一種制備轉(zhuǎn)gapdh基因棉花的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種制備轉(zhuǎn)GAPDH基因棉花的方法。GAPDH蛋白，為如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）將SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明首次獲得了轉(zhuǎn)GAPDH基因棉花，為培育耐鹽堿棉花品種及提高棉花的耐鹽堿能力奠定了基礎(chǔ)，具有一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
【專利說(shuō)明】—種制備轉(zhuǎn)GAPDH基因棉花的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備轉(zhuǎn)GAPDH基因棉花的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤鹽潰化是一個(gè)全球性生態(tài)問(wèn)題，是當(dāng)今世界土地荒漠化和耕地退化的主要因素之一，土地的鹽潰化對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境帶來(lái)的影響巨大。如何開(kāi)發(fā)利用鹽堿地成為日益關(guān)注的焦點(diǎn)。土壤中高濃度的鹽分會(huì)造成植物體內(nèi)離子失衡、氧化傷害、水分虧缺和營(yíng)養(yǎng)缺乏并導(dǎo)致生物大分子破壞、生長(zhǎng)遲緩、甚至植株死亡，嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，從而導(dǎo)致作物的減產(chǎn)或絕收，制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展。具體鹽脅迫對(duì)植物的影響表現(xiàn)在:對(duì)種子萌發(fā)的影響，對(duì)植物光合作用、呼吸作用、蛋白質(zhì)合成及新陳代謝等的影響，對(duì)植物形態(tài)的影響等。目前，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐旱、耐鹽堿的作物新種質(zhì)已成為作物育種家的研究重點(diǎn)。
[0003]植物耐鹽是一個(gè)多基因參與控制的數(shù)量性狀、多途徑誘導(dǎo)的過(guò)程。植物適應(yīng)鹽脅迫的對(duì)策中較為普遍的是代謝調(diào)整。在脅迫條件下，植物本身能夠感知和傳導(dǎo)逆境脅迫信號(hào)，進(jìn)而啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，激活相應(yīng)的保護(hù)代謝途徑，如抗氧化酶系與活性氧的清除，離子、代謝物的積累與滲透調(diào)節(jié)，脅迫誘導(dǎo)蛋白的合成及其防御功能，脅迫誘導(dǎo)基因的調(diào)控與表達(dá)。此外，植物還會(huì)通過(guò)泌鹽作用、稀鹽作用、拒鹽作用等過(guò)程來(lái)抵抗鹽脅迫。隨著生物科技技術(shù)的不斷發(fā)展，以及生理學(xué)，遺傳學(xué)，分子生物學(xué)對(duì)抗逆性復(fù)雜機(jī)制的闡述，對(duì)植物耐鹽研究已經(jīng)取得了一些重大成果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多耐鹽相關(guān)基因，但是由于其機(jī)制復(fù)雜性還有很多與抗鹽相關(guān)的基因未被發(fā)現(xiàn)。
[0004]自然界中存在著許多天然的耐鹽植物，它們?cè)诼L(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中積累了很多豐富的耐鹽基因。杜氏鹽藻、紅樹(shù)、濱黎、海帶、圣柳、蒺藜苜蓿、堿蓬、大米草等耐鹽植物自身具有一套完善的耐鹽機(jī)制。目前國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室在植物耐鹽基因研究方面做了大量工作，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，植物會(huì)特異地表達(dá)一些基因，在一定程度上提高了植物的抗逆能力。利用基因工程手段和分子生物學(xué)的方法克隆耐鹽相關(guān)基因，轉(zhuǎn)化棉花，大豆，小麥和玉米等重要經(jīng)濟(jì)作物，獲得能在鹽堿地上種植和栽培的農(nóng)作物品種是未來(lái)研究的重點(diǎn)課題。通過(guò)研究這些被鹽脅迫所表達(dá)的基因，可能找到植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)及抵御機(jī)理，也為研究轉(zhuǎn)基因方面提供很好的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種制備轉(zhuǎn)GAPDH基因棉花的方法。
[0006]本發(fā)明所提供的GAPDH蛋白，為如下(I)或(2)所示:
[0007](I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0008](2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
[0009]上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0010]上述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N:
[0011]I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0012]2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0013]3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0014]含有上述任一所述的編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]一種制備轉(zhuǎn)GAPDH基因棉花的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該方法包括如下步驟:將上述任一所述的編碼基因?qū)氤霭l(fā)棉花中，得到轉(zhuǎn)基因棉花；與出發(fā)棉花相比，轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性增強(qiáng)。
[0016]上述方法中，所述編碼基因是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PBI121的多克隆位點(diǎn)得到的。
[0017]上述任一所述的方法中，所述編碼基因通過(guò)基因槍活體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入；
[0018]和/或，所述轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性增強(qiáng)是指轉(zhuǎn)基因棉花的種子在0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液條件下的發(fā)芽率高于出發(fā)棉花的種子在0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液條件下的發(fā)芽率。
[0019]上述蛋白、上述任一所述的編碼基因在提高棉花耐鹽性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0020]所述的耐鹽性為耐0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液的性質(zhì)；
[0021]所述提高棉花耐鹽性是指棉花的種子在0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液條件下的發(fā)芽率提高。
[0022]本發(fā)明首次獲得了轉(zhuǎn)GAPDH基因棉花，為培育耐鹽堿棉花品種及提高棉花的耐鹽堿能力奠定了基礎(chǔ)，具有一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為杜氏鹽藻甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)的克隆。
[0024]圖2為基因槍大田轉(zhuǎn)化流程圖。
[0025]圖3為轉(zhuǎn)基因棉花桃。
[0026]圖4為GAPDH基因分子檢測(cè)結(jié)果(以Fl和Rl為引物)。
[0027]圖5為GAPDH基因分子檢測(cè)結(jié)果(以F2和R2為引物)。
[0028]圖6為種子7天后的發(fā)牙結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0030]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031]杜氏鹽藻在文獻(xiàn)“劉建國(guó)，吳超元.杜氏鹽藻和β_胡蘿卜素研究評(píng)價(jià)[J].海洋與湖泊，1995，26(3):323-330.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所抗逆鑒定
課題組實(shí)驗(yàn)室獲得。
[0032]pGEM-T EasyT4載體購(gòu)自Promega公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為A1380。[0033]pBI121在文獻(xiàn)“香蕉Maasrl基因RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定.熱帶作物學(xué)報(bào)，2009年，30 (3):333-337.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所抗逆鑒定課
題組實(shí)驗(yàn)室獲得。
[0034]基因槍為美國(guó)wealtec的基因槍⑶S-80。 [0035]非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513在文獻(xiàn)“高頻體細(xì)胞胚胎發(fā)生的優(yōu)異棉花種質(zhì)材料篩選.分子植物育種，2012,10 (6), 683-688.”中公開(kāi)過(guò),公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所抗逆鑒定課題組實(shí)驗(yàn)室獲得。
[0036]實(shí)施例1、GAPDH超表達(dá)載體的構(gòu)建
[0037]一、設(shè)計(jì)PCR引物
[0038]引物序列如下:
[0039]GAPDH-F:5，-ATGGCTACATCAATGGCGAAGAC-3，；
[0040]GAPDH-R: 5，-TTAGGCGGCCCACCTCTGGGCG-3，。
[0041]二、PCR 擴(kuò)增
[0042](一)提取杜氏鹽藻的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0043](二)以cDNA為模板，用弓丨物對(duì)GAPDH-F/GAPDH-R進(jìn)行GAPDH基因的PCR擴(kuò)增。
[0044]PCR擴(kuò)增體系為:
[0045]

Premix Ex Tag25 μ I
模板2.0 μ I

GAPDH-F (10 μ Μ) 2.0μ I

GAPDH-R (10μ Μ) 2.Ομ I

ddH20補(bǔ)足至總體積50 μ I。
[0046]PCR反應(yīng)程序如下:
[0047]94°C 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 90s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C + ⑴。
[0048]GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0049]GAPDH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0050]三、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增片段并回收。
[0051]瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。
[0052]圖1 中，I:PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；2 =Marker0
[0053]圖1表明，PCR擴(kuò)增得到的GAPDH基因片段與預(yù)計(jì)大小一致。
[0054]四、將GAPDH基因片段與pGEM-T EasyT4載體連接，得到重組質(zhì)粒。
[0055]五、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序證明重組質(zhì)粒正確。
[0056]六、提取重組質(zhì)粒。以質(zhì)粒為模板，以A和B為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0057]引物序列如下:
[0058]A:5，-CACGGGGGACTCTAGAATGGCTACATCAATGGCGAA-3，；
[0059]B:5’-AGGGACTGACCACCCGGGGGCGGCCCACCTCTGGGC-3’。
[0060](下劃線所示序列為酶切識(shí)別位點(diǎn))
[0061]七、用Xba I和Sma I雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到GAPDH基因片段；用Xba I和Sma I雙酶切受體載體PBI121，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒 PBI121-GAPDH。
[0062]八、將重組質(zhì)粒PBI121-GAPDH轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序證明
重組質(zhì)粒正確。
[0063]實(shí)施例2、基因槍活體轉(zhuǎn)化棉花
[0064]一、提取 pBI 121-GAPDH 質(zhì)粒。
[0065]二、轉(zhuǎn)化受體材料為:非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513。轉(zhuǎn)化時(shí)間定在棉花的盛花期7月中旬到8月中旬，滬749513進(jìn)行自交。
[0066]三、在轉(zhuǎn)化的第一天下午采集各受體材料的花朵，然后將花朵室溫放置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上(每個(gè)材料的花朵要做好標(biāo)記)，同時(shí)已經(jīng)去掉雄蕊的花一定用蠟管套住柱頭。
[0067]四、第二天早上9:00-10:00左右開(kāi)始收集花粉，收集好的花粉放于干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，并做好標(biāo)記。
[0068]五、取10 μ I金粉和質(zhì)粒的懸浮液加入到基因槍⑶S-80孔內(nèi)，用手輕輕拍打槍的加樣孔附近兩下，使所加的樣品完全進(jìn)入槍內(nèi)。
[0069]六、基因槍轟擊采集的各受體材料的新鮮花粉1-2次，轟擊后的花粉人工涂抹于雌蕊的柱頭(11:00左右進(jìn)行涂抹，此時(shí)花粉活力比較強(qiáng))，用蠟管重新套在涂抹花粉后的柱頭上，以免發(fā)生雜交，掛牌做好標(biāo)記。
[0070]七、待種子成熟，將收獲的各材料的種子做好標(biāo)記，曬干后脫絨保存。
[0071]圖2是實(shí)驗(yàn)中基因槍 大田轉(zhuǎn)化的流程圖片。
[0072]圖2中，A:大田棉花；Β:去雄蕊，套蠟管，做標(biāo)記；C:收集的花朵；D:收集的花粉；E:基因槍轟擊；F:授粉。
[0073]非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513T0代植株的棉花桃如圖3所示。
[0074]圖3表明，經(jīng)大田觀察大部分轉(zhuǎn)基因棉花桃比非轉(zhuǎn)基因棉花桃稍小、有點(diǎn)畸形。轉(zhuǎn)基因棉花吐絮晚。
[0075]實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因棉花TO代種子的分子檢測(cè)
[0076]一、提取轉(zhuǎn)基因非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513T0代植株的發(fā)芽材料的DNA。
[0077]二、以各植株的DNA為模板，分別用GAPDH基因的兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。檢測(cè)引物如表1所示。
[0078]表1檢測(cè)引物
[0079]
引物名稱_引物序列(5，-3，)_擴(kuò)增理論值
GAPDH-FlGCCGTGAAGATGGAGGTCGT992bp
GAPDH-RlTAGCCCCACTCGTTGTCGTA
GAPDH-F2 GGGCAAGTTCTCCGCCGATG 556bpGAPDH-R2_(tGG(；A(；A(；(t(:A(tA(t(；(；A(:A(；_
[0080]其中GAPDH-Fl 和 GAPDH-Rl 為一對(duì)引物，GAPDH-F2 和 GAPDH-R2 為一對(duì)引物。
[0081 ] 三、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。[0082]結(jié)果如圖4和圖5所示。
[0083]圖4為GAPDH基因分子檢測(cè)結(jié)果(以GAPDH-Fl和GAPDH-Rl為引物)。
[0084]圖 4 中，M =Marker DL2000 ;1_6 為滬 749513T0 代植株。
[0085]圖4表明，以GAPDH-Fl和GAPDH-Rl為引物擴(kuò)增，圖A中編號(hào)為1、2、3、4、5和圖B中編號(hào)為6的植株擴(kuò)增出992bp的特異性條帶，其中編號(hào)為3和6的植株的特異性條帶最清晰。
[0086]圖5為GAPDH基因分子檢測(cè)結(jié)果(以GAPDH-F2和GAPDH-R2為引物)。
[0087]圖5 中，M =Marker DL2000 ;1_20 為滬 749513T0 代植株。
[0088]圖5表明，以F2和R2為引物擴(kuò)增，圖A中編號(hào)為1_7和圖B中編號(hào)為8_20的植株擴(kuò)增出556bp的特異性條帶，但條帶不亮。
[0089]因此，通過(guò)兩對(duì)引物擴(kuò)增共檢測(cè)出有特異性條帶的植株(即轉(zhuǎn)GAPDH基因非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513植株)26株。
[0090]四、用圖4中編號(hào)為3和6的滬749513轉(zhuǎn)基因植株的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，結(jié)果正確，表明杜氏鹽藻GAPDH基因成功轉(zhuǎn)入了非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513中。
[0091 ] 實(shí)施例4、TO代種子的耐鹽性檢測(cè)
[0092]采用雙夾層濾紙法，具體步驟如下:
[0093]先在培養(yǎng)皿內(nèi)放 置一張濾紙，擺上種子，再在種子上放置一張濾紙，用0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液澆之，溶液量以上層濾紙濕潤(rùn)、傾斜時(shí)皿底無(wú)溶液聚合為度，在24°C保濕培養(yǎng)。7天后觀察發(fā)芽情況。
[0094]實(shí)驗(yàn)組所用種子為實(shí)施例3中的TO代轉(zhuǎn)GAPDH基因非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513的種子40粒，對(duì)照組為未轉(zhuǎn)任何基因的非抗蟲(chóng)棉花滬749513的種子40粒。
[0095]結(jié)果如圖6所示。
[0096]圖6中，A:7天后TO代轉(zhuǎn)GAPDH基因非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513的種子發(fā)芽情況；
[0097]B:7天后非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513的種子發(fā)芽情況。
[0098]圖6表明，TO代轉(zhuǎn)GAPDH基因非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513的種子中部分種子有較強(qiáng)的耐鹽性，發(fā)芽很好，發(fā)芽率達(dá)16.3%，而對(duì)照組非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513的種子耐鹽性明顯較差，發(fā)芽率為0.08%，對(duì)照組中有一個(gè)種子發(fā)芽，但是其根部發(fā)黑已死亡。轉(zhuǎn)空載體PBI121的非抗蟲(chóng)棉花材料滬749513的結(jié)果與對(duì)照組一致。
【權(quán)利要求】
1.GAPDH蛋白，為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.2所示的蛋白； (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N: 1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.一種制備轉(zhuǎn)GAPDH基因棉花的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求2或3所述編碼基因?qū)氤霭l(fā)棉花中，得到轉(zhuǎn)基因棉花；與出發(fā)棉花相比，轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性增強(qiáng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述編碼基因是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PBI121的多克隆位點(diǎn)得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述編碼基因通過(guò)基因槍活體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入； 和/或，所述轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性增強(qiáng)是指轉(zhuǎn)基因棉花的種子在0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液條件下的發(fā)芽率高于出發(fā)棉花的種子在0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液條件下的發(fā)芽率。
8.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述編碼基因在提高棉花耐鹽性中的應(yīng)用； 所述的耐鹽性為耐0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液的性質(zhì)； 所述提高棉花耐鹽性是指棉花的種子在0.8% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液條件下的發(fā)芽率提高。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103468655SQ201310396389
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】葉武威, 陰祖軍, 孔靜靜, 王德龍, 王俊娟, 樊偉莉, 王帥 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所