；
PCR 反應(yīng)體系:ddH2039 y L、20pmol/y L 引物 DHAl 1.0 μ LUO X PCR 緩沖液 4.5 μ L、5U/yL Taq DNA聚合酶0.5 μ L、RT產(chǎn)物5.0 μ L ;置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序:950C 2min 預(yù)變性；94°C變性 15sec、55°C退火 15sec、72°C延伸 20sec，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min。 回收目的條帶，與載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，PCR鑒定陽(yáng)性后測(cè)序，序列正確的質(zhì)粒標(biāo)記為T(mén)-DHA作為鴨甲肝病毒的陽(yáng)性對(duì)照。
4.如權(quán)利要求2或3所述的一種鑒別鴨甲肝病毒與新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑盒，其特征是，所述重組質(zhì)粒T-NDR的制備方法為:提取新型鴨呼腸孤病毒RNA，利用引物NDRl/NDR2進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)條件如下: RT反應(yīng)體系:10mmol/L dNTPl.0 μ L、5XRT緩沖液4.0 μ L、20pmol/μ L引物NDR1、NDR2各 L 0μ L、40U/y L RNA 酶抑制劑(λ 5μ L、RNA 模板 I μ L、DEPC 水 10.5 μ L ;置于 PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，200U/yL反轉(zhuǎn)錄酶1^1^1口1^于701: 5min后加入；反應(yīng)程序:70°C 5min，42°C 30min,95°C 2min ； PCR 反應(yīng)體系:ddH2040yL、10XPCR 緩沖液 4.5yL、5U/yL Taq DNA 聚合酶 0.5yL、RT產(chǎn)物5.0 μ L ;置于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序:95°C 2min預(yù)變性；94°C變性15sec、55°C退火 15sec、72°C延伸 20sec，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min ； 回收目的條帶，與載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，PCR鑒定陽(yáng)性后測(cè)序，序列正確的.質(zhì)粒標(biāo)記為T(mén)-NDR作為新型鴨呼腸孤病毒的陽(yáng)性對(duì)照。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468827SQ201310385566
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】于可響, 李玉峰, 黃兵, 馬秀麗, 史玉穎, 姜亦飛, 林樹(shù)乾, 宋敏訓(xùn), 李峰 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所