一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒。該抗性表達盒含有精簡后的潮霉素抗性基因（SEQ?ID?NO:1所示），以及位于潮霉素抗性基因兩端的dif1和dif2序列。本發(fā)明精簡后的Hyg基因序列由原來的1.7kb縮短至1kb左右，去掉了轉錄終止子，較長的天然啟動子等復雜結構，便于PCR擴增，內部酶切位點更少（常見酶切位點已被定點突變掉），同時，Hyg自帶短的人工啟動子，在大腸桿菌和分枝桿菌中均可表達，定向插入時不影響下游基因的轉錄和翻譯。本發(fā)明的抗性表達盒在精簡后的Hyg基因兩端添加了dif序列，可以在分枝桿菌中自動解離。Hyg基因丟失后，被破壞的基因仍可繼續(xù)表達縮短的小肽，不影響下游基因的翻譯，從而可有效避免極性效應。
【專利說明】一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒及其應用。
【背景技術】
[0002]Mtb是引起結核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結核為最多見。結核病至今仍為重要的傳染病，其診斷，預防和治療研究進展緩慢。這3個方面均涉及到研究Mtb基因的功能，而對Mtb進行遺傳改造在Mtb的研究中起著舉足輕重的作用。結核分枝桿菌生長緩慢，難于對其進行遺傳操作，需要昂貴的帶負壓的3級生物安全實驗室，長時間培養(yǎng)不僅占用空間而且容易污染等等使結核分枝桿菌的研究耗時耗財耗力。以抗Mtb藥物的研發(fā)為例，抗Mtb藥物的研發(fā)昂貴且周期長。近半個世紀以來，直到2012年底剛剛有一種新作用機制的藥物問世，且具有潛在的毒力。目前研究抗Mtb藥物/疫苗最核心的問題之一就是建立有效，快速和廉價的基因工程菌。
[0003]目前在對分枝桿菌進行基因操作的過程中，僅有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因比較有效。因此，進行分枝桿菌突變株的研究時，如果所用菌株具有抗性基因，這會對以后的遺傳操作帶來不便。例如，基因敲除/遺傳互補至少需2種抗性基因；遺傳重組技術(recombineering)也需要2種抗性基因等。同時，在分枝桿菌中，有時需要表達多種抗原蛋白，需要多次遺傳操作，因 此，產生無抗性重組菌株對后續(xù)操作尤為重要。可利用基因敲除技術用抗性基因將靶基因替換，但是基因敲除時還常常用到噬菌體包裝技術。該技術需要將靶基因上游序列+抗性基因+靶基因下游序列(簡稱三片段)一起包裝到噬菌體中，形成噬粒。三片段總長度有一定的限制，如果過長，將不能被包裝到噬菌體，無法獲得用于基因敲除的噬粒。由于包裝有容量有限制，如果抗性基因短小，則可以適當增加靶基因上游序列+靶基因下游序列的長度，甚至可以加入其它元件，因此，有利于適當增加噬菌體包裝的有效DNA片段長度?；蚯贸螅钣行У臋z測方法之一是進行PCR驗證，然而，以往的//漢基因具有的轉錄終止子具有復雜的二級結構使PCR很難進行。有發(fā)明將Zfes等序列加到Hyg兩側，而Res等序列需要人工表達一種外源蛋白來識別并作用后才可將?解離。即實際操作中，先將帶的序列的質粒導入分枝桿菌,等篩選到序列插入基因組后的分枝桿菌，再導入另外一個可以表達解離蛋白的質粒，再經過篩選，可以得到?丟失的分枝桿菌。許多實驗往往還需要繼續(xù)篩選表達解離蛋白的質粒丟失的菌株。因此，非常繁瑣，費時費力。有些類似的系統(tǒng)在分枝桿菌中抗性基因丟失的效率極低。dif序列加到Hyg兩側便于?基因的解離，最近幾年才見報道。其優(yōu)勢在于，不需要人工表達外源蛋白來實現(xiàn)抗性基因的解離，因為分枝桿菌本身就編碼這樣的蛋白，因此，省去了很多不必要的麻煩。而且該系統(tǒng)的效率非常高，兼容性好(例如，慢速生長的結核分枝桿菌的i/i/序列在快速生長的恥垢分枝桿菌中同樣起作用)。然而，在采用i/i/序列體系的研究中，其所用?抗性基因，片段長(1.7kb)，帶有復雜的3’端2級結構，內部有常見的酶切位點，兩端可用酶切位點少，且構建的抗性表達盒不能夠“通用”。[0004]所以，如果能夠構建在分枝桿菌中帶有自動解離功能的更短小、易于遺傳操作的帶有多克隆位點的通用抗性表達盒，且可以不產生極性效應，將會極大簡化多種分枝桿菌的遺傳操作。在進行分枝桿菌遺傳操作時候，因為利用抗性表達盒帶入的抗性基因可自動解離，所以后續(xù)的遺傳操作時將不會受到抗性基因選擇的限制，而且，不帶抗性基因的突變株也使得多種遺傳研究更為可能，將為分枝桿菌的基因工程研究提供強有力的工具。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的一個目的在于提供一種經精簡且自帶人工啟動子的潮霉素抗性基因Hyg0
[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的重組質粒。
[0008]本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種精簡改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒，其含有精簡改造后的潮霉素抗性基因，以及位于潮霉素抗性基因兩端的ΛΥ7和序列，其特征在于，所述精簡改造后的潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，difl和dif2序列分別如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。在此將該抗性表達盒命名為抗性表達
合”
[0010]優(yōu)選的，所述抗性表達盒兩端還添加了多重酶切位點。
[0011]所述抗性表達盒的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示。
[0012]含有以上所述抗性表達盒的重組質粒。優(yōu)選的，所述重組質粒的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0013]一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的重組質粒，其含有:啟動子、噬菌體整合位點、整合酶基因、dif-Ω HYG-?Τ抗性表達盒、復制起始位點。
[0014]按順時針方向，噬菌體整合位點、整合酶基因、dif-Ω HYG-?Τ抗性表達盒依次連
接在一起。
[0015]所述啟動子為LacZ啟動子或BLA啟動子,所述復制起始位點為大腸桿菌復制起點。
[0016]優(yōu)選的，所述重組質粒的的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明精簡后的場叉基因序列由原來的1.7kb縮短至Ikb左右，去掉了轉錄終止子，較長的天然啟動子等復雜結構，便于PCR擴增，內部酶切位點更少(常見酶切位點已被定點突變掉)，同時，Hyg自帶短的人工啟動子,在大腸桿菌和分枝桿菌中均可表達,定向插入時不影響下游基因的轉錄和翻譯。
[0018]( 2 )本發(fā)明的抗性表達盒在精簡后的Hyg基因兩端添加了 dif序列，可以在分枝桿菌中自動解離。?基因丟失后，被破壞的基因仍可繼續(xù)表達縮短的小肽，不影響下游基因的翻譯，從而可有效避免極性效應。[0019](3)本發(fā)明的抗性表達盒兩端還添加了多重酶切位點，使得該表達盒既可以插入到特定序列中，還便于在其兩側定向添加其他序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為質粒pU⑶HmKE的結構示意圖；
圖2為質粒pUCDHmKE酶切位點圖；
圖3為質粒pU⑶HmKE的構建流程圖；
圖4為整合型質粒pMH94DHmKE的結構示意圖；
圖5為整合型質粒pMH94DHmKE的構建流程圖；
圖6為整合質粒pblDHCiGn的結構示意圖；
圖7為質粒pblDHCiGn的構建流程圖；
圖8為dif-Ω HYG-?Τ表達盒與以往在分枝桿菌遺傳操作中常用的含有潮霉素(HYG)抗性基因0--")的片段的比較簡圖(Pl，P2，P3:假定的Hyg啟動子；Pa:假定的場叉人工啟動子，它覆蓋了表達盒中的?/i/V，常用的酶切位點:El，EcoRI (在我們的
dif-Ω WLQ-dif 表達盒中被去除了)，Nt，AfoiI ；Sp,SpeIE5, BcoRY ；M,NdeI ；H,
NindlII ；Χο,Ι?οΙ ；C,ClaI ；Xb,IbaI 各，Smal ；Nc, AfcoI ；P,PstI ；Nh, Me1-,Y,, KpnO ；
圖 9 為存在于 pUCDHmke 質粒中的歷.ζ?(1ΠΙ-ΖΑοΙ-1-歷/?dllI 在 i/i/正鏈(A)
和負鏈(B)中的序列及其對應表達的多肽的分析(它們是表達盒Vl解離后留在基因組中的序列.Spel-Bamm-Eco-N-Eco認\-Nde\-mndl\\-Xho\-dif-Xho\-mnAIll-Ncol-Pstl-Nhel (存在于pblDHCln中)在i/i/負鏈中的序列及其對應表達的多肽的分析(C)，這是Jif-QHYG-Ji/表達盒V2解離后留在基因組中的序列，由三種讀碼框編碼的氨基酸用藍色的大寫字母表示，劃線部分表示在可讀通的讀碼框中的dif序列編碼的氨基酸，星號(*)表示終止子)。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0022]以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術包括PCR擴增、質粒提取、質粒轉化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京:科學出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。
`[0023]以下實施例中PCR反應所用的pfu酶、dNTP以及相關試劑均購買自上海生工生物有限公司；抗生素潮霉素購自羅氏公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5a購買于廣州東盛生物科技有限公司，貨號為C1042 ;DNA連接反應均采用Takara寶生物公司的T4 DNA連接試劑盒，型號:D6020A ;質粒DNA提取試劑盒(BSC01M1)、DNA回收試劑盒(BSC02M1)、PCR純化試劑盒(BSC03M1)購自博日生物公司。
[0024]以下實施例中所用到的PCR引物和DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司負責合成。
[0025]實施例1構建質粒pU⑶HmKE
質粒PU⑶HmKE的結構示意圖見圖1，酶切位點圖見圖2，其含有上述的抗性表達盒。由圖1可見，質粒PUCDHmKE按順時針方向依次含有:大腸桿菌復制起點(pMBl0ri,?Τ-ΩΗΥ6-?Τ抗性表達盒，啟動子P (BLA)(用于啟動氨芐青霉素抗性基因Amp即WaA氨芐青霉素抗性基因辦?/7可用于質粒篩選。
[0026]所述dif- Ω HYG-?Τ抗性表達盒上含有精簡改造后的潮霉素抗性基因Qfyg、,如SEQ ID N0:1所述，該基因上的第24~73bp為啟動子序列(Pr)，用于啟動場?基因的表達。
?基因序列兩端連接的必了序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0027]另外在dif-amG-dif抗性表達盒的兩端分別依次連接歷fldIII酶切位點UXoI酶切位點、油al酶切位點，此3個酶切位點可用來切下質粒上的dif-QmG-dif抗性表達盒。
[0028]質粒pU⑶HmKE的構建流程圖見圖3，本流程中將使用到質粒pNBVl (由美國約翰霍普金斯大學William Bishai實驗室惠贈，質粒圖譜見圖3，具體構建方法見參考文獻I。質粒pNBVl中含有原始潮霉素抗性基因(場叉*)，約長1.7kb。
[0029]具體方法如下:
1.質粒pUCDis的構建
用限制性內切酶治7/?1和歷‘/ III消化質粒pUC19 (商品質粒)，純化回收試劑盒回收
2.6kb的片段；
合成DNA片段?/i/V和dif2 (如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示，由上海捷瑞生物工程有限公司負責合成)，合成的?/i/V兩端帶有III和油<31酶切位點，i/i/J?兩端帶有油<31和命/?1酶切位點，所以，將difl和dif2以及純化回收后的質粒pUC19 (Kpnl和Hindlll雙酶切)進行三片段連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，利用含氨芐青霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質粒，酶切鑒定出正確的克隆即為質粒PU⑶is。
[0030]2.質粒 pUCDHmKE 的構建
擴增片段場叉:本步驟以質粒PNBVl為模板，用引物Hygf2 (5’ -TGTCTAGACCGGCCGTGCGGAATTAA-3，)(SEQ ID NO: 9)和 Hygr727(5，-ATTCTAGATCAGGCGCCGGGGGCGGTGTC-3’)(SEQ ID NO: 10)進行擴增。這對引物可從質粒pNBVl中擴增出約1.1kb的射片段，比原來的1.7kb明顯精簡了，且精簡后的?基因依然可以表達并行使抗性基因的作用，其效率與原始質粒中H-基因表達抗性的效率相當。
[0031]擴增所得片段的兩端帶有酶切位點，將擴增獲得的片段用消化，獲得 ?片段切)，大小約為1.lkb。
[0032]將上一步中構建的質粒pU⑶is用ZhI消化，將以上酶切產物進行純化回收4.0kb片段，即為pUCDI片段C?al切)。
[0033]將pUCDI片段C?al切)和Hyg片段C?al切)進行連接反應，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，利用含潮霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質粒，酶切鑒定出正確的克隆即為質粒PUCDH。將此質粒中的位點和
位點進行突變，去除掉這2個酶切位點，即得質粒pU⑶HmKE，其序列如SEQ ID NO: 2所示，其第426bp~1553bp為長1128bp的dif- Ω HYG-?Τ抗性表達盒，抗性表達盒兩端為HindIII酶切位點aagctt和ZAoI酶切位點ctcgag。dif- Ω WYG-dif抗性表達盒中所含有的場?片段如SEQ ID N0:1所示。該?片段去掉了轉錄終止子，較長的天然啟動子等復雜結構，便于PCR擴增，內部酶切位點更少(常見酶切位點已被定點突變掉)，同時，場Y自帶短的人工啟動子，在大腸桿菌和分枝桿菌中均可表達，定向插入時不影響下游基因的轉錄和翻譯。
[0034]實施例2整合型質粒pMH94DHmKE的構建及應用
整合型質粒pMH94DHmKE的結構示意圖見圖4，質粒pMH94DHmKE按順時針方向依次含有=LacZ啟動子(可用于藍白斑篩選，以及啟動后面整個質粒骨架的表達)、噬菌體整合位點a?W、整合酶基因(可表達出整合酶，使質粒通過aii/M立點整合入分枝桿菌基因組)，dif- Ω YiYG-dif抗性表達盒,大腸桿菌復制起點(orii?)，氨節(jié)青霉素抗性基因辦?/?(用于質粒篩選)。dif-QmG-dif抗性表達盒兩端分別依次連接VifldIII酶切位點、通ol酶切位點，可用于切下質粒上的?///-ΩΗΥ6-ο?/抗性表達盒。
[0035]整合型質粒pMH94DHmKE的構建流程見圖5，本構建流程中所用到的質粒pMH94由由美國約翰霍普金斯大學William Bishai實驗室惠贈，質粒圖譜見圖5，具體構建方法見參考文獻2。
[0036]具體操作如下:
1.將質粒PMH94與實施例1構建的質粒pUCDHmKE用HindiII消化，回收pMH94消化所得的大小約為6.0 kb的片段、pUCDHmKE消化所得的大小約為1.1 kb的片段，將兩個片段進行連接反應后，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，利用含潮霉素抗性的LB固體平板篩選出陽性克隆，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質粒，酶切鑒定出正確的克隆即為質粒 pMH94DHmKE。
[0037]2.將質粒pMH94DHmKE通過電轉化的方法將其分別轉入結核分枝桿菌(H37Rv結核標準菌株，由廣州市胸科醫(yī)院惠贈)和恥垢分枝桿菌(ATCC 700044)，獲得相應的轉化株。
[0038]將所得轉化株于37°C孵箱中孵育12小時，充分復活細菌并使其抗性表達。用帶濾芯的槍尖吹吸混勻后，分裝至小管中，10000 rpm離心I分鐘沉淀轉化菌，棄上清，用0.6 mL7H9培養(yǎng)基重懸后，以500 μ?/板鋪于7Η11含相應抗生素(150 μ g/mL HYG)培養(yǎng)板中。同時稀釋一百倍后，500 KL/板鋪板。避光于37度孵箱培養(yǎng)。
[0039]在含有潮霉素(HYG)的平板上可獲得含有pMH94DHmKE質粒的結核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌，此步證明了本發(fā)明的dif- Ω HYG-ο?/抗性表達盒可成功在分枝桿菌中表達。
[0040]將獲得的帶有pMH94DHmKE質粒的結核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌轉化株進行液體傳代培養(yǎng)，在培養(yǎng)3天后(對于恥垢分枝桿菌)或14天后(對于結核分枝桿菌)，將培養(yǎng)的菌液進行稀釋后鋪平板，所得的平板上約有80%的菌落丟失了 Hyg抗性，即無法在含有潮霉素(HYG)的平板上生長,此步證明了本專利中的ο?/-ΩΗΥ6-ο?/抗性表達盒可成功在分枝桿菌中自動解離，且有較高的效率。
[0041]實施例3整合質粒pblDHCiGn的構建及其應用
整合質粒pblDHCiGn中，抗性表達盒以兩側帶有雙酶切位點的形式存在，此質粒的構建是為了證明在此種形式下，抗性表達盒依然有效。質粒結構見圖6，按順時針方向，其依次含有:啟動子P(BLA)(用于啟動后面辦的表達)、氨芐青霉素抗性基因辦 (可用于質粒篩選)、大腸桿菌復制起點、噬菌體整合位、整合酶基因Int (可表達出整合酶，使質粒通過ai#位點整合入分枝桿菌基因組)、dif-Ω HYG-?Τ抗性表達盒、增強的綠色熒光蛋白基因effP。dif-QmG-dif抗性表達盒兩端連接不同的酶切位點。[0042]質粒pblDHCiGn的構建流程見圖7，該流程中所用到的質粒pblueINT由美國約翰霍普金斯大學，Eric Nuermberger教授惠贈,其質粒圖譜見圖7,具體構建方法見參考文獻3，序列如SEQ ID NO:3所示。
[0043]具體構建步驟如下:
1.構建質粒pblDHCln:用限制性內切酶治7/?1和feMlI消化質粒pblueINT，回收2.9kb 的功能片段 A ；以質粒 pUCDHmKE 為模板，用引物 Hygcf (5’-GCTGGTACCGCTAGCGCTGCAGCCATGGCAAGCTTCTCGAGTAAG-3’)(SEQ ID NO:11)和Hygcr (5’-GCAGGATCCGATATCGAATTCCATATGCCCAAGCTTCTCGAGACT-3’ ) (SEQ ID NO: 12)擴增出 1.2 kb 的 ?/i/-Ω HYG-1/i/ 片段(兩端分別帶有治奶1和酶切位點)，再經過酶切后，與功能片段A進行連接，得到4.1kb的質粒 pblDHCln。
[0044]2.構建質粒pblDHCGn:用限制性內切酶AfcoI和命/?1消化質粒pblDHCln，回收4.1kb的功能片段B ;以質粒pEGFP-Nl (商品質粒)為模板，用引物GYF_f(5，-GGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，)(SEQ ID NO:13)和 GYF-r(5，_ GCGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’)(SEQ ID NO: 14)擴增出 734 bp 的片段，經過酶切后，與功能片段B進行連接，得到質粒pblDHCGn。
[0045]3.構建質粒pblDHCiGn:用限制性內切酶SpeI和EcoRI消化質粒pblDHCGn，回收4.7kb的功能片段C ;用限制性內切酶尬a I和&0RI消化質粒pblueINT，回收2.1kb的
片段，與功能片段C進行連接，得到質粒pblDHCiGn，其序列如SEQ ID NO:4所示。
[0046]將構建得到的質粒pblDHCiGn通過電轉化的方法轉化入結核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌中，獲得相應的轉化子，轉化子可以觀察到eGFP的表達。由此證明了在dif-QmQ-dif抗性表達盒兩端添加了雙酶切位點后，Hyg的啟動子不僅可以啟動場?抗性基因的表達，而且可以實現(xiàn)啟動?抗性基因下游Λ./序列+酶切位點及其后面的基因的表達，此處綠色熒光蛋作為指示標記。
[0047]下一步，將獲得的帶有pblDHCiGn質粒的結核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌轉化株進行液體傳代培養(yǎng)，在培養(yǎng)3天后(對于恥垢分枝桿菌)或14天后(對于結核分枝桿菌)，將培養(yǎng)的菌液進行稀釋后鋪平板，所得的平板上約有80%的菌落丟失了 HYG抗性，即無法在含有潮霉素(HYG)的平板上生長，由此再次證明了本發(fā)明的Jif-QHYG-Ji/抗性表達盒可成功在分枝桿菌中自動解離，且有較高的效率。而且，丟失了 HYG抗性的轉化子依然可以觀察到綠色熒光，此設計說明了抗性表達盒的自動解離不會對其插入后下游基因的表達產生影響，即本發(fā)明所設計的抗性表達盒無論存在與否均不影響下游基因的表達。
[0048]參考文獻:
[1]Howard NS, Gomez JE, Ko C，Bishai WR.Color selection with ahygromycin-resistance-based escherichia col1-mycobacterial shuttle vector.Gene 1995;166:181-182.[2]Lee MH, Pascopella L, Jacobs WR, Jr., Hatfull GF.Site-specificintegration of mycobacteriophage 15:1ntegration-proficient vectorsfor mycobacterium smegmatis, mycobacterium tuberculosis, and bacillecalmette-guerin.Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:3111-3115.[3]Zhang T, Li SY, Nuermberger EL.Autoluminescent Mycobacteriumtuberculosis for Rapid, Real-Time, Non-1nvasive Assessment of Drug and Vaccine
Efficacy.PLoS ONE.(2012)，7(1): e29774。
【權利要求】
1.一種精簡改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的抗性表達盒，含有精簡后的潮霉素抗性基因，以及位于潮霉素抗性基因兩端的ΛΥ7和序列，其特征在于，所述精簡后的潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，?/i/V和序列分別如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8 所示。
3.根據權利要求2所述的抗性表達盒，其特征在于，所述表達盒兩段還添加了多重酶切位點。
4.根據權利要求3所述的抗性表達盒，其特征在于，所述抗性表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6 所示。
5.含有權利要求2-4任一項所述抗性表達盒的重組質粒。
6.根據權利要求5所述的重組質粒，其特征在于，所述質粒的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
7.一種用于高效構建無抗性標記重組分枝桿菌的重組質粒，其含有:啟動子、噬菌體整合位點、整合酶基 因、權利要求2-4任一項所述的抗性表達盒、復制起始位點。
8.根據權利要求7所述的重組質粒，其特征在于，按順時針方向，依次含有噬菌體整合位點、整合酶基因、權利要求2-5任一項所述的抗性表達盒。
9.根據權利要求7或8所述的重組質粒，其特征在于，所述啟動子為LacZ啟動子或BLA啟動子，所述復制起始位點為大腸桿菌復制起點。
10.根據權利要求7或8所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的的核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 所示。
【文檔編號】C12N15/11GK103451181SQ201310386264
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權日:2013年6月6日
【發(fā)明者】張?zhí)煊? 楊峰, 鄒文英 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院