一種利用固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法；首先將鮮木薯和木薯干粉碎，與水混合，加入α-淀粉酶，得到液化液，升溫滅菌；再降溫糖化，再加入糖化酶得到可發(fā)酵糖液，再降溫進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵時(shí)添加適量氮源與營(yíng)養(yǎng)成分；將安琪釀酒活性干酵母放入滅菌后的酵母活化培養(yǎng)基中，置于恒溫水浴中振蕩培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到3.0×108個(gè)/ml～6.0×108個(gè)/ml時(shí)結(jié)束活化；取酵母菌懸液加入到海藻酸鈉和聚氧化乙烯混合溶液中，滴加到氯化鈣溶液中，形成小球，得到的凝膠，固定化酵母增殖培養(yǎng)；發(fā)酵，得含乙醇的濃醪液；本方法材料為食品級(jí)，對(duì)發(fā)酵無(wú)毒害，可在發(fā)酵完后回收制備飼料，醪液中乙醇的質(zhì)量濃度達(dá)到13.6%～14.8%，乙醇發(fā)酵效率高。
【專利說(shuō)明】—種利用固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程和生物、醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，特別涉及利用固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。

【背景技術(shù)】
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[0002]木薯是一種多年生植物，產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)的丘陵地帶，它有加工性能良好及不與糧爭(zhēng)地的優(yōu)點(diǎn)，且具有粗生易栽、耐旱、耐瘠、適應(yīng)性強(qiáng)、單產(chǎn)高等特性，被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)的能源作物之一。
[0003]目前一般都是使用鮮木薯作為原料生產(chǎn)乙醇，存在的主要問題是發(fā)酵成熟醪的酒份低，過濾困難、發(fā)酵液中酵母細(xì)胞密度低、發(fā)酵液中乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的抑制作用、糖解速率低、發(fā)酵速率低并且設(shè)備利用率、勞動(dòng)生產(chǎn)率、能源利用率都偏低，生產(chǎn)成本較高。改進(jìn)的方法是提高發(fā)酵醪液濃度和酵母細(xì)胞濃度。
[0004]專利⑶101629189八是將第一次粉碎后的鮮木薯進(jìn)行調(diào)漿，加溫液化過濾，用熱水洗滌濾渣，回收濾渣中殘?zhí)?，過濾得到的濾液可用于第一次鮮木薯粉碎，用第一次濾液作為第二次鮮木薯的粉碎液，粉碎得到的漿料作為原料用于濃醪酒精發(fā)酵。但此方法能耗水耗過高。專利⑶101245354八以干木薯為原料采用兩級(jí)拌料制漿生產(chǎn)工藝，一級(jí)拌料制漿得到黏度較低的稀粉漿進(jìn)行沉降除沙操作，稀漿再經(jīng)過二次木薯粉拌料制漿得到較濃的粉漿。但此方法的原料除沙率低，不利于后期發(fā)酵。
[0005]但是，上述方法都無(wú)法從根本上避免在乙醇發(fā)酵中，發(fā)酵液中酵母細(xì)胞密度低、發(fā)酵液中乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的抑制作用，隨著發(fā)酵液中乙醇產(chǎn)物濃度的上升，當(dāng)乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到9%以上時(shí)，酵母細(xì)胞就會(huì)完全停止生長(zhǎng)，發(fā)酵會(huì)處于停滯狀態(tài)。所以單獨(dú)提高發(fā)酵醪液濃度不利于提高發(fā)酵速率，無(wú)法降低乙醇生產(chǎn)成本。
[0006]酵母細(xì)胞的固定化技術(shù)是生產(chǎn)乙醇的一種高新技術(shù)。不但可以解決發(fā)酵液中酵母細(xì)胞數(shù)量的問題，還可以提高酵母細(xì)胞對(duì)乙醇的抑制性。但要將固定化技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，首先要解決固定化載體在生產(chǎn)中的軟化、破裂、成本和使用時(shí)間等一系列問題，目前酵母固定化大部分采用海藻酸鈣、聚乙烯醇等包埋法，但存在成本較高、機(jī)械強(qiáng)度低、固定化過程較繁瑣，載體軟化現(xiàn)象等缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]本發(fā)明的目的是提供一種以木薯為原料利用固定化酵母生產(chǎn)乙醇的方法。既能夠提高發(fā)酵醪液濃度又能夠提高酵母細(xì)胞濃度的木薯乙醇生產(chǎn)方法。
[0008]本發(fā)明所述的一種以木薯為原料利用固定化酵母生產(chǎn)乙醇的方法，制備的步驟和條件如下:
[0009]采用鮮木薯和木薯干為原料利用固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。所用原料有鮮木薯和木薯干、0 ~淀粉酶、糖化酶、海藻酸鈉、聚氧化乙烯、安琪釀酒高活性干酵母。
[0010]本發(fā)明分為三個(gè)步驟，首先是發(fā)酵醪液的制備過程，然后是酵母固定細(xì)胞的制備過程，最后進(jìn)行發(fā)酵。
[0011]在發(fā)酵醪液的制備過程，要控制原料粉碎粒度及其混合比例(鮮木薯粒度在1.4臟?1.7臟，木薯干粒度在0.21臟?0.25臟。按鮮木薯粉:木薯干粉:水的重量比例為1: 2: 5.5?8混合),控制好0-淀粉酶與糖化酶的添加量與溫度:0 -淀粉酶用量為10^/^?2(^/8，液化溫度在751?951，保溫120分鐘?140分鐘，之后升溫到1051?1101滅菌5分鐘?10分鐘。糖化酶用量240^/8?260^/8，糖化溫度在561?621，保溫20分鐘?60分鐘，使原料達(dá)到充分糖化的目的。
[0012]在酵母固定細(xì)胞的制備過程，先進(jìn)行酵母活化，細(xì)胞數(shù)達(dá)到3.0父108個(gè)/01?6.0X108個(gè)/11^時(shí)結(jié)束活化，然后制備固定化細(xì)胞，在制備過程中控制好海藻酸鈉和聚氧化乙烯混合比例，海藻酸鈉粘度在1.05？3.3?1.15？3.3，聚氧化乙烯分子量在30萬(wàn)以上。2%?3%海藻酸鈉和0.1%?0.5%聚氧化乙烯混合制備成凝膠。這樣有利于提高固化細(xì)胞的強(qiáng)度。
[0013]在發(fā)酵過程中主要控制好固定細(xì)胞的填充率在45%?55%之間有利于發(fā)酵。
[0014]本發(fā)明采用混合原料生產(chǎn)乙醇，鮮木薯粉:木薯干粉:水的重量比在1: 2:5.5?8，這樣減少粉碎能耗，節(jié)約成本。
[0015]本發(fā)明的固定化材料采用海藻酸鈉、聚氧化乙烯，其材料價(jià)格便宜且屬于食品級(jí)原料對(duì)發(fā)酵沒有毒害作用，可以在發(fā)酵完畢后回收制備飼料。采用固定化發(fā)酵工藝其發(fā)酵醪液終乙醇的質(zhì)量濃度可達(dá)到13.6%?14.8%之間，大大提高了乙醇發(fā)酵效率。

【具體實(shí)施方式】
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[0016]材料與試劑:
[0017]鮮木薯:產(chǎn)地廣西北海，淀粉含量28%、水分48% ；
[0018]木薯干:產(chǎn)地廣西北海，淀粉含量67%、水分12% ；
[0019]超級(jí)釀酒高活性干酵母:安琪酵母股份有限公司產(chǎn)；
[0020]耐溫『淀粉酶(200(^/3:天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)；
[0021]糖化酶(1000001/8):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)；
[0022]海藻酸鈉(1.05？3 - 5-1.15？3 - 8):天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)試劑；
[0023]聚氧化乙烯(30萬(wàn)分子量):天津市豐越化學(xué)品有限公司產(chǎn)，分析純；
[0024]氯化鈣:天津天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠產(chǎn)，分析純；
[0025]硫酸鎂:天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)，分析純；
[0026]硫酸銨:天津市瑞金特化學(xué)品有限公司產(chǎn)，分析純；
[0027]磷酸二氫鉀:天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)，分析純；
[0028]酵母膏:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)，生化試劑；
[0029]葡萄糖:天津市化學(xué)試劑一廠產(chǎn)，分析純；
[0030]蛋白胨:天津市英博生化試劑有限公司，生化試劑:
[0031]活化培養(yǎng)基:酵母膏108/1、蛋白胨208/1、葡萄糖208/1。
[0032]增殖培養(yǎng)基:葡萄糖如/1、蛋白胨0.58/1、酵母膏0.58凡、硫酸鎂0.18凡、磷酸二氫鉀0.匕/!。
[0033]對(duì)比例1:
[0034]1)米用木薯粉發(fā)酵工藝
[0035]①首先將木薯干進(jìn)行清洗與除沙處理，然后進(jìn)行原料的粉碎。木薯干粉碎，使其粒度在0.21111111左右，70篩目。
[0036]②將上述①粉碎后的木薯粉與水進(jìn)行混合，按木薯干粉:水的重量比例為1: 2混合，總發(fā)酵體積3匕然后升溫至651，攪拌調(diào)漿40分鐘，達(dá)到完全溶解的目的。
[0037]③在②的漿液中加入0-淀粉酶用量為1(^/8，控溫在751，邱值為4.8，保溫120分鐘得到液化液，之后升溫到1051滅菌5分鐘，達(dá)到完全糊化和滅菌的效果。再降溫到561達(dá)到糖化溫度，調(diào)節(jié)邱值在3.8，再加入240^/8糖化酶，保溫20分鐘得到可發(fā)酵糖液，再降溫到301進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)添加適量氮源與營(yíng)養(yǎng)成分，硫酸銨添加量在0.38/1、硫酸鎂用量在0.058/1、磷酸二氫鉀用量在0.158/1。
[0038]2)干酵母的活化:
[0039]①取知安琪釀酒高活性干酵母放入滅菌后的20001的奸0酵母活化培養(yǎng)基中，置于301恒溫水浴中振蕩培養(yǎng)30分鐘。取酵母懸液鏡檢，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到3.0父108個(gè)加1左右時(shí)，結(jié)束活化。
[0040]3)發(fā)酵:
[0041]發(fā)酵溫度在301，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)150??！11?111，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，終發(fā)酵濃醪液中乙醇的質(zhì)量濃度達(dá)到11.6%。
[0042]實(shí)施例1:
[0043]發(fā)明一種以木薯為原料利用固定化酵母生產(chǎn)乙醇的方法。
[0044]1)采用鮮木薯和木薯干混合發(fā)酵工藝
[0045]①首先將鮮木薯與木薯干進(jìn)行清洗與除沙處理，然后進(jìn)行原料的粉碎。鮮木薯采用細(xì)碎粉碎法，使其粒度在1.4皿左右，12篩目。再將木薯干粉碎，使其粒度在0.21皿左右，70篩目
[0046]②將上述①粉碎后的木薯粉與水進(jìn)行混合，按鮮木薯粉:木薯干粉:水的重量比例為1: 2: 5.5混合，然后升溫至951攪拌調(diào)漿30分鐘，達(dá)到完全溶解的目的。
[0047]③在②的漿液中加入0 -淀粉酶用量為1(^/8，控溫在751，邱值為4.8之間，保溫120分鐘得到液化液，之后升溫到1051滅菌5分鐘，達(dá)到完全糊化和滅菌的效果。再降溫到561達(dá)到糖化溫度，調(diào)節(jié)邱值在3.8之間，再加入2401/8糖化酶，保溫20分鐘得到可發(fā)酵糖液，再降溫到301進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)添加適量氮源與營(yíng)養(yǎng)成分，硫酸銨添加量在0.38/1、硫酸鎂用量在0.058/1、磷酸二氫鉀用量在0.158凡。
[0048]2)干酵母的活化與固定化:
[0049]①取知安琪釀酒高活性干酵母放入滅菌后的20001的奸0酵母活化培養(yǎng)基中，置于301恒溫水浴中振蕩培養(yǎng)140分鐘。取酵母懸液鏡檢，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到6.0父108個(gè)加1左右時(shí)結(jié)束活化。
[0050]②在無(wú)菌條件下，?、俳湍妇鷳乙杭尤氲?0001經(jīng)過滅菌處理的2%海藻酸鈉和0.5%聚氧化乙烯混合溶液中，混合均勻后用注射器逐滴滴加到2%的氯化鈣溶液中，形成粒徑在3皿的小球，在31下平衡反應(yīng)60分鐘，每半小時(shí)攪拌一次靜置過夜。得到的凝膠用滅菌水洗滌4次，之后是固定化酵母增殖培養(yǎng)，將制備的凝膠置于增殖培養(yǎng)基中，301下恒溫振蕩增殖培養(yǎng)30分鐘，鏡檢游離細(xì)胞個(gè)數(shù)達(dá)108個(gè)加1以上。
[0051]3)發(fā)酵:
[0052]發(fā)酵溫度在301，凝膠填充率在45%，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100印111?111，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，終發(fā)酵濃醪液中乙醇的質(zhì)量濃度達(dá)到13.6%。
[0053]實(shí)施例2:
[0054]發(fā)明一種以木薯為原料利用固定化酵母生產(chǎn)乙醇的方法。
[0055]1)采用鮮木薯和木薯干混合發(fā)酵工藝
[0056]①首先將鮮木薯與木薯干進(jìn)行清洗與除沙處理，然后進(jìn)行原料的粉碎。鮮木薯采用細(xì)碎粉碎法，使其粒度在1.7臟左右，10篩目。再將木薯干粉碎，使其粒度在0.25臟左右，60篩目。
[0057]②將上述①粉碎后的木薯粉與水進(jìn)行混合，按鮮木薯粉:木薯干粉:水的重量比例為1: 2: 8混合，然后升溫至551攪拌調(diào)漿60分鐘，達(dá)到完全溶解的目的。
[0058]③在②的漿液中加入0 -淀粉酶用量為201/8，控溫在951，？??！值為6.2之間，保溫140分鐘得到液化液，之后升溫到1101滅菌10分鐘，達(dá)到完全糊化和滅菌的效果。再降溫到621達(dá)到糖化溫度，調(diào)節(jié)邱值在4.6之間，再加入2601/8糖化酶，保溫60分鐘得到可發(fā)酵糖液，再降溫到361進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)添加適量氮源與營(yíng)養(yǎng)成分，硫酸銨添加量在0.58/1、硫酸鎂用量在0.108/1、磷酸二氫鉀用量在0.208/1。
[0059]2)干酵母的活化與固定化:
[0060]①取徹安琪釀酒高活性干酵母放入滅菌后的40001的奸0酵母活化培養(yǎng)基中，置于361恒溫水浴中振蕩培養(yǎng)60分鐘。取酵母懸液鏡檢，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到3.0父108個(gè)加1時(shí)結(jié)束活化。
[0061]②在無(wú)菌條件下，?、俳湍妇鷳乙杭尤氲?0(^1經(jīng)過滅菌處理的3%海藻酸鈉和0.1%聚氧化乙烯混合溶液中，混合均勻后用注射器逐滴滴加到5%的氯化鈣溶液中，形成粒徑在的小球，在51下平衡反應(yīng)180分鐘，每半小時(shí)攪拌一次靜置過夜。得到的凝膠用滅菌水洗滌2次，之后是固定化酵母增殖培養(yǎng)，將制備的凝膠置于增殖培養(yǎng)基中，361下恒溫振蕩增殖培養(yǎng)120分鐘，鏡檢游離細(xì)胞個(gè)數(shù)達(dá)108個(gè)加1以上。
[0062]3)發(fā)酵:
[0063]發(fā)酵溫度在361，凝膠填充率在55%，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200印111?111，發(fā)酵時(shí)間75小時(shí)，終發(fā)酵濃醪液中乙醇的質(zhì)量濃度達(dá)到14.8%。
[0064]實(shí)施例3:
[0065]發(fā)明一種以木薯為原料利用固定化酵母生產(chǎn)乙醇的方法。
[0066]1)采用鮮木薯和木薯干混合發(fā)酵工藝
[0067]①首先將鮮木薯與木薯干進(jìn)行清洗與除沙處理，然后進(jìn)行原料的粉碎。鮮木薯采用細(xì)碎粉碎法，使其粒度在1.5皿左右，10篩目到12篩目之間。再將木薯干粉碎，使其粒度在0.23臟左右，65篩目。
[0068]②將上述①粉碎后的木薯粉與水進(jìn)行混合，按鮮木薯粉:木薯干粉:水的重量比例為1: 2: 6混合，然后升溫至801攪拌調(diào)漿40分鐘，達(dá)到完全溶解的目的。
[0069]③在②的漿液中加入0 -淀粉酶用量為15口4，控溫在801，邱值為5.2之間，保溫130分鐘得到液化液，之后升溫到1051滅菌8分鐘，達(dá)到完全糊化和滅菌的效果。再降溫到581達(dá)到糖化溫度，調(diào)節(jié)邱值在4.2之間，再加入250^/8糖化酶，保溫40分鐘得到可發(fā)酵糖液，再降溫到321進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)添加適量氮源與營(yíng)養(yǎng)成分，硫酸銨添加量在0.知/1、硫酸鎂用量在0.088/1、磷酸二氫鉀用量在0.188凡。
[0070]2)干酵母的活化與固定化:
[0071]①取安琪釀酒高活性干酵母放入滅菌后的30001的奸0酵母活化培養(yǎng)基中，置于321恒溫水浴中振蕩培養(yǎng)80分鐘。取酵母懸液鏡檢，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到4.5父108個(gè)加1左右時(shí)結(jié)束活化。
[0072]②在無(wú)菌條件下，?、俳湍妇鷳乙杭尤氲?0(^1經(jīng)過滅菌處理的2.5%海藻酸鈉和0.25%聚氧化乙烯混合溶液中，混合均勻后用注射器逐滴滴加到3%的氯化鈣溶液中，形成粒徑在4皿的小球，在41下平衡反應(yīng)120分鐘，每半小時(shí)攪拌一次靜置過夜。得到的凝膠用滅菌水洗滌3次，之后是固定化酵母增殖培養(yǎng)，將制備的凝膠置于增殖培養(yǎng)基中，321下恒溫振蕩增殖培養(yǎng)60分鐘，鏡檢游離細(xì)胞個(gè)數(shù)達(dá)108個(gè)加1以上。
[0073]3)發(fā)酵:
[0074]發(fā)酵溫度在321，凝膠填充率在50%，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)150印111?111，發(fā)酵時(shí)間60小時(shí)，終發(fā)酵濃醪液中乙醇的質(zhì)量濃度達(dá)到14.2%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于: 1)采用鮮木薯和木薯干混合發(fā)酵工藝: ①首先將鮮木薯與木薯干進(jìn)行清洗與除沙處理，然后進(jìn)行原料的粉碎，鮮木薯采用細(xì)碎粉碎法，使其粒度在1.4mm?1.7mm之間備用，再將木薯干粉碎,使其粒度在0.21mm?0.25mm 之間； ②將上述①粉碎后的木薯粉與水進(jìn)行混合，按鮮木薯粉:木薯干粉:水的重量比例為1:2: 5.5?8混合，然后升溫至55°C?110°C攪拌調(diào)漿30分鐘?60分鐘，達(dá)到完全溶解； ③在②的漿液中加入α-淀粉酶用量為10U/g?20U/g，控溫在75°C?95°C，pH值為4.8?6.2之間，保溫120分鐘?140分鐘得到液化液，之后升溫到105°C?110°C滅菌5分鐘?10分鐘，達(dá)到完全糊化和滅菌的效果；再降溫到56°C?62°C達(dá)到糖化溫度，調(diào)節(jié)pH值在3.8?4.6之間，再加入240U/g?260U/g糖化酶，保溫20分鐘?60分鐘得到可發(fā)酵糖液，再降溫到30°C?36°C進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵時(shí)添加適量氮源與營(yíng)養(yǎng)成分，硫酸銨添加量在0.3g/L?0.5g/L、硫酸鎂用量在0.05g/L?0.10g/L、磷酸二氫鉀用量在0.15g/L?0.20g/L ； 2)干酵母的活化與固定化: ①取4g?8g安琪釀酒活性干酵母放入滅菌后的200ml?400ml的YPD酵母活化培養(yǎng)基中，置于30°C?36°C恒溫水浴中振蕩培養(yǎng)60分鐘?140分鐘；取酵母懸液鏡檢，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到3.0X 18個(gè)/ml?6.0X 18個(gè)/ml時(shí)結(jié)束活化； ②在無(wú)菌條件下，?、俳湍妇鷳乙杭尤氲?0ml經(jīng)過滅菌處理的2%?3%海藻酸鈉和0.1%?0.5%聚氧化乙烯混合溶液中，混合均勻后用注射器逐滴滴加到2%?5%的氯化鈣溶液中，形成粒徑在3mm?5mm的小球,在3°C?5°C下平衡反應(yīng)60分鐘?180分鐘,每半小時(shí)攪拌一次靜置過夜；得到的凝膠用滅菌水洗滌2次?4次，之后是固定化酵母增殖培養(yǎng)，將制備的凝膠置于增殖培養(yǎng)基中，30°C?36°C下恒溫振蕩增殖培養(yǎng)30分鐘?120分鐘，鏡檢游離細(xì)胞個(gè)數(shù)達(dá)18個(gè)/ml以上； 3)發(fā)酵 發(fā)酵溫度在30°C?36°C，凝膠填充率在45%?55%，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100rpm/min?200rpm/min，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)?75小時(shí)，終發(fā)酵濃醪液中乙醇的質(zhì)量濃度達(dá)到13.6%?14.8%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于:海藻酸鈉粘度在1.05Pa.S?1.15Pa.S，聚氧化乙烯分子量在30萬(wàn)以上。
【文檔編號(hào)】C12N11/10GK104419734SQ201310397826
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】胡世洋, 劉海軍, 岳軍, 徐友海, 朱慶偉, 呂繼萍, 惠繼星, 王繼艷 申請(qǐng)人:中國(guó)石油天然氣股份有限公司