玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供玉米漿酶解液代替玉米漿，用于微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)，以滿足市場的需要。采用植酸酶和酸性蛋白酶對玉米漿進行酶解后離心得到的酶解液代替玉米漿作為培養(yǎng)基，有效降低了染菌風(fēng)險，酶解液中無機磷/總磷含量為75-90%，微生物生物利用度提高，降低生產(chǎn)成本，且在微生物油脂發(fā)酵中，有利于不飽和脂肪酸快速積累，縮短發(fā)酵周期，降低微生物發(fā)酵成本。
【專利說明】玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物油脂發(fā)酵領(lǐng)域，具體的說涉及玉米漿經(jīng)酶解處理后的產(chǎn)物作為培養(yǎng)基，用于微生物油脂發(fā)酵。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米漿是制備玉米淀粉的副產(chǎn)物，玉米粒先用亞硫酸浸泡，浸泡液經(jīng)加熱蒸發(fā)濃縮所制得的黃褐色液體，玉米漿中含有可溶性蛋白、生長素和一些前體物質(zhì)，含大約40-50%的固體物質(zhì)。玉米漿是微生物生長很普遍應(yīng)用的有機氮源，由于其含有豐富的有機氮和微量元素，因此廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，它還能促進青霉素等抗生素的生物合成。由于玉米漿中大部分的氨基酸以大分子的蛋白形式存在，不利于微生物對其的利用。為了保證微生物發(fā)酵正常進行，需要應(yīng)用較大比例的玉米漿，隨著玉米漿的應(yīng)用量加大，發(fā)酵過程中大分子的蛋白以及其他膠體類物質(zhì)產(chǎn)生較多泡沫，發(fā)酵罐的有效利用率下降，另外玉米漿中不溶性顆粒和部分不易高溫殺滅的微生物芽孢增多，發(fā)酵染菌的風(fēng)險加大。
[0003]微生物油脂(microbial oils)又稱單細胞油脂(single cell oil, SCO),是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂為碳源、氮源、輔以無機鹽生產(chǎn)的油脂。微生物油脂中含有某些特定的不飽和脂肪酸，如ARA、DHA, EPA、亞油酸、角鯊烯等，現(xiàn)在用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的微生物主要為藻類、細菌和真菌，由于細菌產(chǎn)量低，所以目前主要集中在藻類和真菌。不飽和脂肪酸可以保持細胞膜的相對流動性，以保證細胞的正常生理功能。且使膽固醇酯化，降低血中膽固醇和甘油三酯。不飽和脂肪酸是合成人體內(nèi)前列腺素和凝血惡烷的前體物質(zhì)。能降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)?？梢蕴岣吣X細胞的活性，增強記憶力和思維能力。
[0004]不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)對人類健康的重要作用已愈來愈受到人們的重視。隨著微`生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)日益成熟，開發(fā)價格低廉、營養(yǎng)豐富的發(fā)酵原料是市場的需要。本發(fā)明旨在提高玉米漿的生物利用度，縮短發(fā)酵周期，降低微生物發(fā)酵成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供玉米漿酶解液代替玉米漿，用于微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)，以滿足市場的需要，且采用玉米漿酶解液代替玉米漿作為培養(yǎng)基，有效降低了染菌風(fēng)險，酶解液中無機磷/總磷含量為75-90%，微生物生物利用度提高，降低生產(chǎn)成本，且在微生物油脂發(fā)酵中，有利于不飽和脂肪酸快速積累，縮短發(fā)酵周期，降低微生物發(fā)酵成本。
[0006]本發(fā)明提供的玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法，其步驟如下:取玉米漿稀釋后，調(diào)節(jié)PH至3.0-5.0,加入一定量的植酸酶和酸性蛋白酶進行水解，水解16h-20h后，加熱使酶滅活，冷卻后離心分離得到酶解液用于微生物油脂發(fā)酵。
[0007]玉米漿的濃度過高或過低，都會影響酶解率，所述的取玉米漿稀釋后為固含量為40-50%的玉米漿，加水稀釋到15%-20%固含量；玉米漿的大分子物質(zhì)在酸性條件下，酶解更測底，所述的調(diào)節(jié)PH至3.0-5.0為0.2NHCL調(diào)稀釋液PH至3.0-5.0。
[0008]水解時需要酸或堿作為催化劑，有時也用生物活性酶作為催化劑，本發(fā)明用植酸酶和酸性蛋白酶作為催化劑，所述加入一定量為植酸酶量占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為0.03%-0.035% ；酸性蛋白酶占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為1.5%-1.8%。
[0009]酶解溫度是影響玉米漿水解的一個重要因素，溫度過低，水解率變低，溫度過高，副反應(yīng)比例明顯升高，所述的水解16h-20h為酶解溫度控制升溫至48°C，攪拌速度為200r/min-220r/min,水解 16h_20h ；
所述的使酶滅活為酶解后升溫至85-90 V, 20min-25min,酶失活后酶解液降溫至200C，加熱離心，轉(zhuǎn)速為4500rpm，15min-20min,取上清液用作微生物油脂發(fā)酵的培養(yǎng)基。
[0010]微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)通常采用裂壺藻(Schizochytrium sp.)、吾肯氏壺藻(Ulkenia amoeboida)、寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)、高山被抱酶(Mortierellaalpina)等微生物發(fā)酵培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基可含有適當(dāng)?shù)奶荚础⒌?、無機鹽和維生素。所述的培養(yǎng)基是以葡萄糖或甘油或果糖為碳源，以酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、谷氨酸、玉米漿、大豆蛋白中一種或混合物為氮源。無機鹽為氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鉀、磷酸二氫鉀。維生素為維生素B1、維生素B6、維生素B12 —種或多種。
[0011]本發(fā)明玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法的優(yōu)點在于:以玉米漿酶解液代替玉米漿作為培養(yǎng) 基，有效降低了染菌風(fēng)險，酶解液中無機磷/總磷含量為75-90%，微生物生物利用度提高，降低生產(chǎn)成本，且在微生物油脂發(fā)酵中，有利于不飽和脂肪酸快速積累，縮短發(fā)酵周期，降低微生物發(fā)酵成本。
[0012]玉米漿被酶解后,所得的酶解液的營養(yǎng)價值比酶解前大大提高,玉米漿大部分蛋白質(zhì)水解為小分子氨基酸，淀粉會水解成麥芽糖、葡萄糖等，微生物生物利用度大大提高，且酶解后，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌更徹底，且泡沫減少，提高發(fā)酵罐罐容有效利用率。玉米漿酶解時PH值為3.0-5.0,強酸性的環(huán)境可保證無雜菌及芽孢滋生，可避免玉米漿滅菌不徹底導(dǎo)致的染菌風(fēng)險，為實現(xiàn)本發(fā)明目的。
【具體實施方式】
[0013]實施例一:
玉米漿酶解液的準(zhǔn)備:
取固含量為48%的玉米漿5000g，加水稀釋到19%固含量，用0.2N鹽酸調(diào)節(jié)PH至3.8。在稀釋液中分別加入植酸酶和酸性蛋白酶，所述植酸酶量占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為0.032%，所述酸性蛋白酶占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為1.8%。保持酶解溫度為480C _50°C，攪拌速度為200r/min，時間為18h。酶解后升溫至90°C，時間25min，進行滅酶。滅酶反應(yīng)后降溫至20°C，進行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為4500rpm，離心時間15min，取上清液備用。
[0014]培養(yǎng)基配方(g/100ml):
氯化鈉1.24g，氯化鉀0.07g,氯化鈣0.035g,
硫酸鎂0.7g，磷酸二氫鉀0.2g，谷氨酸鈉4.2g,
玉米漿或玉米漿酶解液3.5g，葡萄糖7.5g，維生素B1 0.003g維生素B60.005g,
加水至所需體積，PH自然。
[0015]用上述配方進行對比實驗，采用裂壺藻(Schizochytrium sp.)斜面菌種進行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，玉米漿組IOOh時測定發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?.16g/100ml，得到總油為3.2g/100ml, DHA含量為37.05%,玉米漿酶解液組78h時測定發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?.25g/100ml,得到總油為3.lg/100ml, DHA含量為37.5%。實驗數(shù)據(jù)顯示，玉米漿酶解液組較玉米漿組縮短發(fā)酵時間22h，總油和DHA含量相當(dāng)。測得該酶解液中無機磷/總磷為89%。
[0016]實施例二:
玉米漿酶解液的準(zhǔn)備:
取固含量為47.5%的玉米漿5000g，加水稀釋到20%固含量，用0.2N鹽酸調(diào)節(jié)PH至
3.7。在稀釋液中分別加入植酸酶和酸性蛋白酶，所述植酸酶量占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為0.03%,所述酸性蛋白酶占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為1.6%。保持酶解溫度為50°C，攪拌速度為200r/min，時間為18h。酶解后升溫至90°C，時間20min，進行滅酶。滅酶反應(yīng)后降溫至20°C，進行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為4500rpm，離心時間15min，取上清液備用。
[0017]培養(yǎng)基配方(g/100ml):
氯化鈉1.35g，氯化鉀0.065g,氯化鈣0.04g,
硫酸鎂0.7g，磷酸二氫鉀0.3`g，谷氨酸鈉4.3g,
玉米漿或玉米漿酶解液4.0g,葡萄糖8.0g,維生素B1 0.005g 維生素B60.006g,
加水至100ml。
[0018]采用吾肯氏壺藻(Ulkenia amoeboida)斜面菌種進行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，得到海藻細胞。玉米漿組96h時測定發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?.18g/100ml，得到總油為3.5g/100ml, DHA含量為38.05%，玉米漿酶解液組76h時測定發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?.15g/100ml，得到總油為3.7g/100ml，DHA含量為37.9%。實驗數(shù)據(jù)顯示，玉米漿酶解液組較玉米漿組縮短發(fā)酵時間20h，總油和DHA含量相當(dāng)。測得該酶解液中無機磷/總磷為90%。
[0019]實施例三:
玉米漿酶解液的準(zhǔn)備:
取固含量為40-50%的玉米漿5000g，加水稀釋到18%固含量，用0.2N鹽酸調(diào)節(jié)PH至
3.5。在稀釋液中分別加入植酸酶和酸性蛋白酶，所述植酸酶量占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為0.03%,所述酸性蛋白酶占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為1.5%。保持酶解溫度為48°C,攪拌速度為210r/min,時間為16h。酶解后升溫至90°C,時間20min,進行滅酶。滅酶反應(yīng)后降溫至20°C，進行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為4500rpm，離心時間15min，取上清液備用。
[0020]( I)菌種活化培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基配方如下:
馬鈴薯30g,葡萄糖2-4g,瓊脂1.5-2g,水100ml ；
高山被孢霉菌株活化采用斜面菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30°C，培養(yǎng)時間7-10天；
(2)搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)基配方體積濃度如下:
葡萄糖20-40g/L，酵母粉2.5-5g/L ；
采用斜面菌種進行液體搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30°C，轉(zhuǎn)速140-200rpm，培養(yǎng)時間7_10
天;
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基體積濃度如下:
葡萄糖30-60g/L，玉米漿或玉米漿酶解液50-60g/L ；
①一級發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入一個裝有一級種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為0.1-1 %，培養(yǎng)溫度28-30°C，罐壓控制在0.015-0.05MPa,轉(zhuǎn)速140_200rpm，時間2-5天；
②二級發(fā)酵培養(yǎng):將一級種子罐中的菌種轉(zhuǎn)接入一個裝有二級種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為1-10%，培養(yǎng)溫度28-30°C，罐壓控制在0.015-0.05MPa,轉(zhuǎn)速140_200rpm，時間2-5天；
③三級發(fā)酵培養(yǎng):將二級種子罐種的菌種轉(zhuǎn)接入一個裝有三級發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為1-10 %，培養(yǎng)溫度28-30 V，罐壓控制在0.015-0.05MPa,轉(zhuǎn)速140_200rpm，進行發(fā)酵。玉米漿組168h時測定發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?.07g/100ml，得到生物量為2.65g/100ml，干菌體中總油為47.5%，ARA含量為46.8%，玉米漿酶解液組140h時測定發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?.03g/100ml，得到生物量為2.8g/100ml，干菌體中總油為47%，ARA含量為47.5%。實驗數(shù)據(jù)顯示，玉米漿酶解液組較玉米漿組縮短發(fā)酵時間28h，生物量、總油和ARA含量相當(dāng)。測得該酶解液中無機磷/總磷為89.5%。
【權(quán)利要求】
1.玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法，其特征在于:取玉米漿稀釋后，調(diào)節(jié)PH至3.0-5.0，加入一定量的植酸酶和酸性蛋白酶進行水解，水解16h-20h后，加熱使酶滅活，冷卻后離心分離得到酶解液用于微生物油脂發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的取玉米漿稀釋后為取固含量為40-50%的玉米漿，加水稀釋到15%-20%固含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的調(diào)節(jié)PH至3.0-5.0為用稀釋液0.2N鹽酸調(diào)節(jié)PH至3.0-5.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的加入一定量的植酸酶和酸性蛋白酶為植酸酶量占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為0.03%-0.035% ;酸性蛋白酶占玉米漿中干物質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)為1.5%-1.8%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的水解16h-20h為酶解溫度控制升溫至48°C，攪拌速度為200r/min-220r/min，水解 16h-20h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米漿酶解液用于微生物油脂發(fā)酵的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的使酶滅活為酶解后升溫至85-90°C，20min-25min.酶失活后酶解液降溫至20°C，加熱離心，轉(zhuǎn)速為4500rpm，15min_20min，取上清液用作微生物油脂發(fā)酵的培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12P7/64GK103642857SQ201310391393
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】簡曉紅, 劉真茂, 李金龍, 邱順江 申請人:福建貝辰生物科技有限公司