一種恩拉霉素的發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種恩拉霉素發(fā)酵方法，該方法通過(guò)在一定的發(fā)酵周期內(nèi)，向恩拉霉素發(fā)酵液中添加包括諸如精氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸等一種或多種氨基酸或其鹽來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明方法能大幅提高恩拉霉素產(chǎn)量，并且方便適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種恩拉霉素的發(fā)酵方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種恩拉霉素的發(fā)酵方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素自首次以低濃度添加到動(dòng)物飼料中用于促生長(zhǎng)至今已有近60年的歷史。 由于藥物殘留和耐藥性問(wèn)題，許多傳統(tǒng)抗生素被限制使用。恩拉霉素作為一種新型肽類抗 生素，以其具有穩(wěn)定、廣譜、無(wú)殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)；以其在公共方面的安全性，作為 專用的抗生素類飼料添加劑，其應(yīng)用正日益受到關(guān)注。
[0003] 恩拉霉素（Enramycin)是由殺真菌鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus)發(fā)酵 而得，又名安來(lái)霉素、持久霉素等，由包括13個(gè)不同種類的17個(gè)氨基酸分子和脂肪酸分 子所組成。是以不同的氨基酸為底物，由非核糖體聚肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)催化合成的聚肽類抗生素，其脂環(huán)骨架包含天冬氨酸、蘇氨酸、鳥(niǎo)氨 酸、瓜氨酸、甘氨酸等多種氨基酸。恩拉霉素根據(jù)其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉素 A(C107H138C12N26031)和恩拉霉素 B(C108H140C12N26031)兩個(gè)組分，恩拉霉素則是由這 兩種成分組成的混合物。
[0004] 恩拉霉素于1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社研發(fā)，其后在許多國(guó)家被注冊(cè) 和廣泛使用。1993年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)該藥在我國(guó)注冊(cè)。2005年，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)與國(guó)外公 司開(kāi)始合作生產(chǎn)恩拉霉素預(yù)混劑。隨著其他飼用抗生素逐步淘汰，恩拉霉素的使用勢(shì)必會(huì) 越來(lái)越廣泛，但是恩拉霉素的工業(yè)生產(chǎn)一直面臨產(chǎn)能產(chǎn)量低的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中恩拉霉素的發(fā)酵產(chǎn)量低的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出一種提高恩 拉霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法。
[0006] 本發(fā)明涉及一種提高恩拉霉素發(fā)酵產(chǎn)量的方法，包括在發(fā)酵中前期向恒溫發(fā)酵培 養(yǎng)的恩拉霉素發(fā)酵液中添加一種或多種氨基酸和/或其鹽。
[0007] 其中，所述的氨基酸和/或其鹽選自精氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸 和/或其鹽。
[0008] 其中，添加量以質(zhì)量百分比計(jì)分別為：精氨酸/或其鹽0.01-0. 1 %、苯丙氨酸/ 或其鹽0.01-0. 1%、天冬氨酸/或其鹽0.005-0. 05%、蘇氨酸/或其鹽0.005-0. 05%、賴 氨酸/或其鹽0.01-0. 3%。
[0009] 其中，所述的恒溫發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25-30°C ;培養(yǎng)基pH為6. 5-7. 5。
[0010] 其中，所述向培養(yǎng)基中添加氨基酸和/或氨基酸鹽的時(shí)間為開(kāi)始發(fā)酵0-120小時(shí) 內(nèi)，優(yōu)選為0-64小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選為0-24小時(shí)內(nèi)。
[0011] 其中，所述恩拉霉素發(fā)酵使用的培養(yǎng)基以質(zhì)量百分比計(jì)為玉米粉7-12%、麥芽糊 精8-16%、麩質(zhì)粉3-6%、玉米漿(λ 5-2. 0%、豆油1-3%、碳酸鈣(λ 5-L 0%。
[0012] 其中，所述方法包括以下步驟：斜面孢子培養(yǎng)：將殺真菌鏈霉菌無(wú)菌接入斜面孢 子培養(yǎng)基，溫度25-30°C、相對(duì)濕度40-60 %恒溫培養(yǎng)8-12天；種子與發(fā)酵培養(yǎng)：將孢子 懸浮液接入種子培養(yǎng)基，25-30°C培養(yǎng)40-60小時(shí)，然后無(wú)菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量以 體積百分比計(jì)為5-15%，25-30°C培養(yǎng)180-240小時(shí)；在發(fā)酵周期內(nèi)使用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵 ρΗ6· 5-7. 5〇
[0013] 本發(fā)明通過(guò)在一定的發(fā)酵周期，添加一種或者幾種氨基酸（或氨基酸鹽），使恩拉 霉素的生物合成具有更豐富、更均衡的底物組合，從而大幅提高恩拉霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。本發(fā) 明適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有很高的實(shí)用價(jià)值和意義。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0015] 以下實(shí)施例中孢子培養(yǎng)和種子培養(yǎng)均米用統(tǒng)一培養(yǎng)方式，溫度誤差< 〇. 5°C、相對(duì) 濕度誤差彡10%、pH誤差彡0. 5。
[0016] 斜面孢子培養(yǎng)：將殺真菌鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus)(鄭州但開(kāi)生物 工程技術(shù)有限公司，恩拉霉素產(chǎn)生菌系殺真菌素鏈霉菌突變菌株，商品號(hào)：BKSFJ06)無(wú)菌 接入斜面孢子培養(yǎng)基，溫度28°C、相對(duì)濕度40-60%恒溫培養(yǎng)10天；斜面孢子培養(yǎng)基包括成 分：玉米淀粉50g / L、麥芽糊精30g / L、蛋白胨8g / L、魚(yú)胨6g / L、瓊脂20g / L。
[0017] 種子發(fā)酵培養(yǎng)：將含有約3X101(I個(gè)孢子的孢子懸浮液無(wú)菌接入IOL種子培養(yǎng)基， 28°C培養(yǎng)48小時(shí)；種子培養(yǎng)基包括成分：玉米淀粉50g / L、麥芽糊精30g / L、玉米漿 15g / L、麩質(zhì)粉 IOg / L、碳酸鈣 6g / L、pH7.2。
[0018] 各實(shí)施例的其它參數(shù)：
[0019] 實(shí)施例1 :將培養(yǎng)好的種子液無(wú)菌接入60L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量6L，25°C培養(yǎng)180 小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程用氨水調(diào)節(jié)PH6. 5;發(fā)酵培養(yǎng)基包含的成分以質(zhì)量百分比計(jì)玉米粉7%、麥 芽糊精12%、麩質(zhì)粉4%、玉米漿1.0%、豆油1 %、碳酸鈣1.0%、氨水調(diào)節(jié)pH7. 5。
[0020] 實(shí)施例2 :將培養(yǎng)好的種子液無(wú)菌接入50L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量7L，25°C培養(yǎng)180 小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程用氨水調(diào)節(jié)PH6. 5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基包含的成分以質(zhì)量百分比計(jì)玉米粉10%、麥 芽糊精8 %、麩質(zhì)粉4%、玉米漿1. 5 %、豆油2 %、碳酸鈣1. 0 %、氨水調(diào)節(jié)pH7. 2。
[0021] 實(shí)施例3 :將培養(yǎng)好的種子液無(wú)菌接入50L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量4L，28°C培養(yǎng)200 小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程用氨水調(diào)節(jié)PH6. 8 ;發(fā)酵培養(yǎng)基包含的成分以質(zhì)量百分比計(jì)玉米粉10%、麥 芽糊精12 %、麩質(zhì)粉6 %、玉米漿1. 2 %、豆油3 %、碳酸鈣0. 8 %、氨水調(diào)節(jié)pH7. 0。
[0022] 實(shí)施例4 :將培養(yǎng)好的種子液無(wú)菌接入60L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量7L，28°C培養(yǎng)220 小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程用氨水調(diào)節(jié)PH7. 0 ;發(fā)酵培養(yǎng)基包含的成分以質(zhì)量百分比計(jì)玉米粉12%、麥 芽糊精12 %、麩質(zhì)粉4%、玉米漿0. 5 %、豆油2 %、碳酸鈣1. 0 %、氨水調(diào)節(jié)pH6. 8。
[0023] 實(shí)施例5 :將培養(yǎng)好的種子液無(wú)菌接入80L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量4L，28°C培養(yǎng)220 小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程用氨水調(diào)節(jié)PH7. 0 ;發(fā)酵培養(yǎng)基包含的成分以質(zhì)量百分比計(jì)玉米粉10%、麥 芽糊精14%、麩質(zhì)粉5 %、玉米漿2. 0 %、豆油2 %、碳酸鈣1. 0 %、氨水調(diào)節(jié)pH6. 5。
[0024] 實(shí)施例6 :將培養(yǎng)好的種子液無(wú)菌接入60L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量6L，30°C培養(yǎng)240 小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程用氨水調(diào)節(jié)PH7. 5;發(fā)酵培養(yǎng)基包含的成分以質(zhì)量百分比計(jì)玉米粉8%、麥 芽糊精16 %、麩質(zhì)粉3 %、玉米漿1. 5 %、豆油2 %、碳酸鈣1. 0 %、氨水調(diào)節(jié)pH6. 5。
[0025] 本發(fā)明對(duì)發(fā)酵液最終恩拉霉素含量的檢測(cè)采用HPLC外標(biāo)法：取60g恩拉霉素發(fā) 酵液，加入120ml甲醇，用IM鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. 0-4. 5,放置搖床上振搖2-4小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速 220-230rpm，2000轉(zhuǎn)離心20分鐘取上清進(jìn)樣檢測(cè)。采用HPLC法，使用安捷倫公司HPLC設(shè) 備，米用66111；[11丨（]18柱（4.61150_，5_;?11611〇11161161)，以乙臆（色譜級(jí)）：5〇1111憐酸二氫 鈉緩沖液=30 :70,流速ImL / min，在267nm處檢測(cè)，柱溫35°C，定量分析樣品中恩拉霉素 含量，進(jìn)樣量10 μ L。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 在發(fā)酵第0小時(shí)、24小時(shí)、64小時(shí)、120小時(shí)分別添加為0. 01 %、0. 05%、0. 1 %的 精氨酸或其鹽（占總發(fā)酵液質(zhì)量百分比計(jì)，下同），對(duì)照組不添加任何氨基酸，發(fā)酵完成時(shí) 分別測(cè)各組發(fā)酵液的恩拉霉素含量，結(jié)果如表1所示：
[0028] 表1不同時(shí)間添加不同濃度的精氨酸或其鹽后發(fā)酵液的恩拉霉素含量（g / L)
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種恩拉霉素發(fā)酵方法，其特征在于，向恒溫發(fā)酵培養(yǎng)的恩拉霉素培養(yǎng)基中添加一 種或多種氨基酸和/或其鹽。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸和/或其鹽為：精氨酸、苯丙 氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和/或其鹽。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的以質(zhì)量百分比計(jì)，所添加的量分 別為精氨酸/或其鹽0.01-0. 1%、苯丙氨酸/或其鹽0.01-0. 1%、天冬氨酸/或其鹽 0? 005-0. 05%、蘇氨酸/或其鹽0? 005-0. 05%、賴氨酸/或其鹽0? 01-0. 3%。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的恒溫發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為25-30°C，培 養(yǎng)基 pH 為 6. 5-7. 5。
5. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述向培養(yǎng)基中添加氨基酸和/ 或其鹽的時(shí)間為開(kāi)始發(fā)酵0-120小時(shí)內(nèi)。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述向培養(yǎng)基中添加氨基酸和/或其鹽的 時(shí)間為開(kāi)始發(fā)酵0-64小時(shí)內(nèi)。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述向培養(yǎng)基中添加氨基酸和/或其鹽的 時(shí)間為開(kāi)始發(fā)酵0-24小時(shí)內(nèi)。
8. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述恩拉霉素發(fā)酵使用的培養(yǎng)基 以質(zhì)量百分比計(jì)為玉米粉7-12 %、麥芽糊精8-16 %、麩質(zhì)粉3-6 %、玉米漿0. 5-2. 0 %、豆油 1-3%、碳酸鈣 0. 5-1. 0%。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于包括以下步驟：斜面孢子培養(yǎng)：將殺真菌鏈霉 菌無(wú)菌接入斜面孢子培養(yǎng)基，溫度25-30°C、相對(duì)濕度40-60%恒溫培養(yǎng)8-12天； 種子與發(fā)酵培養(yǎng)：將孢子懸浮液接入種子培養(yǎng)基，25-30°C培養(yǎng)40-60小時(shí)，然后無(wú)菌 接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量以體積百分比計(jì)為5-15%，25-30°C培養(yǎng)180-240小時(shí)； 在發(fā)酵周期0-120小時(shí)內(nèi)，補(bǔ)入氨基酸和/或其鹽，使用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵pH6. 5-7. 5。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK104419740SQ201310395254
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】劉儉國(guó), 焦龍, 唐慧慧, 張翠勤, 王玉梅, 孔衛(wèi)紅, 劉新凱, 王勤波, 王鑫, 鮑金慶, 張銳, 張?jiān)鲚x, 李磊, 董易凡, 李翠平 申請(qǐng)人:河南天方藥業(yè)股份有限公司