多片段dna的酵母快速組裝方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多片段DNA的酵母快速組裝方法，包括以下步驟：（1）將多個含有同源臂的DNA分子與線性化的酵母穿梭載體共轉(zhuǎn)化酵母；（2）將整個篩選培養(yǎng)板上的全部轉(zhuǎn)化后的酵母菌落洗脫下來，離心，棄上清，得到轉(zhuǎn)化后的酵母菌細胞；（3）提取步驟（2）獲得的酵母菌細胞的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞；（4）篩選大腸桿菌克隆，得到大片段DNA。本發(fā)明的方法組裝大片段DNA分子的速度快、簡便可行、成功率高、成本低，效率高、易操作，可將多個小片段DNA分子組裝成一個大片段DNA分子，有利于進行工業(yè)化規(guī)模擴大，用途廣泛。
【專利說明】多片段DNA的酵母快速組裝方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及合成生物學(xué)領(lǐng)域，基因組合成技術(shù)，代謝工程領(lǐng)域，具體地是涉及多片 段DNA的酵母快速組裝方法及該方法合成的大片段DNA及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 合成大片段DNA分子的技術(shù)意義重大，一方面可以用于合成基因組的結(jié)構(gòu)單元， 另一方面可以用于組裝對人類有重大生產(chǎn)應(yīng)用價值的代謝通路。
[0003] 如今的生物學(xué)發(fā)展已經(jīng)逐步進入全基因組合成時代，合成基因組學(xué)對于人們認識 生命，改造生命更好的為人類社會服務(wù)有著重大意義。基因組合成是合成底盤細胞的重要 方面，在設(shè)計方面：人工設(shè)計作為底盤生物必需的生長功能基因和表達功能基因及其堿基 編碼方式、這些基因最優(yōu)化合理的連接方式和基因間調(diào)控；在合成方面：發(fā)展DNA大片段和 染色體的高保真合成和組裝技術(shù)，合成并組裝基因組。2008年，J. Craig Venter小組又化學(xué) 合成了生殖道支原體（Mycoplasma genitalium)的基因組，長度約580Kb ;2010年，J. Craig Venter小組將人工設(shè)計、合成、組裝好的絲狀支原體（Mycoplasma mycoides)移植入受體細 胞中，一段時間后，該移植細胞完全由合成的基因組控制；2011年Jef Boeke小組成功合成 并導(dǎo)入了釀酒酵母9號染色體的右臂，合成基因組學(xué)開始進入真核細胞領(lǐng)域。
[0004] 天然化合物是來源于生物體內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物，很多具有重要的生理活性及醫(yī) 療保健作用，也是許多臨床藥物的源頭。如二萜類化合物紫杉醇是著名的抗癌藥；倍半萜 類化合物青蒿素為當今最有效的抗瘧藥；丹參酮則是主要的心血管類中藥。天然化合物 需求巨大，傳統(tǒng)生產(chǎn)方法這些傳統(tǒng)方法工藝流程復(fù)雜、能耗高、污染大，而且對野生植物資 源造成嚴重破壞。如今使用合成生物學(xué)的方法構(gòu)建組裝完整的天然化合物代謝途徑在酵 母菌或大腸桿菌等微生物中可以更為高效地合成這些天然化合物。加州大學(xué)伯克利分校 的Jay Keasling小組以大腸桿菌和酵母菌為宿主高效的生產(chǎn)青蒿素；MIT大學(xué)的Gregory Stephanopoulos小組在大腸桿菌中生產(chǎn)紫杉醇前體物紫衫二烯已經(jīng)達到lg/L。全合成天 然化合物微生物代謝通路已成為世界熱點領(lǐng)域。
[0005] 對于DNA全合成技術(shù)，首先是通過PCR反應(yīng)合成的，其長度往往小于lkb。當前，要 將多個Ikb的小片段組裝一個大片段DNA分子最常用的組裝DNA技術(shù)是通過重疊延伸PCR 技術(shù)來將小片段DNA分子融合為大片段DNA分子，效率受到DNA聚合酶的擴增能力和保真 性以及序列的二級結(jié)構(gòu)。雖然已經(jīng)有能夠擴增較長片段的高保真DNA聚合酶(例如Phusion DNA聚合酶)，但是當DNA大小超過6kb時反應(yīng)已經(jīng)變得很困難。傳統(tǒng)的克隆技術(shù)主要是 通過用內(nèi)切酶消化得到含有互補粘性末端的兩種DNA，并用DNA連接酶將這兩種DNA分子 拼接為一個DNA分子，這種方法每次只能組裝兩種DNA分子，如果要將多個DNA分子組裝 在一起就要做好多輪亞克隆，時間周期很長，而且反復(fù)的酶切連接反應(yīng)會增加合成的成本。 酵母細胞內(nèi)部的同源重組機制已經(jīng)得到廣泛的研究，已被廣泛用于構(gòu)建酵母人工合成染色 體（YACs)。一些研究表明酵母細胞可以攝入多個DNA片段，可裝配四或者五個重疊的DNA 片段連接到載體 DNA 上（Raymond，C.K.et.al. Biotechniques (1999) 26:134 - 138)。但是 現(xiàn)有的酵母重組技術(shù)都要逐個挑取酵母單菌落培養(yǎng)篩選，線性化酵母載體要經(jīng)過PCR獲得 (Gibson, D G. et. al. Science (2008) 5867:1215 - 1220)，整體時間會相應(yīng)的延長，保真度會 下降，操作的復(fù)雜性和工作量都會增加。因此如何能夠低成本，快速高通量篩選正確克隆成 為酵母組裝大片段DNA分子方法的關(guān)鍵技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供多片段DNA的酵母快速組裝方法。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供多片段DNA的酵母快速組裝方法組裝的大片段DNA。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是提供多片段DNA的酵母快速組裝方法組裝的大片段DNA的 用途。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0010] 一種多片段DNA的酵母快速組裝方法，包括以下步驟：
[0011] (1)將多個含有同源臂的DNA分子與線性化的酵母穿梭載體共轉(zhuǎn)化酵母；
[0012] (2)將整個篩選培養(yǎng)板上的全部轉(zhuǎn)化后的酵母菌落洗脫下來，離心，棄上清，得到 轉(zhuǎn)化后的酵母菌細胞；
[0013] (3)提取步驟（2)獲得的酵母菌細胞的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞；
[0014] (4)篩選大腸桿菌克隆，得到大片段DNA。
[0015] 所述含有同源臂的DNA分子的同源臂至少是40個堿基的特異性同源臂。
[0016] 所述線性化的酵母穿梭載體優(yōu)先的是使用內(nèi)切酶對酵母穿梭載體進行單酶切后 獲得。
[0017] 所述酵母穿梭載體優(yōu)選為PRS416或pRS413。
[0018] 上述多片段DNA的酵母快速組裝方法組裝的大片段DNA。
[0019] 上述多片段DNA的酵母快速組裝方法組裝的大片段DNA的用途。
[0020] 所述用途為組裝合成基因組結(jié)構(gòu)單元。
[0021] 所述用途為生產(chǎn)β -胡蘿卜素。
[0022] 所述用途為生產(chǎn)紫色桿菌素。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0024] 本發(fā)明的方法組裝大片段DNA分子的速度快、簡便可行、成功率高、成本低，效率 高、易操作，可將多個小片段DNA分子組裝成一個大片段DNA分子，有利于進行工業(yè)化規(guī)模 擴大，用途廣泛。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明的一種多片段DNA的酵母快速組裝方法及應(yīng)用合成流程示意圖。
[0026] 圖2是本發(fā)明實施例1酵母組裝Κ4 - 4的示意圖。
[0027] 圖3是本發(fā)明實施例1酵母組裝Κ4 -4PCR得到五個DNA片段瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0028] 圖4是本發(fā)明實施例1酵母組裝Κ4 - 4轉(zhuǎn)化大腸桿菌藍白斑篩選。
[0029] 圖5是本發(fā)明實施例1酵母組裝Κ4 - 4菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0030] 圖6是本發(fā)明實施例1酵母組裝Κ4 - 4質(zhì)粒DNA酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0031] 圖7是本發(fā)明實施例1酵母組裝Κ4 - 4合成基因組結(jié)構(gòu)功能圖。
[0032] 圖8是本發(fā)明實施例1合成大片段替換酵母基因組后在SC -LEU篩選培養(yǎng)板生長 圖。
[0033] 圖9是本發(fā)明實施例1合成基因組PCR驗證瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0034] 圖10是本發(fā)明實施例2合成紫色桿菌素代謝通路PCR得到6種小分子DNA瓊脂 糖凝膠電泳圖。
[0035] 圖11是本發(fā)明實施例2合成紫色桿菌素代謝通路結(jié)構(gòu)圖以及菌落顏色對比圖。
[0036] 圖12是本發(fā)明實施例2合成紫色桿菌素代謝通路酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0037] 圖13是本發(fā)明實施例2合成紫色桿菌素代謝通路發(fā)酵產(chǎn)物檢測圖。
[0038] 圖14是本發(fā)明實施例3合成β -胡蘿卜素代謝通路PCR得到7種小分子DNA瓊 脂糖凝膠電泳圖。
[0039] 圖15是本發(fā)明實施例3合成β -胡蘿卜素代謝通路結(jié)構(gòu)圖以及菌落顏色對比圖。
[0040] 圖16是本發(fā)明實施例3合成β -胡蘿卜素代謝通路酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0041] 圖17是本發(fā)明實施例3合成β -胡蘿卜素代謝通路發(fā)酵產(chǎn)物檢測圖。

【具體實施方式】
[0042] 下面通過具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0043] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些實施例只是用于說明，而不限于本發(fā)明的范圍。 在不背離權(quán)利要求書的范圍的條件下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明的各個方面進行各 種修改和改進，這些修改和改進也屬于本發(fā)明的保護范圍。另外除非特別指明，下面實施 例中所用的各種材料和試劑都是本領(lǐng)域中常用的材料和試劑，可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑獲 得；
[0044] 實施例1 :一種多片段DNA的酵母快速組裝方法，包括以下步驟：
[0045] (1)將多個含有同源臂的DNA分子與線性化的酵母穿梭載體共轉(zhuǎn)化酵母：
[0046] ①以SEQ ID NO. 1所示的K410F為上游引物，SEQ ID NO. 2所示的K410R為下游引 物，以SEQ ID NO. 3所示的pEasy - K410為模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶進行PCR 獲得DNA分子片段K410;以SEQ ID NO. 4所示的K411F為上游引物，SEQ ID NO. 5所示的 K41 IR為下游引物，以SEQ ID NO. 6所示的pEasy - K411為模板，使用Phusion高保真DNA 聚合酶進行PCR獲得DNA分子片段K411;以SEQ ID NO. 7所示的K412F為上游引物，SEQ ID NO. 8所示的K412R為下游引物，以SEQ ID NO. 9所示的pEasy -K412為模板，使用Phusion 高保真DNA聚合酶進行PCR獲得DNA分子片段K412 ;以SEQ ID NO. 10所示的K413F為上 游引物，SEQ ID NO. 11所示的K413R為下游引物，以SEQ ID NO. 12所示的pEasy - K413為 模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶進行PCR獲得DNA分子片段K413 ;以SEQ ID NO. 13 所示的K414F為上游引物，SEQ ID NO. 14所示的K414R為下游引物，以SEQ ID NO. 15所示 的pEasy -K414為模板，使用Phusion高保真DNA聚合酶進行PCR獲得DNA分子片段K414 ; 所述上下游引物均金唯智公司合成，質(zhì)粒模板也由金唯智公司全合成。
[0047] K410的上游引物K410F含有與酵母穿梭載體pRS413上EcoRI位點上游40bp同源 的序列413F，K414的下游引物K414R含有與酵母穿梭載體pRS413上EcoRI位點下游40bp 同源的序列 413R ;413F 由 SEQ ID NO. 16 所示，413R 由 SEQ ID NO. 17 所示。
[0048] 使用 50ul 的PCR反應(yīng)體系：ddH2028. 5ul, 5XPCR緩沖液 10μ 1，2· 5mM dNTPs5y 1， M13F 上游引物（10μΜ)2· 5μ 1，M13R 下游引物（10μΜ)2· 5μ l，Phusion DNA 聚合酶 0· 5μ 1， 模板 DNAlul。PCR 反應(yīng)條件：98°C預(yù)變性 Imin ;98°C變性 15s ;51°C?66°C退火 15s ;72°C 延伸30s ;30個循環(huán)；72°C延伸5min，4°C保存。跑膠檢驗條帶大小，見圖3。
[0049] ②使用EcoRI對pRS413進行線性化。50ul的反應(yīng)體系如下：pRS413質(zhì)粒DNAlug， IOX cutsmart Buffer5ul, ddH20 補足到 49ul，NEB EcoRI 內(nèi)切酶 lul。37°C反應(yīng) 1 小時， 80°C熱失活5分鐘，4°C保存。
[0050] ③取步驟①獲得5種DNA片段K410, K411，K412, K413和K414各5ul與步驟②獲 得的片段IOul混合，DNA組裝結(jié)構(gòu)如圖2所示，共同進行釀酒酵母BY4741轉(zhuǎn)化：實驗證明， 釀酒酵母不限于這一種。
[0051] 釀酒酵母轉(zhuǎn)化步驟：
[0052] 挑單菌落，30°C過夜培養(yǎng)；
[0053] 接種 6. 250D600 的過夜培養(yǎng)液到 50ml YPD 中（0· 1250D600/ml)。置 30°C、200r/ min培養(yǎng)，至0D600達到0. 5 (大約需要4 - 5hrs);
[0054] 5000rpm離心2min，收集細胞；用IOml無菌水重懸并清洗細胞，同上離心，收集細 胞；用IOmlO. IM LiOAc重懸細胞，同上離心，收集細胞；將上清倒出，剩余的LiOAc重懸細 胞，并轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管內(nèi)，置于冰上,得到感受態(tài)細胞。
[0055] 準備轉(zhuǎn)化體系：
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 一種多片段DNA的酵母快速組裝方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 將多個含有同源臂的DNA分子與線性化的酵母穿梭載體共轉(zhuǎn)化酵母； (2) 將整個篩選培養(yǎng)板上的全部轉(zhuǎn)化后的酵母菌落洗脫下來，離心，棄上清，得到轉(zhuǎn)化 后的酵母菌細胞； (3) 提取步驟（2)獲得的酵母菌細胞的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞； (4) 篩選大腸桿菌克隆，得到大片段DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多片段DNA的酵母快速組裝方法，其特征在于所述含有 同源臂的DNA分子的同源臂至少是40個堿基的特異性同源臂。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多片段DNA的酵母快速組裝方法，其特征在于所述線性 化的酵母穿梭載體是使用內(nèi)切酶對酵母穿梭載體進行單酶切后獲得。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種多片段DNA的酵母快速組裝方法，其特征在于所述 酵母穿梭載體為PRS416或pRS413。
5. 權(quán)利要求1 - 4之一的一種多片段DNA的酵母快速組裝方法組裝的大片段DNA。
6. 權(quán)利要求5的大片段DNA的用途。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征是所述用途為組裝合成基因組結(jié)構(gòu)單元。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征是所述用途為生產(chǎn)0 -胡蘿卜素。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征是所述用途為生產(chǎn)紫色桿菌素。
【文檔編號】C12N15/10GK104419701SQ201310389392
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】元英進, 賈斌, 林秋卉, 張文倩, 張金來, 李炳志, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:天津大學(xué)