一種食品中沙門氏菌活菌的快速檢測試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種食品中沙門氏菌活菌的快速檢測試劑盒及使用方法，本發(fā)明對環(huán)介導等溫擴增方法進行了改進，能快速檢測食品中沙門氏菌活菌，與PCR檢測方法相比較，PMA-LAMP檢測方法提高了檢測特異性、靈敏度和準確性。與傳統(tǒng)LAMP檢測方法相比較，PMA-LAMP檢測方法可以區(qū)分試樣中的活菌和死菌，檢測結果更準確，極大降低了假陽性結果的產(chǎn)生，同時傳統(tǒng)LAMP檢測方法其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計2對特異性引物，而本發(fā)明對傳統(tǒng)LAMP檢測方法進行了創(chuàng)新，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計3對特異性引物，使得檢測特異性、靈敏度和準確性有較大的提高。
【專利說明】一種食品中沙門氏菌活菌的快速檢測試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測領域，具體涉及一種食品中沙門氏菌活菌的快速檢測試劑盒，還涉及一種食品中沙門氏菌活菌的快速檢測試劑盒的使用方法，該試劑盒適用于各類食品和食物中毒樣品中沙門氏菌的檢測。本發(fā)明適用于食品生產(chǎn)企業(yè)、食品加工企業(yè)、超市、農(nóng)貿(mào)市場、水產(chǎn)品批發(fā)市場的快速檢測及國家相關職能檢測機構實驗室檢測。
【背景技術】
[0002]沙門氏菌(Salmonella sp.)，革蘭氏陰性桿菌，目前已發(fā)現(xiàn)2600多種血清型，我國已有200多種，具有內(nèi)毒素和侵襲能力。由沙門氏菌引起的疾病為常見的人畜共患病人體食入一定數(shù)量的活菌會導致食物中毒。在我國細菌性食物中毒中，有70%-80%是由沙門氏菌引起的，而在引起沙門氏菌中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品。2012年8月美國曾爆發(fā)因食用了被污染雞蛋而感染沙門氏菌的食品安全事件。
[0003]目前我國國標對于沙門氏菌的檢測仍采用傳統(tǒng)的先增菌再選擇培養(yǎng)最后進行生化鑒定的定性方式。該方法的不足之處在于耗時長、步驟繁瑣和無法定量檢測。傳統(tǒng)方法檢測全過程一般需要至少5-7d，才能得到明確的診斷結果。這大大降低了檢測效率，嚴重影響了對沙門氏菌監(jiān)測的時效性。因此社會對于快速準確沙門氏菌檢測方法的需求仍十分迫切。
[0004]近年來，有大量研究是基于PCR檢測方法，PCR檢測方法在操作時間，檢測的特異性和靈敏度方面較常規(guī)方法均有較大提高，但PCR檢測方法需要精密的PCR儀，它的檢測時間也較長(2?4h)，并且反應過程很容易受污染物的影響，從而使得這種方法不能滿足實地快速檢測的需求。另外還有一些檢測方法，比如免疫色譜法、DNA雜交法，雖然檢測靈敏度高，但是所需設備和操作過程比較復雜，也不能滿足實地快速檢測的需求。
.[0005]環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)是2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計2對特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(60?65°C)保溫30?60min，即可完成核酸擴增反應。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。LAMP是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。
[0006]現(xiàn)有技術中已經(jīng)有沙門氏菌檢測試劑盒和檢測方法，但在實際使用過程中存在著無法區(qū)分沙門氏菌活體菌與死菌，對檢測結果影響很大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是在于提供了一種食品中沙門氏菌(Salmonella)活菌的檢測試劑盒，能快速檢測食品中沙門氏菌活菌，與PCR檢測方法相比較，PMA-LAMP檢測方法提高了檢測特異性、靈敏度和準確性。與傳統(tǒng)LAMP檢測方法相比較，PMA-LAMP檢測方法可以區(qū)分試樣中的活菌和死菌，只檢測試樣中存在的沙門氏菌活菌，結果更準確，極大的降低了假陽性結果產(chǎn)生。同時傳統(tǒng)LAMP檢測方法其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計2對特異性引物，而本發(fā)明對傳統(tǒng)LAMP檢測方法進行了創(chuàng)新，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計3對特異性引物，使得檢測特異性、靈敏度和準確性有較大的提高。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種食品中沙門氏菌活菌的檢測試劑盒的使用方法，方法易行，操作簡便。通過該方法，可快速、靈敏的檢測食品中沙門氏菌活體菌，該方法在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。
[0009]為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施:
[0010]一種沙門氏菌LAMP檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括以下成分:10X反應緩沖液；Bst DNA聚合酶；dNTPs ；MgS04 ;引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R ； 1000 X SYBR Green I熒光染料；陽性對照。
[0011]IOX 反應緩沖液配方:200mM Tris-HClUOOmM KCl、10mM(NH4)2S04、l.0%(質(zhì)量
[0012]體積比)Tritonx-100。
【權利要求】
1.一種沙門氏菌PMA-LAMP檢測試劑盒，包括以下成分: IOX 反應緩沖液、fei DNA聚合酶、10 mM dNTPsUOO mM MgSO4,40 mM PMA, 1000XSYBRGreen I熒光染料和陽性對照沙門氏菌標準株；
2.權利要求1所述沙門氏菌PMA-LAMP檢測試劑盒的使用方法，其步驟是: PMA-LAMP 反應體系:在 0.2 mL PCR 管中依次加入 10 X Thermopol Reaction Buffer2.5 μ L，Bst聚合酶I μ L，引物FIP和BIP終濃度為1.8 μ M ;引物F3和B3終濃度為0.2μΜ ;引物LF和LB終濃度為1.0 μ M，DNA模板和無RNA酶去離子水至25 “1，在60-651:水浴中反 應60 min，在85°C水浴中溫浴10 min使酶失活；
【文檔編號】C12N15/11GK103436623SQ201310399019
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月4日 優(yōu)先權日:2013年9月4日
【發(fā)明者】張毅 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所