一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源Ⅰ型膠原抗氧化肽的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源Ⅰ型膠原抗氧化肽的制備工藝，它包括如下步驟：（1）酸堿脫脂脫灰技術(shù)及低溫粉碎技術(shù)預(yù)處理水產(chǎn)副產(chǎn)品；（2）低溫酶提取技術(shù)提?、裥湍z原蛋白，提取產(chǎn)率高于15％；（3）低溫離心技術(shù)去除固體雜質(zhì)；（4）低溫鹽析技術(shù)協(xié)同低溫離心技術(shù)分離純化Ⅰ型膠原蛋白；（5）耐酸型卷式納濾膜分離技術(shù)脫鹽；（6）酶催化技術(shù)制備Ⅰ型膠原抗氧化肽溶液；（7）噴霧干燥技術(shù)干燥Ⅰ型膠原抗氧化肽溶液，得到蛋白質(zhì)含量超過95％的Ⅰ型膠原抗氧化肽粉成品。所制得水產(chǎn)副產(chǎn)品源Ⅰ型膠原抗氧化肽提取產(chǎn)率高、抗氧化活性高、蛋白質(zhì)含量高、生物安全性高、生產(chǎn)成本低，充分利用水產(chǎn)品副產(chǎn)品，變廢為寶，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]自由基嚴重威脅著人類的健康，現(xiàn)代研究表明:白內(nèi)障、心血管疾病、動脈硬化、糖尿病、老年癡呆癥及衰老等老齡病均被公認與自由基應(yīng)激損傷密切相關(guān)。人工合成抗氧化劑的療效得到醫(yī)學(xué)界的普遍認可，但其毒副作用使其使用受到限制，高安全性的水產(chǎn)副產(chǎn)品源膠原抗氧化肽為研究的熱點，可廣泛應(yīng)用于食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域，具有巨大的市場前景。
[0003]水產(chǎn)副產(chǎn)品源膠原抗氧化肽上世紀90年代在國外得到廣泛的研究，進入21世紀以后，國內(nèi)關(guān)于水產(chǎn)副產(chǎn)品源膠原抗氧化肽的研究也取得豐碩的成果，部分產(chǎn)品獲得國家保健品批號。水產(chǎn)副產(chǎn)品除含有I型膠原蛋白外還含有π、ν、χι不同類型的膠原蛋白，單一型膠原規(guī)?；苽浼夹g(shù)成為制約單一型膠原活性肽產(chǎn)業(yè)化研發(fā)的瓶頸問題，目前未見有涉及利用水產(chǎn)副產(chǎn)品生產(chǎn)I型膠原抗氧化肽的相關(guān)專利，現(xiàn)有的市面上的膠原抗氧化肽產(chǎn)品都為多種類型膠原肽混合物產(chǎn)品，未見I型膠原抗氧化肽的產(chǎn)品上市。為了提高膠原抗氧化肽產(chǎn)品的附加值，急需開發(fā)一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對目前水產(chǎn)副產(chǎn)品源膠原抗氧化肽存在的生產(chǎn)成本高、提取產(chǎn)率低、產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量低、生物活性低、安全性低、附加值低等問題，提供一種工藝簡單安全、成本低、產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量高、生物活性高，且僅含有單一型膠原蛋白肽(I型)的水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，以充分利用水產(chǎn)副產(chǎn)品，變廢為寶，開發(fā)高附加值的I型膠原抗氧化肽。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，包括如下步驟:
1、一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:它包括如下步驟:
(1)水產(chǎn)副產(chǎn)品的預(yù)處理
將水產(chǎn)副產(chǎn)品投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為1-5%的堿溶液攪拌除雜，攪拌后用水洗凈；加入體積百分比濃度為0.5-5%的酸溶液攪拌除雜，脫脂脫灰去除水產(chǎn)副產(chǎn)物的脂肪和無機鹽雜質(zhì)；除雜后的水產(chǎn)副產(chǎn)物投入粉碎機中粉碎；
(2)I型膠原蛋白的提取
將粉碎后的水產(chǎn)副產(chǎn)品置于反應(yīng)釜中，加入水和相當(dāng)于水產(chǎn)副產(chǎn)品投料重量0.01 -
0.1%的胃蛋白酶進行酶法提取，反應(yīng)溫度為1-4 °C，反應(yīng)pH值控制在1-3，反應(yīng)時間為8-12h，得到I型膠原蛋白粗提物，提取產(chǎn)率高于15% ；
(3)I型膠原蛋白的固液分離利用離心機分離技術(shù)分離I型膠原蛋白粗提物，除掉固體雜質(zhì)；
(4)I型膠原蛋白的鹽析
步驟(3)所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為2-20%的無機鹽溶液鹽析；利用離心機分離技術(shù)分離鹽析溶液，得到I型膠原蛋白沉淀物；
(5)I型膠原蛋白的脫鹽
配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，利用膜分離技術(shù)去除I型膠原蛋白溶液的無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液；
(6)I型膠原抗氧化肽的制備
將步驟(5)所述的高純I型膠原蛋白溶液置于反應(yīng)釜中，添加相當(dāng)于水產(chǎn)副產(chǎn)品投料重量0.1 — 1%的蛋白酶，進行酶解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為50-55°C，酶解反應(yīng)pH值控制在7_8，反應(yīng)2-6小時，酶解反應(yīng)結(jié)束，升溫到85°C滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液；
(7)I型膠原抗氧化肽的干燥
利用噴霧干燥技術(shù)干燥I型膠原抗氧化肽溶液，得到蛋白質(zhì)含量超過95%的I型膠原抗氧化肽粉成品。
[0006]所述的步驟(I)預(yù)處理使用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸。
[0007]所述的步驟(I)粉碎溫度為1-4°C。
[0008]所述的步驟(2)及步驟(6)控制反應(yīng)pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉,所用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸。
[0009]所述的步驟(3)和步驟(4)中所用的離心機為轉(zhuǎn)速為1000 — 4500rpm/min,離心
溫度為1-4 °C。
[0010]所述的步驟(4)中利用無機鹽鹽析分離純化，所使用的無機鹽為硫酸銨或氯化鈉，鹽析溫度為1_4°C。
[0011]所述的步驟(5)中膜分離技術(shù)所使用的膜設(shè)備為耐酸型卷式納濾膜設(shè)備，所使用的膜截留平均相對分子質(zhì)量為IkD - lOOkD。
[0012]所述的步驟(5)中膜分離技術(shù)除鹽，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，并控制膠原蛋白溶液溫度為1-4 °C。
[0013]所述的步驟(6)中所用的蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶、海產(chǎn)品水解專用蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中的任意兩種或者三種組合。
[0014]所述的步驟(7)中噴霧干燥的出風(fēng)溫度為65_85°C、進風(fēng)溫度為140_180°C。
[0015]采用上述方案后，本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明利用低溫粉碎預(yù)處理技術(shù)和低溫酶提取技術(shù)制備I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率高于15%，解決I型膠原蛋白傳統(tǒng)提取工藝存在得率低的瓶頸問題，利于產(chǎn)業(yè)化放大生產(chǎn)。
[0016]2、本發(fā)明綜合利用低溫離心分離技術(shù)、低溫鹽析分離技術(shù)和耐酸型卷式膜分離技術(shù)分離純化I型膠原蛋白，改變傳統(tǒng)的分離工藝存在的分離效率低、設(shè)備使用壽命短，生產(chǎn)成本過高等問題，簡化工藝，縮短時間，節(jié)約成本，分離效率高，利于規(guī)模化放大生產(chǎn)。
[0017]3、本發(fā)明利用酶工程技術(shù)制備I型膠原抗氧化肽肽，條件溫和，質(zhì)量可控，得到蛋白質(zhì)含量超過95%的水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽。[0018]總之，本發(fā)明采用上述工藝后，所制得水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽成本低、抗氧化活性高、蛋白質(zhì)含量高，并充分利用了水產(chǎn)副產(chǎn)品，變廢為寶，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0021]本發(fā)明所揭示的是一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工，如圖1所示，本發(fā)明包括如下步驟:水產(chǎn)副產(chǎn)品——酸堿脫脂脫灰技術(shù)去除脂肪和無機鹽——低溫粉碎技術(shù)粉碎——低溫酶提取技術(shù)提取I型膠原蛋白一低溫離心技術(shù)去除固體雜質(zhì)一低溫鹽析技術(shù)協(xié)同低溫離心技術(shù)分離純化I型膠原蛋白一耐酸型卷式納濾膜分離技術(shù)脫鹽——酶催化技術(shù)制備I型膠原抗氧化肽溶液決速干燥I型膠原抗氧化肽。
[0022]以下通過具體實施例說明。
[0023]實施例一:
1、取魚鱗50kg投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為1%的氫氧化鈉溶液，攪拌2小時，用水洗凈；再加入體積百分比濃度為4%的硫酸溶液，攪拌2小時，用水洗凈，脫脂脫灰除掉魚鱗雜質(zhì)。將脫脂脫灰后魚鱗投入粉碎機中，加入氮氣調(diào)節(jié)溫度，并控制粉碎過程溫度為 1-4。。。
[0024]2、將粉碎后的魚鱗置于反應(yīng)釜中，加入250kg的水，加入0.005kg的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為 I,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為1°C，反應(yīng)12小時，結(jié)束反應(yīng)，得到I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率為 16%。
[0025]3、利用轉(zhuǎn)速為1000rpm/min的離心機分離上述的I型膠原蛋白溶液，離心溫度控制在1-4°C，除掉顆粒狀雜質(zhì)。
[0026]4、在1-4°C條件下，將所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為2%硫酸銨或氯化鈉溶液。利用轉(zhuǎn)速為1000rpm/min的離心機分離該溶液，離心分離溫度控制在1_4°C，得到I型膠原蛋白沉淀物。
[0027]5、配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，得到I型膠原蛋白溶液。利用截留相對分子質(zhì)量為5kD的耐酸型卷式納濾膜設(shè)備分離純化該膠原蛋白溶液，膜分離純化過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，控制膠原蛋白溫度為1_4°C，去除無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液。
[0028]6、將高純I型膠原蛋白溶液裝入反應(yīng)釜中，加入0.025kg木瓜蛋白酶和0.025kg菠蘿蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為7,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為55°C，反應(yīng)3小時，反應(yīng)結(jié)束后升溫到85°C保溫滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液。
[0029]7、利用噴霧干燥機干燥I型膠原抗氧化肽溶液，出風(fēng)溫度為85°C、進風(fēng)溫度為180°C，噴霧干燥結(jié)束，得到I型膠原抗氧化肽粉成品。粉成品的蛋白質(zhì)含量為97%，清除超氧陰離子自由基的活性為73%。[0030] 實施例二:
1、取魚鱗IOOkg投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為3%的碳酸氫鈉溶液，攪拌4小時，用水洗凈；再加入體積百分比濃度為5%的醋酸溶液，攪拌6小時，用水洗凈，脫脂脫灰除掉魚鱗雜質(zhì)。將脫脂脫灰后魚鱗投入粉碎機中，加入氮氣調(diào)節(jié)溫度，并控制粉碎過程溫度為 1-4。。。
[0031]2、將粉碎后的魚鱗置于反應(yīng)釜中，加入500kg的水，加入0.1kg的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為3,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為4°C，反應(yīng)10小時，結(jié)束反應(yīng)，得到I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率為18%。
[0032]3、利用轉(zhuǎn)速為3000rpm/min的離心機分離上述的I型膠原蛋白溶液，離心溫度控制在1-4°C，除掉顆粒狀雜質(zhì)。
[0033]4、在1-4°C條件下，將所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為10%硫酸銨或氯化鈉溶液。利用轉(zhuǎn)速為3000rpm/min的離心機分離該溶液，離心分離溫度控制在1_4°C，得到I型膠原蛋白沉淀物。
[0034]5、配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，得到I型膠原蛋白溶液。利用截留相對分子質(zhì)量為IOOkD的耐酸型卷式納濾膜設(shè)備分離純化該蛋白質(zhì)溶液，膜分離純化過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，控制膠原蛋白溫度為1_4°C，去除無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液。
[0035]6、將高純I型膠原蛋白溶液裝入反應(yīng)釜中，加入0.225kg中性蛋白酶和0.225kg魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶和0.05kg風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為7，調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉,所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸,反應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)4小時，反應(yīng)結(jié)束后升溫到85°C保溫滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液。
[0036]7、利用噴霧干燥機干燥I型膠原抗氧化肽溶液，出風(fēng)溫度為80°C、進風(fēng)溫度為160°C，噴霧干燥結(jié)束，得到I型膠原抗氧化肽粉成品。粉成品的蛋白質(zhì)含量為96%，清除超氧陰離子自由基的活性為85%。
[0037]實施例三:
1、取魚鱗IOkg投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為3%的碳酸氫鈉溶液，攪拌4小時，用水洗凈；再加入體積百分比濃度為I %的鹽酸溶液，攪拌4小時，用水洗凈，脫脂脫灰除掉魚鱗雜質(zhì)。將脫脂脫灰后魚鱗投入粉碎機中，加入氮氣調(diào)節(jié)溫度，并控制粉碎過程溫度為 1-4。。。
[0038]2、將粉碎后的魚鱗置于反應(yīng)釜中，加入50kg的水，加入0.0lkg的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為3,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為3°C，反應(yīng)8小時，結(jié)束反應(yīng)，得到I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率為17%。
[0039]3、利用轉(zhuǎn)速為4000rpm/min的離心機分離上述的I型膠原蛋白溶液，離心溫度控制在1-4°C，除掉顆粒狀雜質(zhì)。
[0040]4、在1_4°C條件下，將所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為20%硫酸銨或氯化鈉溶液。利用轉(zhuǎn)速為4000rpm/min的離心機分離該溶液，離心分離溫度控制在1_4°C，得到I型膠原蛋白沉淀物。[0041]5、配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，得到I型膠原蛋白溶液。利用截留相對分子質(zhì)量為50kD的耐酸型卷式納濾膜設(shè)備分離純化該蛋白質(zhì)溶液，膜分離純化過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，控制膠原蛋白溫度為1_4°C，去除無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液。
[0042]6、將高純I型膠原蛋白溶液裝入反應(yīng)釜中，加入0.045kg木瓜蛋白酶和0.045kg海產(chǎn)品水解專用蛋白酶和0.0Ikg風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為7.5，調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為55°C,反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后升溫到85°C保溫滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液。
[0043]7、利用噴霧干燥機干燥I型膠原抗氧化肽溶液，出風(fēng)溫度為65°C、進風(fēng)溫度為140°C，噴霧干燥結(jié)束，得到I型膠原抗氧化肽粉成品。粉成品的蛋白質(zhì)含量為97%，清除超氧陰離子自由基的活性為81%。
[0044]實施例四:
1、取魚鱗80kg投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為1%的氫氧化鈉溶液，攪拌3小時，用水洗凈；再加入體積百分比濃度為3%的鹽酸溶液，攪拌4小時，用水洗凈，脫脂脫灰除掉魚鱗雜質(zhì)。將脫脂脫灰后魚鱗投入粉碎機中，加入氮氣調(diào)節(jié)溫度，并控制粉碎過程溫度為 1-4。。。
[0045]2、將粉碎后的魚鱗置于反應(yīng)釜中，加入400kg的水，加入0.04kg的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為2,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為2V，反應(yīng)10小時，結(jié)束反應(yīng)，得到I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率為16%。
[0046]3、利用轉(zhuǎn)速為4500rpm/min的離心機分離上述的I型膠原蛋白溶液，離心溫度控制在1-4°C，除掉顆粒狀雜質(zhì)。
[0047]4、在1-4°C條件下，將所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為6%硫酸銨或氯化鈉溶液。利用轉(zhuǎn)速為4500rpm/min的離心機分離該溶液，離心分離溫度控制在1_4°C，得到I型膠原蛋白沉淀物。
[0048]5、配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，得到I型膠原蛋白溶液。利用截留相對分子質(zhì)量為IkD的耐酸型卷式納濾膜設(shè)備分離純化該蛋白質(zhì)溶液，膜分離純化過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，控制膠原蛋白溫度為1-4°C，去除無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液。
[0049]6、將高純I型膠原蛋白溶液裝入反應(yīng)釜中，加入0.24kg中性蛋白酶和0.24kg木瓜蛋白酶和0.24kg菠蘿蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為7，調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為55°C,反應(yīng)6小時,反應(yīng)結(jié)束后升溫到85°C保溫滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液。
[0050]7、利用噴霧干燥機干燥I型膠原抗氧化肽溶液，出風(fēng)溫度為70°C、進風(fēng)溫度為140°C，噴霧干燥結(jié)束，得到I型膠原抗氧化肽粉成品。粉成品的蛋白質(zhì)含量為96%，清除超氧陰離子自由基的活性為75%。
[0051]實施例五:
1、取魚皮50kg投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為5%的碳酸氫鈉溶液，攪拌4小時，用水洗凈；再加入體積百分比濃度為I %的硫酸溶液，攪拌4小時，用水洗凈，脫脂脫灰除掉魚皮雜質(zhì)。將脫脂脫灰后魚皮投入粉碎機中，加入氮氣調(diào)節(jié)溫度，并控制粉碎過程溫度為 1-4℃
[0052]2、將粉碎后的魚皮置于反應(yīng)釜中，加入250kg的水，加入0.005kg的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為3,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉,所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為2V，反應(yīng)12小時，結(jié)束反應(yīng)，得到I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率為 18%。
[0053]3、利用轉(zhuǎn)速為3000rpm/min的離心機分離上述的I型膠原蛋白溶液，離心溫度控制在1-4°C，除掉顆粒狀雜質(zhì)。
[0054]4、在1-4°C條件下，將所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為6%硫酸銨或氯化鈉溶液。利用轉(zhuǎn)速為3000rpm/min的離心機分離該溶液，離心分離溫度控制在1_4°C，得到I型膠原蛋白沉淀物。
[0055]5、配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，得到I型膠原蛋白溶液。利用截留相對分子質(zhì)量為8kD的耐酸型卷式納濾膜設(shè)備分離純化該蛋白質(zhì)溶液，膜分離純化過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，控制膠原蛋白溫度為1-4°C，去除無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液。
[0056]6、將高純I型膠原蛋白溶液裝入反應(yīng)釜中，加入0.225kg菠蘿蛋白酶和0.225kg海產(chǎn)品水解專用蛋白酶和0.05kg風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為7.5，調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為50°C,反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后升溫到85°C保溫滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液。
[0057]7、利用噴霧干燥機干燥I型膠原抗氧化肽溶液，出風(fēng)溫度為80°C、進風(fēng)溫度為160°C，噴霧干燥結(jié)束，得到I型膠原抗氧化肽粉成品。粉成品的蛋白質(zhì)含量為98%，清除超氧陰離子自由基的活性為82%。
[0058]實施例六:
1、取魚皮IOOkg投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為3%的氫氧化鈉溶液，攪拌4小時，用水洗凈；再加入體積百分比濃度為0.5%的硫酸溶液，攪拌3小時，用水洗凈，脫脂脫灰除掉魚皮雜質(zhì)。將脫脂脫灰后魚皮投入粉碎機中，加入氮氣調(diào)節(jié)溫度，并控制粉碎過程溫度為1-4 °C。
[0059]2、將粉碎后的魚皮置于反應(yīng)釜中，加入500kg的水，加入0.08kg的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為3,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為3°C，反應(yīng)8小時，結(jié)束反應(yīng)，得到I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率為17%。
[0060]3、利用轉(zhuǎn)速為2000rpm/min的離心機分離上述的I型膠原蛋白溶液，離心溫度控制在1-4°C，除掉顆粒狀雜質(zhì)。
[0061]4、在1-4°C條件下，將所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為10%硫酸銨或氯化鈉溶液。利用轉(zhuǎn)速為2000rpm/min的離心機分離該溶液，離心分離溫度控制在1_4°C，得到I型膠原蛋白沉淀物。
[0062]5、配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，得到I型膠原蛋白溶液。利用截留相對分子質(zhì)量為IOkD的耐酸型卷式納濾膜設(shè)備分離純化該蛋白質(zhì)溶液，膜分離純化過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，控制膠原蛋白溫度為1_4°C，去除無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液。
[0063]6、將高純I型膠原蛋白溶液裝入反應(yīng)釜中，加入0.45kg菠蘿蛋白酶和0.45kg胰蛋白酶和0.1kg風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為8，調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為50°C,反應(yīng)3小時,反應(yīng)結(jié)束后升溫到85°C保溫滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液。
[0064]7、利用噴霧干燥機干燥I型膠原抗氧化肽溶液，出風(fēng)溫度為75°C、進風(fēng)溫度為170°C，噴霧干燥結(jié)束，得到I型膠原抗氧化肽粉成品。粉成品的蛋白質(zhì)含量為97%，清除超氧陰離子自由基的活性為71%。
[0065]實施例七:
1、取魚皮IOkg投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為5%的氫氧化鈉溶液，攪拌6小時，用水洗凈；再加入體積百分比濃度為0.8%的鹽酸溶液，攪拌3小時，用水洗凈，脫脂脫灰除掉魚皮雜質(zhì)。將脫脂脫灰后魚皮投入粉碎機中，加入氮氣調(diào)節(jié)溫度，并控制粉碎過程溫度為1-4 °C。
[0066]2、將粉碎后的魚皮置于反應(yīng)釜中，加入50kg的水，加入0.0lkg的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為2,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為2V，反應(yīng)10小時，結(jié)束反應(yīng)，得到I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率為17%。
[0067]3、利用轉(zhuǎn)速為4500rpm/min的離心機分離上述的I型膠原蛋白溶液，離心溫度控制在1-4°C，除掉顆粒狀雜質(zhì)。
[0068]4、在1-4°C條件下，將所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為10%硫酸銨或氯化鈉溶液。利用轉(zhuǎn)速為4500rpm/min的離心機分離該溶液，離心分離溫度控制在1_4°C，得到I型膠原蛋白沉淀物。
[0069]5、配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，得到I型膠原蛋白溶液。利用截留相對分子質(zhì)量為SOkD的耐酸型卷式納濾膜設(shè)備分離純化該蛋白質(zhì)溶液，膜分離純化過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，控制膠原蛋白溫度為1_4°C，去除無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液。
[0070]6、將高純I型膠原蛋白溶液裝入反應(yīng)釜中，加入0.03kg木瓜蛋白酶和0.03kg魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶和0.0lkg風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為7，調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為55°C，反應(yīng)3小時，反應(yīng)結(jié)束后升溫到85°C保溫滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液。
[0071]7、利用噴霧干燥機干燥I型膠原抗氧化肽溶液，出風(fēng)溫度為75°C、進風(fēng)溫度為140°C，噴霧干燥結(jié)束，得到I型膠原抗氧化肽粉成品。粉成品的蛋白質(zhì)含量為98%，清除超氧陰離子自由基的活性為86%。
[0072]實施例八:
1、取魚皮80kg投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為4%的氫氧化鈉溶液，攪拌8小時，用水洗凈；再加入體積百分比濃度為I %的鹽酸溶液，攪拌2小時，用水洗凈，脫脂脫灰除掉魚皮雜質(zhì)。將脫脂脫灰后魚皮投入粉碎機中，加入氮氣調(diào)節(jié)溫度，并控制粉碎過程溫度為 1-4。。。
[0073]2、將粉碎后的魚皮置于反應(yīng)釜中，加入400kg的水，加入0.04kg的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為2,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為3V，反應(yīng)12小時，結(jié)束反應(yīng)，得到I型膠原蛋白，提取產(chǎn)率為18%。
[0074]3、利用轉(zhuǎn)速為4000rpm/min的離心機分離上述的I型膠原蛋白溶液，離心溫度控制在1-4°C，除掉顆粒狀雜質(zhì)。
[0075]4、在1-4°C條件下，將所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為16%硫酸銨或氯化鈉溶液。利用轉(zhuǎn)速為4000rpm/min的離心機分離該溶液，離心分離溫度控制在1_4°C，得到I型膠原蛋白沉淀物。
[0076]5、配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，得到I型膠原蛋白溶液。利用截留相對分子質(zhì)量為IOOkD的耐酸型卷式納濾膜設(shè)備分離純化該蛋白質(zhì)溶液，膜分離純化過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，控制膠原蛋白溫度為1_4°C，去除無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液。
[0077]6、將高純I型膠原蛋白溶液裝入反應(yīng)釜中，加入0.32kg胰蛋白酶和0.32kg糜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值并控制反應(yīng)體系pH為8,調(diào)整pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉,所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸，反應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)5小時，反應(yīng)結(jié)束后升溫到85°C保溫滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液。
[0078]7、利用噴霧干燥機干燥I型膠原抗氧化肽溶液，出風(fēng)溫度為70°C、進風(fēng)溫度為140°C，噴霧干燥結(jié)束，得到I型膠原抗氧化肽粉成品。粉成品的蛋白質(zhì)含量為96%，清除超氧陰離子自由基的活性 為65%。
【權(quán)利要求】
1.一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:它包括如下步驟: (1)水產(chǎn)副產(chǎn)品的預(yù)處理 用酸堿預(yù)處理魚皮，除去脂肪、無機鹽和其它雜質(zhì)；除雜后的水產(chǎn)副產(chǎn)物投入粉碎機中粉碎； (2)I型膠原蛋白的提取 將粉碎后的水產(chǎn)副產(chǎn)品置于反應(yīng)釜中，加入水和相當(dāng)于水產(chǎn)副產(chǎn)品投料重量0.0l -0.1%的胃蛋白酶進行酶法提取，反應(yīng)溫度為1-4°C，反應(yīng)pH值控制在1-3，反應(yīng)時間為8-12h，得到I型膠原蛋白粗提物，提取產(chǎn)率高于15% ； (3)I型膠原蛋白的固液分離 利用離心機分離技術(shù)分離I型膠原蛋白粗提物，除掉固體雜質(zhì)； (4)I型膠原蛋白的鹽析 步驟(3)所得清液加入等體積的質(zhì)量百分比濃度為2-20%的無機鹽溶液鹽析；利用離心機分離技術(shù)分離鹽析溶液，得到I型膠原蛋白沉淀物； (5)I型膠原蛋白的脫鹽 配置0.5M的醋酸溶液溶解I型膠原蛋白沉淀物，利用膜分離技術(shù)去除I型膠原蛋白溶液的無機鹽，得到高純I型膠原蛋白溶液； (6)I型膠原抗氧化.肽的制備 將步驟(5)所述的高純I型膠原蛋白溶液置于反應(yīng)釜中，添加相當(dāng)于水產(chǎn)副產(chǎn)品投料重量0.1 - 1%的蛋白酶，進行酶解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為50-55°C，酶解反應(yīng)pH值控制在7_8，反應(yīng)2-6小時，酶解反應(yīng)結(jié)束，升溫到85°C滅酶，得到I型膠原抗氧化肽溶液； (7)I型膠原抗氧化肽的干燥 利用噴霧干燥技術(shù)干燥I型膠原抗氧化肽溶液，得到蛋白質(zhì)含量超過95%的I型膠原抗氧化肽粉成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述步驟(I)中酸堿除雜的具體過程為:將水產(chǎn)副產(chǎn)品投入反應(yīng)釜中，加入質(zhì)量百分比濃度為1-5%的堿溶液攪拌除雜，攪拌后用水洗凈；加入體積百分比濃度為0.5-5%的酸溶液攪拌除雜，脫脂脫灰去除水產(chǎn)副產(chǎn)物的脂肪和無機鹽雜質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(I)預(yù)處理使用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所使用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(I)粉碎溫度為1_4°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(2)及步驟(6)控制反應(yīng)pH值所用的堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所用的酸為硫酸或鹽酸或醋酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(3)和步驟(4)中所用的離心機為轉(zhuǎn)速為1000 — 4500rpm/min,離心溫度為1-4 °C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(4)中利用無機鹽鹽析分離純化，所使用的無機鹽為硫酸銨或氯化鈉，鹽析溫度為1_4°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(5)中膜分離技術(shù)所使用的膜設(shè)備為耐酸型卷式納濾膜設(shè)備，所使用的膜截留平均相對分子質(zhì)量為IkD - lOOkD。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(5)中膜分離技術(shù)除鹽過程中，往膠原蛋白溶液加入0.1M醋酸溶液，并控制膠原蛋白溶液溫度為1-4 °C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(6)中所用的蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶、海產(chǎn)品水解專用蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中的任意兩種或者三種組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種水產(chǎn)副產(chǎn)品源I型膠原抗氧化肽的制備工藝，其特征在于:所述的步驟(7)中噴霧干燥的出風(fēng)溫度為65-85°C、進風(fēng)溫度為140-180°C。
【文檔編號】C12P21/06GK103468772SQ201310386159
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】陳俊德, 易瑞灶, 洪碧紅, 洪專, 李龍, 許諾華, 高然, 鄭美華, 余琳 申請人:國家海洋局第三海洋研究所