Survivin啟動子調控CD基因的重組腺病毒載體構建及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種重組腺病毒，這種重組腺病毒包含了胞嘧啶脫氨酶基因（CD基因），所述的CD基因受本發(fā)明設計的一種Survivin啟動子控制。更具需要進一步的公開了這種重組腺病毒的制備方法，并將重組腺病毒應用于治療癌癥的藥物。本發(fā)明提供的重組腺病毒，對腫瘤細胞有很好的特異性，在啟動腫瘤細胞的自殺程序的同時，并不影響正常細胞的存活。
【專利說明】Survivin啟動子調控CD基因的重組腺病毒載體構建及其
應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組腺病毒，更具體地，涉及一種存活素(survivin)啟動子靶向性調控自殺基因胞喃唳脫氨酶(cytosine deaminase,⑶)的重組腺病毒載體構建，以及該重組腺病毒在抗腫瘤治療藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]癌癥是嚴重威脅人類健康的惡性疾病之一，也是當今科學研究面臨的重大難題之一。傳統(tǒng)的治療方法難以根除腫瘤且伴隨著嚴重的副作用。隨著生命科學的不斷發(fā)展，基因治療有望成為取代傳統(tǒng)腫瘤治療的的一個新手段。而基因治療能否成功應用于臨床實踐的關鍵問題是治療的靶向性，良好的靶向性才能保證治療的安全性和有效性。
[0003]作為凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin基因是在1997年由Ambrosini等利用效應細胞蛋白酶受體-1 (EPR-1) cDNA在人類基因組文庫的雜交篩選中首次分離出的。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis, IAP)家族的成員，正常情況下它僅表達于人類的胚胎組織，在除甲狀腺、胸腺及生殖腺以外的分化成熟的成人組織中幾乎無表達，另外，它過表達于絕大多數(shù)常見的惡性腫瘤組織如肺癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌、何杰金氏病、黑色素瘤等，而在這些癌組織中相對應的正常組織并不表達Survivin，具有高度的腫瘤組織特異性。因此，利用survivin的這一特性進行腫瘤靶向性的治療具有重要的研究價值。
[0004]5氟尿嘧啶(5-FU)是臨床應用較為廣泛的抗腫瘤化療藥物，其在體內的代謝產物5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸(FdUMP)能夠抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性，導致dTTP池的耗盡，而最終抑制DNA的合成，達 到殺死腫瘤細胞的目的。5-FU可由5氟胞嘧啶(5-FC)脫氨基轉化而來，而這一過程可由某些微生物的胞嘧唳脫氨酶(cytosine deaminase,⑶)進行催化。CD由于能將原本無毒的前體藥物5-FC轉化成具有細胞毒性的化療藥物5-FU，因此又被稱為前藥基因或者自殺基因，基于這一原理，當前發(fā)展了一種CD/5-FC自殺基因系統(tǒng)用于抗腫瘤治療的研究。
[0005]⑶/5-FC系統(tǒng)相較于另一種自殺基因系統(tǒng)——單純皰疹病毒胸苷激酶(herpessimplex virus thymidine kinase, HSV-TK)/更昔洛韋(ganciclovir, GCV),有更強的旁觀者效應，這是由于5-FU不需要細胞間隙連接通訊來殺傷未轉化的臨近腫瘤細胞,而細胞間隙連接通訊在腫瘤細胞中往往是下調或者缺失的。另外，免疫因素也參與了⑶/5-FC系統(tǒng)殺傷腫瘤的作用:一方面經CD/5-FC途徑作用后，部分死亡的腫瘤細胞能夠刺激機體產生急性炎癥反應，導致各種免疫效應因子在腫瘤局部積聚，從而有助于免疫細胞的浸潤?’另一方面隨著部分腫瘤細胞的死亡，增加了腫瘤抗原的免疫原性，有助于免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別和殺傷。
[0006]但是在缺乏表達特異性的情況下，CD/5-FC不僅能夠殺傷腫瘤細胞，也會作用于正常細胞，對正常組織造成嚴重損傷，因此難以在腫瘤患者身上取得理想療效。為了使治療基因⑶能夠選擇性地表達于腫瘤細胞中，從而提高腫瘤治療靶向性，保護正常組織，應用腫瘤組織特異性的啟動子來介導治療基因的表達是實現(xiàn)這一目的的有效手段。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的之一為提供一種啟動子，來調控基因CD能特異性的選擇腫瘤細胞，提高腫瘤治療的靶向性。
[0008]根據(jù)以上發(fā)明目的，首先提供一種Survivin啟動子，所述的啟動子的核苷酸序列如SEQ NO:1所示。
[0009]根據(jù)需求再提供一種胞嘧啶脫氨酶基因，所述的胞嘧啶脫氨酶基因受上述的Survivin啟動子調控。
[0010]更進一步的提供一種重組腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒包含了根據(jù)上述的胞嘧啶脫氨酶基因。
[0011]更具體地，提供一種受survivin啟動子調控的⑶自殺基因的重組腺病毒的制備方法，包括以下步驟:
51.克隆survivin啟動子:設計引物，通過PCR的方法從BEL-7402細胞的基因組中擴增survivin啟動子片段,克隆到pGEM_T載體中構建成重組質粒pT_SP,并進行序列分析；
52.構建survivin啟動子調控綠色熒光蛋白GFP的報告質粒:用限制性內切酶AseI和Nhe I雙切pT-SP和pEGFP-Nl質粒，回收survivin啟動子和pEGFP-Nl質粒大片段進行連接，構建成重組質粒pSP-EGFP ；
53.克隆CD基因:設計引物，以酵母基因組為模板擴增CD基因，克隆到pGEM-T載體中構建成重組質粒PT-⑶，并進行序列分析；
54.構建含survivin啟動子和酵母⑶基因的重組腺病毒穿梭質粒:先利用限制性內切酶Sac I和Sal I雙切pT_⑶和pSP-EGFP質粒，回收⑶基因和線性化的pSP-EGFP進行連接，構建成重組質粒PSP-⑶；然后利用限制性內切酶XbaI和SalI雙切pSP-⑶質粒和PDC315穿梭質粒，回收SP-⑶片段和pDC315載體的大片段進行連接，構建成重組腺病毒穿梭質粒 PDC315-SP-CD ;
55.重組腺病毒Ad-SP-⑶的包裝、擴增和純化:將步驟S4所得的穿梭質粒PDC315-SP-CD與骨架質粒共轉染HEK-293細胞，出現(xiàn)病斑后收集病毒利用HEK-293細胞進行病毒的擴增，層析純化，即得受survivin啟動子調控的CD自殺基因的重組腺病毒。
[0012]步驟SI所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ N0:3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ N0:4所示。
[0013]步驟S3所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ N0:5所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ N0:6所示。
[0014]最后提供一種重組腺病毒在抗腫瘤的藥物中的應用，其特征在于，所述的重組腺病毒為根據(jù)上述的重組腺病毒或根據(jù)上述的制備方法制得的重組腺病毒。
[0015]所述的腫瘤為肝癌或宮頸癌。
[0016]本發(fā)明將survivin基因的腫瘤特異性與⑶/5_FC自殺基因系統(tǒng)的可控性結合起來，利用survivin基因的啟動子調控前藥基因CD的表達，以達到使其在正常組織細胞中不表達或極低表達，在腫瘤細胞中高表達的目的，從而大大增強自殺基因抗腫瘤的特異性，為腫瘤特異性的基因治療提供了一種新的思路。
[0017]在基因治療中，目的基因的有效傳輸是影響治療效果的重要因素，目前常用的基因傳輸載體主要分為非病毒載體和病毒載體兩大類，前者基于大分子材料，通過化學的方法將裸DNA、RNA或者真核表達質粒導入祀細胞內； 后者基于逆轉錄病毒(retrovirus,RV)、慢病毒體(lentivirus, LV)、腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)等整合型載體和腺病毒(adenovirus, AV)等非整合型載體，通過病毒介導的生物方法將目的基因導入靶細胞內。考慮到基因的傳輸效率，目前臨床應用研究較多的還是病毒載體。由于病毒載體又分為整合型和非整合型兩大類，考慮到安全性，我們采用了非整合型的腺病毒載體。腺病毒載體是一種線性雙鏈DNA無包膜病毒，AV的基因由El (E1A、E1B)、E2A、E2B、E3、E4組成，El基因與AV的復制有關，El的去除可引起復制缺陷，也為治療基因的插入騰出了空間。目前基因治療中所應用的AV載體一般缺失整個ElA和部分ElB基因，必須由293細胞提供El蛋白才能復制出具有感染能力的病毒，這些重組病毒可在許多細胞中表達外源基因，卻不能在El缺陷的細胞中復制，因此安全性較高。AV載體有廣宿主性，能有效地感染非分裂狀態(tài)的細胞，與RV相比，AV表達效價高，外源基因的容納量。另外由于其DNA不能整合于靶細胞基因組中，因此沒有致癌的危險。
[0018]綜上所述，本發(fā)明的主要目的就是構建survivin啟動子調控⑶自殺基因的重組腺病毒載體，并將其應用于抗腫瘤治療。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點如下所示:
1.構建一種受survivin啟動子調控的⑶自殺基因的重組腺病毒，該腺病毒轉染表達survivin蛋白的腫瘤細胞后才能夠在細胞中相應轉錄因子的激活下誘導該啟動子活化,從而表達出目的基因。而在正常細胞中，由于沒有這種轉錄因子，因此survivin啟動子就不會被活化，目的基因也就不能被表達，從而達到對腫瘤細胞的選擇性殺傷。
[0020]2.本發(fā)明為治療腫瘤提供了一個新的思路和方案。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為Survivin啟動子PCR產物電泳分析。
[0022]圖2為Ase I和Nhe I酶切后Survivin啟動子和pEGFP-Nl質粒電泳分析。
[0023]圖3為survivin啟動子在不同細胞中啟動報告基因GFP的表達情況。
[0024]圖4為⑶基因的PCR產物電泳分析。
[0025]圖5為Sac I和Sal I酶切后⑶基因和pSP-EGFP質粒電泳分析。
[0026]圖6為SP-⑶片段酶切后電泳分析。
[0027]圖7為重組腺病毒的包裝。
[0028]圖8為survivin啟動子在不同細胞中啟動⑶的表達情況。
[0029]圖9為在人肝癌細胞株H印G2中survivin啟動子調控的⑶能夠有效地將5-FC轉化為5-FU。
[0030]圖10為survivin啟動子調控的⑶能夠在5_FC存在的情況下有效地誘導人肝癌細胞株H印G2的凋亡。
[0031]圖11為survivin啟動子調控的⑶聯(lián)合5_FC對淋巴細胞的毒性檢查。【具體實施方式】
[0032]下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規(guī)市購的試劑、設備和常規(guī)使用的方法。
[0033]實施例1:Survivin啟動子的擴增
根據(jù)Genebank中survivin啟動子的序列設計引物，并在引物中分別引入酶切位點Ase I 和 Nhe I ,
上游引物SEQ NO:3:
GGCATTAATTCTAGATCCCCAGCTCCCTTGTCTTCTTAT,
下游引物SEQ NO:4:
AATGCTAGCAGTAGAGGCGGGGCGGCGC。
[0034]用此引物以BEL-7402的基因組DNA為模板進行PCR擴增:94 V預變性5min ；94°C 40s, 55°C 50s, 72°C 50s，擴增35個循環(huán)后72°C延伸5min，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到一個特異的條帶(如圖1)，其片段大小大概在700bp位置附近，與預期大小相符，將該片段膠回收后與PGEM-T載體連接，構建成重組質粒pT-SP，轉化大腸桿菌DH5 α后挑取陽性克隆送公司測序分析，結果如SEQ NO:1所示，所克隆的survivin啟動子序列正確。
[0035]實施例2:survivin啟動子調控綠色熒光蛋白(GFP)報告質粒的構建及表達活性檢測使用Nhe I和Ase I限制性內切酶對pT_SP和pEGFP-Nl質粒進行消化，分別膠回收切下來的survivin啟動子和切除了 CMV啟動子的pEGFP-Nl質粒，回收之后電泳檢測兩者的濃度(圖2)，然后過夜連接后轉化`大腸桿菌，挑取克隆進行菌落PCR檢測，確定陽性克隆后大提質粒備轉染用。
[0036]利用Lipofectamine2000將pSP-EGFP質粒轉染不同的細胞，包括人肝癌細胞株BEL-7402，人肝癌細胞株H印G2，人宮頸癌細胞株HeLa和非腫瘤細胞HEK-293。同時WpEGFP-Nl作為陽性對照，轉染48h以后進行熒光觀察?？梢钥闯?，在BEL-7402細胞中pSP-EGFP轉染組的綠色熒光蛋白表達水平最高，在H印G2和HeLa細胞中也有明顯的綠色熒光蛋白的表達，但是在非腫瘤細胞HEK-293中，熒光非常的弱(圖3)，這一結果表明克隆的Survivin啟動子在腫瘤細胞中能夠有效地啟動EGFP的表達。
[0037]實施例3:酵母細胞Cytosine deaminase (⑶)基因的克隆
根據(jù)Genebank中釀酒酵母CD基因的序列設計引物，并在引物中分別引入酶切位點Sac I 和 Sal I ,
上游引物 SEQ NO:5:atagagctcacgATGGTGACAGGGGGAATGGC,
下游引物 SEQ NO:6:cgcgtcgacCTACTCACCAATATCTTCAAACC。
[0038]用此引物以釀酒酵母細胞的基因組DNA為模板進行PCR擴增:94°C預變性IOmin ；940C 40s, 550C 50s, 72°C 50s，擴增35各循環(huán)后72°C延伸5min，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到一個特異的條帶(如圖4)，其片段大小大概在500bp位置附近，與預期大小相符，將該片段膠回收后與PGEM-T載體連接，構建成重組質粒PT-⑶，轉化大腸桿菌DH5 α后挑取陽性克隆送公司測序分析，結果如SEQ NO: 2所示，所克隆的⑶基因序列正確。
[0039]實施例4:survivin啟動子調控⑶基因的穿梭載體構建
首先使用限制性內切酶Sac I和Sal I對質粒pSP-EGFP和pT_⑶進行酶切，回收⑶基因和線性化的pSP-EGFP (圖5)，將兩者進行4°C過夜連接，構建成重組質粒pSP-⑶，轉化大腸桿菌后鑒定陽性克隆。
[0040]將陽性克隆放大培養(yǎng)后提取質粒pSP-⑶，利用限制性內切酶Xba I和Sal I對其進行酶切，然后電泳分離和膠回收SP-CD片段(圖6)，得到的SP-CD片段連入穿梭載體PDC315的相應酶切位點中，構建成穿梭質粒PDC31-SP-CD。
[0041 ] 實施例5:重組腺病毒Ad-SP-⑶的包裝、擴增和純化
接種4X105個HEK-293細胞于6孔板中，待細胞生長至約90%可進行轉染，利用Lipofectamine2000將穿梭質粒與骨架質粒共轉染HEK-293細胞，具體操作方法如下:將轉染的質粒(2ug穿梭質粒+2ug骨架質粒)、10 μ I脂質體分別用培養(yǎng)基稀釋至250 μ I,輕輕混勻，室溫靜置5min ;將脂質體加入到質粒稀釋液中，輕輕混勻，室溫靜置約20min ;將脂質體與質粒的混合液加入到相應的每孔細胞的上清中，37°C，5%C02培養(yǎng)4-6h后更換細胞培養(yǎng)液；37°C，5%C02繼續(xù)培養(yǎng)細胞。轉染24h后把細胞從板上消化下來轉移到大培養(yǎng)瓶中去養(yǎng)，約10天后可觀察細胞病變形成病斑(圖7)。收集病毒利用HEK-293細胞進行放大和擴增，得到的病毒利用陰離子層析進行純化。
[0042]實施例6:survivin啟動子調控的⑶基因在腫瘤細胞中的表達
將重組腺病毒Ad-SP-CD分別感染腫瘤細胞H印G2和非腫瘤細胞HEK-293，24h后提取各組細胞總RNA，逆轉錄出相應的cDNA模板后進行PCR檢測，RT-PCR電泳結果顯示⑶基因能夠在宿主細胞中表達(圖8)，與CMV啟動子相比，Survivin啟動子在腫瘤細胞中啟動⑶基因表達的能力顯著高于非腫瘤細胞。
[0043]實施例7:survivin啟動子調控的CD對5-FC的轉化
在重組腺病毒Ad-SP-⑶感染細胞24h后，在各組細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為5mM的前藥5-FC，加藥96h后取培養(yǎng)上清20 μ I進行毛細管電泳檢測，結果顯示感染了重組腺病毒Ad-SP-CD的腫瘤細胞培養(yǎng)上清液中5-FC含量有所降低，并且有少量5-FU的出現(xiàn)，但是在非腫瘤細胞ΗΕΚ-293的培養(yǎng)上清中沒有看到5-FC的減少和5-FU的出現(xiàn)，這一結果表明Survivin啟動子調控的⑶基因能夠特異地在腫瘤細胞中將5-FC轉化為5-FU (圖9).實施例8:survivin啟動子調控的⑶聯(lián)合5-FC對腫瘤細胞的殺傷利用細胞周期檢測對經過重組腺病毒Ad-SP-⑶感染和5-FC處理的腫瘤細胞IfepG2和非腫瘤細胞HEK-293進行分析。結果顯示(圖10)，在HepG2細胞轉染⑶基因并添加5-FC后，與對照病毒感染組相比出現(xiàn)明顯的細胞凋亡；而在非腫瘤細胞HEK-293中，Ad-SP-⑶感染組和對照病毒感染組相比則變化不明顯，表明Survivin啟動子調控的⑶基因能夠特異地對腫瘤細胞進行殺傷。
[0044]實施例9，正常細胞毒性實驗
將重組腺病毒Ad-SP-⑶感染健康人淋巴細胞后加入5-FC處理，利用細胞周期分析細胞凋亡情況，結果如圖11所示，重組腺病毒Ad-SP-⑶對正常細胞的毒性非常小。
【權利要求】
1.一種Survivin啟動子,其特征在于,所述的啟動子的核苷酸序列如SEQ NO:1所示。
2.一種胞嘧啶脫氨酶基因，其特征在于，所述的胞嘧啶脫氨酶基因受權利要求1所述的Survivin啟動子調控。
3.—種重組腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒包含了根據(jù)權利2所述的胞嘧啶脫氨酶基因。
4.一種受survivin啟動子調控的⑶自殺基因的重組腺病毒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:51.克隆survivin啟動子:設計引物，通過PCR的方法從BEL-7402細胞的基因組中擴增survivin啟動子片段,克隆到pGEM_T載體中構建成重組質粒pT_SP,并進行序列分析； 52.構建survivin啟動子調控綠色熒光蛋白GFP的報告質粒:用限制性內切酶AseI和Nhe I雙切pT-SP和pEGFP-Nl質粒，回收survivin啟動子和pEGFP-Nl質粒大片段進行連接，構建成重組質粒pSP-EGFP ； 53.克隆CD基因:設計引物，以酵母基因組為模板擴增CD基因，克隆到pGEM-T載體中構建成重組質粒pT-CD，并進行序列分析； 54.構建含survivin啟動子和酵母⑶基因的重組腺病毒穿梭質粒:先利用限制性內切酶Sac I和Sal I雙切pT_⑶和pSP_EGFP質粒，回收⑶基因和線性化的pSP_EGFP進行連接，構建成重組質粒PSP-⑶；然后利用限制性內切酶XbaI和SalI雙切pSP-⑶質粒和PDC315穿梭質粒，回收SP-⑶片段和pDC315載體的大片段進行連接，構建成重組腺病毒穿梭質粒 pDC315-SP-CD ; 55.重組腺病毒Ad-SP-⑶的包裝、擴增和純化:將步驟S4所得的穿梭質粒PDC315-SP-CD與骨架質粒共轉染HEK-293細胞，出現(xiàn)病斑后收集病毒利用HEK -293細胞進行病毒的擴增，層析純化，即得受survivin啟動子調控的CD自殺基因的重組腺病毒。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟SI所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ N0:3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ NO:4所示。
6.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟S3所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ N0:5所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ NO:6所示。
7.—種重組腺病毒在抗腫瘤的藥物中的應用，其特征在于，所述的重組腺病毒為根據(jù)權利要求3所述的重組腺病毒或根據(jù)權利要求4所述的制備方法制得的重組腺病毒。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的腫瘤為肝癌或宮頸癌。
【文檔編號】C12N15/861GK103484462SQ201310391654
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權日:2013年9月2日
【發(fā)明者】邵紅偉, 黃樹林, 沈晗, 吳鳳麟, 張文峰, 李家明 申請人:廣東藥學院