作為檢測(cè)日光照射、前列腺癌和其它癌癥的診斷工具的線粒體突變及重排的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了可用于對(duì)于檢測(cè)癌癥和日光照射的線粒體DNA缺失。具體地，提供了檢測(cè)線粒體DNA缺失以用于前列腺癌、日光照射和非黑色素瘤皮膚癌的早期檢測(cè)、診斷和發(fā)展的方法和試劑盒。
【專利說明】作為檢測(cè)日光照射、前列腺癌和其它癌癥的診斷工具的線粒體突變及重排
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00680021903.1的中國專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是國際申請(qǐng)PCT/CA2006/000652的中國國家階段申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0002]本發(fā)明涉及線粒體基因組學(xué)領(lǐng)域。具體地，其涉及線粒體基因組中的突變和重排，及其作為日光照射、衰老和疾病的發(fā)生或存在的指示因子的功用，例如在一般的臨床癥狀顯現(xiàn)之前檢測(cè)腫瘤形成前、腫瘤形成以及向潛在惡性轉(zhuǎn)化的進(jìn)展。
【背景技術(shù)】
[0003]當(dāng)前生物科學(xué)中的大趨勢(shì)是人類基因組計(jì)劃以及該數(shù)據(jù)的商業(yè)開發(fā)。然而，對(duì)這些信息的利用和實(shí)行存在例外的限制，因?yàn)樵摂?shù)據(jù)在個(gè)體水平上不是特異性的。令人難以置信的是，該數(shù)據(jù)僅來自少量個(gè)體，難以代表人類種群中存在的變異，從而使得該數(shù)據(jù)只能用于一般應(yīng)用。人類基因組驚人的復(fù)雜性使基于個(gè)體基礎(chǔ)的應(yīng)用并不實(shí)際。為了對(duì)一個(gè)人類細(xì)胞核基因組進(jìn)行完整測(cè)序，美國能源部和國立衛(wèi)生研究院從1988年起已投資25億美兀(http://www.0rnl.gov/hgmis/project/budget.html)。
[0004]線粒體基因組
[0005]線粒體基因組是緊湊但卻至關(guān)重要的核酸序列。線粒體基因組編碼細(xì)胞呼吸所必需的酶亞基。與33億bp的龐大核基因組相反，線粒體DNA (或“mtDNA”)是16，569個(gè)堿基對(duì)(bp)的小核酸基因組(Anderson等，1981 !Andrews等，1999)。其遺傳互補(bǔ)體比其同細(xì)胞的核小得多(0.0005%)。然而，個(gè)體細(xì)胞帶有IO3至IO4中任意數(shù)目的線粒體，這取決于特定的細(xì)胞功能(Singh and Modica-Napolitano2002)。在細(xì)胞核和線粒體基因組之間一般存在通訊或化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Sherratt等，1997)。而且，特定的細(xì)胞核組分負(fù)責(zé)線粒體序列的維持和完整性(Croteau等，1999)。當(dāng)這些細(xì)胞核區(qū)域由于指示潛在疾病的細(xì)胞核重排而失去功能時(shí),接著mtDNA序列中也會(huì)開始出現(xiàn)突變。另外,可以通過線粒體基因組中由體細(xì)胞突變推動(dòng)的缺失來對(duì)細(xì)胞內(nèi)破壞鑒定特異性線粒體。這種理論性機(jī)制也可以用于指示將發(fā)生的疾病。線粒體需要約3，000種基因，其中只有37種由線粒體基因組編碼，表明了線粒體對(duì)細(xì)胞核基因座的嚴(yán)重依賴(Naviaux，1997)。
[0006]一旦發(fā)生受精，由于卵細(xì)胞中線粒體的克隆擴(kuò)增，給定個(gè)體中所有線粒體DNA(mtDNA)基因組是相同的。mtDNA的關(guān)鍵作用是產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)細(xì)胞代謝的細(xì)胞燃料——三磷酸腺苷(ATP)。重要地，除了由線粒體基因組提供的13種多肽以外，該線粒體基因組依賴70種細(xì)胞核編碼的蛋白質(zhì)來完成該生命功能所必需的氧化和還原反應(yīng)(Leonard和Shapira,
1997)。不同的組織和器官對(duì)氧化磷酸化的依賴程度不同。與氧化磷酸化(0XPH0S)缺陷相關(guān)的疾病看來與mtDNA突變有緊密的聯(lián)系(Byrne，1992)。由于mtDNA突變的嚴(yán)重性提高而導(dǎo)致0XPH0S降低而超出了器官特異性能量閾值，這引起多種臨床表型。而且，線粒體基因組中的突變與多種慢性退行性疾病有關(guān)(Gattermann等1995)。眾所周知,衰老和特定類型的疾病可以使mtDNA發(fā)生改變或突變，使細(xì)胞的能量產(chǎn)生能力受損。這常常導(dǎo)致缺陷線粒體的過表達(dá)和/或細(xì)胞通過增加糖酵解來補(bǔ)充ATP的缺乏(Carew和Huang，2002);因此，當(dāng)以連續(xù)的間隔進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，線粒體基因組中的改變或突變可以用作疾病發(fā)生和/或疾病發(fā)展的標(biāo)記。
[0007]最近，F(xiàn)liss等(2000)在來自肺及膀胱的癌癥的原發(fā)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了天然情況下主要為同質(zhì)的mtDNA發(fā)生高頻率突變，表明突變mtDNA在惡性腫瘤細(xì)胞中占多數(shù)。點(diǎn)突變和缺失看來是氧自由基對(duì)線粒體膜和基因組造成損傷的非程序性但卻不可避免的副作用(Miquel等1992)。這個(gè)理論看來言之有理，不僅因?yàn)榫€粒體基因組缺乏保護(hù)性組蛋白，還因?yàn)樵诋a(chǎn)生氧的線粒體內(nèi)膜附近發(fā)現(xiàn)了對(duì)氧化損傷的敏感性。而且，由于mtDNA具有緊湊的基因組并缺少內(nèi)含子，因此有害事件很可能影響編碼序列，引起生物化學(xué)功能異常。這種功能異常將進(jìn)一步增加細(xì)胞的氧化應(yīng)激，這將引起核及mtDNA的損傷，從而提高細(xì)胞進(jìn)入癌化過程的可能性(Penta等，2001)。在這方面，研究表明隨著年齡的增長，mtDNA的損傷增加(Cortopassi&Wangl995),呼吸功能隨之衰退(Miquel等1992),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
[0008]mtDNA作為診斷工具
[0009]mtDNA序列動(dòng)力學(xué)情況是重要的診斷工具。mtDNA中的突變常常是正在發(fā)展中疾病的先期指示，常常與細(xì)胞核突變有關(guān)，并作為與疾病特異性相關(guān)的生物標(biāo)志物，所述疾病例如但不僅限于:吸煙和接觸二手煙引起的組織損傷和癌癥(Lee等，1998 ；ffei, 1998);基于從約20歲開始并在之后逐漸提高的線粒體基因組突變累積的壽命((von ffurmb,1998)；由突變或接觸致癌物、誘變劑、紫外線輻射照射而引起的轉(zhuǎn)移性疾病(Birch-Machm，2000)；骨關(guān)節(jié)炎；心血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森病(Shoffner等，1993 ;Sherratt等，1997 ；Zhang等，1998);與年齡相關(guān)的聽力喪失(Seidman等，1997);視神經(jīng)退化和心率失常(Brown 等，1997 ;Wallace 等，1988);慢性進(jìn)行性 external exophthalmoplegia (Taniike等，1992);動(dòng)脈硬化(Bogliolo等，1999);乳頭狀甲狀腺癌和甲狀腺瘤(Yeh等，2000)等等(例如 Naviaux, 1997 ；Chinnery and Turnbull, 1999)。
`[0010]線粒體基因組特定位點(diǎn)的突變可與某些疾病相關(guān)。例如，在4216、4217和4917位的突變與 Leber' s 遺傳性視神經(jīng)病變(LHON) (Mitochondrial Research Society ；Huoponen(2001) ；MitoMap)相關(guān)。在5/5個(gè)泛醇細(xì)胞色素C還原酶(復(fù)合體III)缺陷的患者中發(fā)現(xiàn)了 15452位的突變(Valnot等1999)。然而，還未這些位點(diǎn)的突變與前列腺癌有關(guān)。
[0011]具體地，這些改變包括點(diǎn)突變(轉(zhuǎn)換、顛換)、缺失(一個(gè)堿基至數(shù)千個(gè)堿基)、倒位、復(fù)制(一個(gè)堿基至數(shù)千個(gè)堿基)、重組以及插入(一個(gè)堿基至數(shù)千個(gè)堿基)。另外，特定的堿基對(duì)改變、缺失或其組合與前列腺癌、皮膚癌和肺癌的早期發(fā)作以及衰老(例如Polyak等，1998)、提如裳老、接觸致癌物(Lee等，1998)等有關(guān)。
[0012]因?yàn)閙tDNA僅通過卵細(xì)胞向后代傳遞，所以急需通過這種遺傳手段了解線粒體序列。mtDNA的序列在母系譜系之間有廣泛的變異(Ward等，1991)，因此，必須與這種變異相比清楚地了解與疾病相關(guān)的突變。例如，若干個(gè)體的序列中與特定癌癥相關(guān)的特定T向C的轉(zhuǎn)換實(shí)際上可能是在給定的特定地理區(qū)域或與種族相關(guān)的母系譜系中廣泛的天然變異。例如，北美本地人表現(xiàn)出異常高的成年糖尿病發(fā)病頻率。另外，所有的北美本地人在遺傳上可表征為5個(gè)基本的母系譜系，命名為A、B、C、D和X(Schurr等，1990 ；Stone和Stoneking，1993 ;Smith等，1999)。譜系A(chǔ)的特點(diǎn)是具有單個(gè)點(diǎn)突變，導(dǎo)致線粒體基因組的663bp處出現(xiàn)Hae III位點(diǎn)，然而在這種突變與成人糖尿病發(fā)病之間沒有因果關(guān)系。另外，即使在譜系簇中也存在序列變異。
[0013]在與特定譜系相關(guān)的特定標(biāo)記之外，種群內(nèi)序列變異多于種群間序列變異(Easton等，1996 ;Ward等，1991，1993)。為了最佳地鑒定與疾病相關(guān)的突變，就必須了解這種趨異性，因此必須使用模擬縱向設(shè)計(jì)能力(即長期跟蹤受試者)的母系研究法(Parsons等，1997)鑒定與疾病直接相關(guān)的突變，而不是物疾病相關(guān)性的突變。而且，特定的物質(zhì)例如二手煙、低水平的石棉、鉛、在許多環(huán)境中低水平的所有已知誘變劑可能是特定點(diǎn)突變的原因，但卻不一定是疾病特異性標(biāo)志物。因此，豐富的mtDNA序列數(shù)據(jù)庫是準(zhǔn)確預(yù)測(cè)潛在疾病為自然過程或是由于接觸致病物質(zhì)而引起的明確的必要條件。而且，必須對(duì)整個(gè)分子進(jìn)行測(cè)序以得到其完整的信息內(nèi)容。必須在整個(gè)線粒體基因組上將完整的點(diǎn)突變(轉(zhuǎn)換、顛換)、缺失(一個(gè)堿基至數(shù)千個(gè)堿基)、倒位、復(fù)制(一個(gè)堿基至數(shù)千個(gè)堿基)、重組以及插入(一個(gè)堿基至數(shù)千個(gè)堿基)表征為一個(gè)整體。這可確保所獲得線粒體基因組中所有可能的可用信息。盡管與其核副本一樣，胞質(zhì)線粒體基因組(16，569bp)已在個(gè)體水平進(jìn)行了測(cè)序，但是還未在種群水平對(duì)線粒體基因組進(jìn)行測(cè)序以用作診斷工具。
[0014]最近，由于其在凋亡和其它腫瘤生物學(xué)方面中的作用(Green&Reed，1998，Penta等，2001)，尤其是已在許多人類腫瘤中觀察到mtDNA的體細(xì)胞突變(mtDNA) (Habano等1998 ；Polyak等1998 ；Tamura等1999 ；Fliss等2000),因此已經(jīng)將線粒體與致癌過程相聯(lián)系。特定的mtDNA突變似乎是同質(zhì)的(Habano等1998 ；Polyak等1998 ；Fliss等2000)，這些后面的發(fā)現(xiàn)更有意義。另外，研究者已發(fā)現(xiàn)，紫外線輻射(UV)對(duì)于非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)的發(fā)生和發(fā)病是重要的(Weinstock 1998 ;ReeS，1998)，并且UV在人類皮膚中誘發(fā)mtDNA 損傷(Birch-Machin, 2000a)。
[0015]而且，線粒體序列隨時(shí)間失去完整性。例如，4977bp缺失的頻率隨年齡增長而提高(Fahn等，1996)。從20歲開始,該缺失開始在少量線粒體中發(fā)生。至80歲時(shí),大量的分子已發(fā)生缺失。該缺失表征了`正常衰老的過程，并作為該過程的生物標(biāo)志物。對(duì)這種衰老過程的定量允許使用醫(yī)學(xué)或其他方式的干預(yù)來延緩該過程。
[0016]這種線粒體基因組在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用受到了忽視，是因?yàn)閙tDNA先前主要用作種群遺傳學(xué)工具，最近用于取證；然而，越來越明顯地，mtDNA的信息內(nèi)容在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用。而且,在最近高容量的高通量機(jī)器DNA測(cè)序系統(tǒng)出現(xiàn)之前，對(duì)全部mtDNA互補(bǔ)體進(jìn)行測(cè)序是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。另外，種群遺傳學(xué)家能夠收集來自控制區(qū)中的兩個(gè)高度可變區(qū)的重要數(shù)據(jù)；然而，這些小區(qū)域代表整個(gè)基因組中10%以下的一小部分，意味著該數(shù)據(jù)中90%的辨別力沒有得到使用。很重要地，許多疾病相關(guān)地改變?cè)诳刂茀^(qū)之外。為了精確并且高辨別地進(jìn)行診斷，應(yīng)該考慮整個(gè)基因組的特征，以包括所有的序列信息。
[0017]非黑色素瘤皮膚癌
[0018]人類非黑色素瘤皮膚癌(匪SC)在許多白種人群中是最普遍的癌癥(Wemstock，1998 ；Rees,1998) 0這些腫瘤中多數(shù)為基底細(xì)胞癌(BCC)和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。BCC為局部侵襲性并可導(dǎo)致顯著的發(fā)病率，但幾乎不轉(zhuǎn)移。SCC顯示顯著的轉(zhuǎn)移潛力，并且免疫抑制的患者中多發(fā)性匪SC的發(fā)生導(dǎo)致嚴(yán)重的治療問題(Rees，1998)。盡管BCC沒有臨床上可檢測(cè)的惡化前損傷，但一些SCC認(rèn)為是由前體損傷引起，也就是光化性角化病(AK)或鮑恩病(原位癌)(Rees，1998)。
[0019]SCC顯示出影響某些染色體的雜合性丟失，提示某些腫瘤抑制子基因參與其發(fā)生。有趣的是，在AK中，這些前體損傷中觀察到的基因丟失水平與SCC相比相同或更高(Rehman等1994 ；Rehman等1996)。這對(duì)于本發(fā)明是很重要的，因?yàn)檫@提示除了腫瘤抑制子基因失活以外，在SCC的發(fā)生中還可能涉及其他機(jī)制。
[0020]在發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的呼吸系統(tǒng)受損并具有高糖酵解活性時(shí)，最先提出了線粒體在腫瘤發(fā)生發(fā)揮作用的假說(Shay&Werbin，1987)。最近的發(fā)現(xiàn)闡明了線粒體在凋亡中的作用(Green&Reed, 1998),與結(jié)腸癌(Habano 等 1998 ；Polyak 等 1998, reviewed in Penta 等，2001)、膀胱、頸和肺(Fliss等2000)的原發(fā)性腫瘤以及胃腫瘤(Tamura等1999)同質(zhì)mtDNA突變的高發(fā)生率一起進(jìn)一步支持了這種假說。而且，已經(jīng)提出，這些線粒體突變可影響活性氧類別(ROS)的水平，已經(jīng)顯示ROS具有高促有絲分裂能力(Polyak等1998 ；Li等1997)。
[0021]本發(fā)明人及其它人在先前的研究中已顯示mtDNA中的突變以及相關(guān)的線粒體功能異常是導(dǎo)致人類退行性疾病的重要促進(jìn)因素(Birch-Machin等1993 ;Chinnery等1999 ；Birch-Machin等2000b)。這是因?yàn)?，該?xì)胞器中產(chǎn)生的大量ROS使線粒體基因組特別容易突變，同時(shí)與核相比缺乏保護(hù)性組蛋白并且mtDNA修復(fù)的速率很低(Pascucci等1997 ；Sawyer&van Houten ；LeDoux等1999)。實(shí)際上，mtDNA的突變率約比細(xì)胞核DNA高10倍(Wallace, 1994) 0在最近的人類腫瘤研究中鑒定的多數(shù)mtDNA突變表明可能接觸了 ROS衍生的誘變劑。這對(duì)于匪SC中mtDNA突變研究十分重要，因?yàn)樽罱凶C據(jù)表明UV誘導(dǎo)的ROS直接參與人類皮膚細(xì)胞mtDNA缺失的產(chǎn)生(Berneburg等1999, Lowes等,2002)。另外,無保護(hù)性色素沉著或遺傳素因(genetic predisposition)的個(gè)體中NMSC的主要決定因素是UV(WeinstOCk，1998)。還發(fā)現(xiàn)SCC推定的前體損傷主要發(fā)生在經(jīng)常接受日光照射的部位上。這之所以重要，是因?yàn)锽irch-Machin實(shí)驗(yàn)室的工作已經(jīng)顯示，取自接受不同日光照射的身體部位的皮膚中線粒體DNA損傷的發(fā)生頻率之間存在不同的差異。發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)損傷位于經(jīng)常接受日光照射的位點(diǎn)上(Krishanan等,2002)。
[0022]本發(fā)明的發(fā)明人之一首先定量顯示了 UV照射誘導(dǎo)mtDNA損傷(Birch-Machin等
1998)。作為分子標(biāo)記，mtDNA用于研究人類皮膚中自然老化與光老化之間的關(guān)系。利用3-引物定量PCR(qPCR)方法研究與人類皮膚的日光照射和自然老化相關(guān)的4977bp缺失mtDNA與野生型mtDNA比例的改變。與避光部位(1.1% [1/90])相比，日光照射部位的高水平4977bp缺失mtDNA的發(fā)生率(27%，[27/100])顯著提高(即> 1% ) (Fishers精確檢驗(yàn)，P < 0.0001)。因此，mtDNA的缺失或突變可以用作累積性紫外線照射的標(biāo)志物。
[0023]而且,使用針對(duì)胸腺喃唳二聚體的單克隆抗體進(jìn)行South-Western印跡法進(jìn)行的研究為純化的mtDNA中存在UV誘導(dǎo)的損傷提供了直接的證據(jù)(Ray等1998)。
[0024]本發(fā)明人的研究組在最近的工作中使用了長延伸PCR(LX-PCR)技術(shù)擴(kuò)增完整的線粒體基因組，以確定U V照射繼發(fā)的mtDNA完整缺失譜(Ray等2000)。對(duì)71個(gè)分散的皮膚樣品就其與日光照射的關(guān)系進(jìn)行了長PCR分析，其中將表皮與下面的真皮分離。隨著UV照射的增加，表皮中的缺失數(shù)顯著增加(Kruskal-Walhs檢驗(yàn)，p = 0.0015)。表皮中的該發(fā)現(xiàn)不會(huì)與也通過長PCR技術(shù)檢測(cè)的年齡依賴性mtDNA缺失提高混淆。大光譜的已鑒定缺失使得與UV照射有關(guān)的mtDNA的普遍性質(zhì)和高突變復(fù)合更加明了。與使用競(jìng)爭(zhēng)性PCR檢測(cè)單缺失相比，該研究顯示長PCR是一種靈敏的技術(shù)，因此可以提供更全面的(盡管不是定量的)皮膚總體mtDNA損傷指標(biāo)。上述發(fā)明人之一的研究清楚地顯示，mtDNA是UV的重要革巴標(biāo)，這與線粒體在皮膚病中的功能一起于最近進(jìn)行了綜述(Birch-Machin, 2000)。
[0025]已對(duì)UV敏感性和人類皮膚癌的主要共變體的人類毛發(fā)及皮膚色素沉著進(jìn)行了研究。這些研究關(guān)注于黑皮質(zhì)素I受體基因變體與個(gè)體和種群中日光敏感性與皮膚癌易感性相關(guān)的聯(lián)系(Smith 等 1998 ；Healy 等 1999 ；Flanagan 等 2000 ；Healy 等 2000 ；Harding 等2000 ；Flanagan等，2002)。然而，這些研究沒有強(qiáng)調(diào)mtDNA序列種群水平的變異與特定皮膚類型和/或毛發(fā)顏色的關(guān)系。 [0026]最近人類腫瘤中mtDNA突變的研究在很大程度上仍未回答的一個(gè)問題是線粒體基因組中缺失的發(fā)生率與這些腫瘤的關(guān)系。這是一個(gè)有待解決的重要問題，因?yàn)槿祟惼つw單個(gè)患者的初步研究已經(jīng)顯示，在某些腫瘤(AK和SCC)和正常皮膚之間存在普遍mtDNA缺失發(fā)生率的差異(Pang等1994)。本發(fā)明人自己的初步數(shù)據(jù)也顯示，與正常皮膚相比腫瘤中mtDNA缺失的數(shù)目增加。最后,Birch-Machin及其他人已顯示,mtDNA缺失以及復(fù)制的發(fā)生率隨 UV 照射的增加而提高(Berneburg 等 1999 ;Birch_Machin 等 1998 ；Ray 等 1998 ；Ray等 1999 ;Ray 等 2000), Lindsey 等，2001 ;Birch_Machin 等，2001 ;Lowes 等，2002, Krishnan等，2002)。
[0027]除了與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的問題之外，最近在人類腫瘤中的mtDNA研究在很大程度上也沒有回答其他重要問題(Habano等1998 ；Fiiss等2000)。首先，由于技術(shù)的局限性，mtDNA突變是否真的是同質(zhì)的還不清楚，因?yàn)樽兓漠愘|(zhì)性水平也可指示重要的疾病轉(zhuǎn)換(Habano 等 1998 ;Polyak 等 1998 ;Fliss 等 2000);其次，除了一個(gè)研究以外(Tamura 等1999)，還未研究過mtDNA缺失的發(fā)生率及其作為匪SC的潛在生物標(biāo)志物的作用。研究者們研究了常見的缺失并忽視了剩余的約100個(gè)缺失。此外，研究者們著眼于突變的鑒定，而非對(duì)其定量。以定量方式精確評(píng)估缺失的發(fā)生率是很重要的，因?yàn)閙tDNA損傷對(duì)ATP產(chǎn)生以及由此引起的細(xì)胞功能具有閾值效應(yīng)。另外，缺失很難于表征。
[0028]通常使用長PCR，其產(chǎn)生隨后需要表征的缺失梯狀條帶。
[0029]現(xiàn)有的匪SC診斷是對(duì)切除組織的病理評(píng)估。因此，需要使個(gè)體易感于WSC的UV所誘發(fā)DNA損傷的早期標(biāo)記物。還需要基于遺傳學(xué)的診斷工具，其允許進(jìn)行早期檢測(cè)，并具有診斷精確性。
[0030]前列腺癌
[0031]前列腺癌是經(jīng)常被診斷出的實(shí)體瘤，非?？赡軄碓从谇傲邢偕掀?Huang等
1999)。在1997年，對(duì)近一千萬美國男性篩選了前列腺特異性抗原(PSA)，其存在提示患有前列腺癌(Woodwell，1999)。事實(shí)上，這表明通過初步的直腸指檢(DRE)會(huì)篩選出更大數(shù)目的男性。同一年，三千一百萬男性進(jìn)行了 DRE(Woodwell，1999)。此外，美國每年新診斷出的前列腺癌病例數(shù)目估計(jì)為179，000 (Landis等，1999)。它是加拿大男性中第二最常診斷出的癌癥以及導(dǎo)致癌癥死亡的第二主因。在1997年，前列腺癌在加拿大男性新診斷出的癌癥中占19，800例(28% )(加拿大國家癌癥研究所)。據(jù)估計(jì)，所有49歲以上的男性中30%至40%具有一些癌性前列腺細(xì)胞，然而這些男性中只有20%至25%有臨床顯著形式的前列腺癌(SpringNet-CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/i803a.htm) ? 前列腺癌表現(xiàn)為多種組織學(xué)行為，包括性因素和外在因素，即社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況、飲食、地理環(huán)境、激素失衡、家族史以及遺傳成分(Konishi等1997 ;Hayward等1998)。[0032]就風(fēng)險(xiǎn)的觀點(diǎn)而言，家族性和遺傳性前列腺癌不認(rèn)為是同義術(shù)語。家族性癌癥指在家族內(nèi)發(fā)生，但是不會(huì)遺傳。這種形式占前列腺癌的最多25% (ffalsh&Partin, 1997)。遺傳性指具有易感基因孟德爾遺傳性的前列腺癌亞型，占所報(bào)道病例的約9%。這種疾病的前列腺癌家族史提示這些易感基因在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要的作用。最近，已將I號(hào)和X號(hào)染色體上的易感性基因鑒定為使男性易感于前列腺癌，提供了遺傳性癌癥病因?qū)W深入的了解(Berthon 等 1998 ；Xu 等 1998)。
[0033]前列腺癌預(yù)后主要依賴于診斷時(shí)的腫瘤階段和分級(jí)。只有局部前列腺癌能夠通過放射性治療被治愈。標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)仍依賴于直腸指檢、PSA檢測(cè)和對(duì)前列腺活檢組織的組織病理學(xué)檢查?；顧z用于確認(rèn)惡性，這不是一種早期檢測(cè)技術(shù)。不幸的是，一些早期腫瘤不可能在直腸檢查中鑒定出來。PSA檢測(cè)的特異性為60%至70%，靈敏度為70%至80%(personal communication,Dr.Sunil Gulavita,Northwestern Ontario Cancer Centre)。改善普通組織學(xué)分級(jí)腫瘤的診斷的一種較新技術(shù)是使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性DNA分析(Shankey等1995);然而，該技術(shù)測(cè)量僅在癌癥發(fā)展后期顯現(xiàn)的染色體變化，對(duì)于早期癌癥中DNA結(jié)構(gòu)的小變化或染色體倒位或交互易位不夠靈敏。本發(fā)明著眼于早期檢測(cè)，因?yàn)轭A(yù)后嚴(yán)重依賴于診斷時(shí)疾病階段。
[0034]我們對(duì)于前列腺癌中的遺傳異常的認(rèn)識(shí)并不夠。對(duì)于前列腺癌的研究著眼于以下領(lǐng)域認(rèn)識(shí)的發(fā)展:1)原癌基因(Buttyan等1987) ；2)腫瘤抑制基因(p53、p73、KAll和MMACI/PTEN ;Dong等1995 ;Cairns等1997)以及3)端粒/端粒酶在轉(zhuǎn)移中的活性。前列腺細(xì)胞中端粒酶的上調(diào)和端粒DNA的擴(kuò)增可以提供有效的診斷標(biāo)志物。而且，端?？勺鳛橹委熚稽c(diǎn)(Ozen等1998)。許多小組已證實(shí)了 I號(hào)染色體短臂中的“前列腺癌基因”(Berthon等1998)。需要更多的工作來鑒定該區(qū)域內(nèi)的特異性基因座。已經(jīng)提出，該標(biāo)志物僅是使男性易感于家族性前列腺癌的若干可能基因之一。其他研究已顯示了 X號(hào)染色體上可能的標(biāo)志物基因座(Xu等1998)。如果某些前列腺癌是多基因的，那么mtDNA將成為重要的診斷工具，因?yàn)樵谶@樣的情況下鑒定和了解所有相關(guān)核基因之間的互作是很困難的。
[0035]當(dāng)然，前列腺癌 研究中的關(guān)鍵問題是鑒定能有效確定和區(qū)分腫瘤發(fā)展的分子標(biāo)記物。分子標(biāo)志物能夠在前列腺癌病例中區(qū)分出將迅速發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病的以及幾乎不會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的情況。分子標(biāo)志物或突變的比較能確定腫瘤途徑是潛伏性的還是攻擊性的。直至本研究都主要著眼于核基因組中所隱藏的秘密；然而，小得多的mtDNA基因組看來是作為細(xì)胞核中事件的晴雨表，從而提供了早期檢測(cè)人類前列腺癌的手段(Zeviani等1990)。重要的是，在這方面中，由于其在凋亡和腫瘤生物學(xué)其他方面中的作用，線粒體已經(jīng)與癌癥發(fā)生過程相聯(lián)系(Green&Reedl998)。具體地，已在許多人類腫瘤中觀察到mtDNA的體細(xì)胞突變(Polyak等1998，Tamura等1999，F(xiàn)liss等2000)。然而，先前的研究完全是橫斷式的(cross-sectional),因?yàn)樗鼈兾纯紤]母系中mtDNA的無性系性質(zhì)。這些有限的橫斷研究僅顯示在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的突變。這可能給出在突變和相應(yīng)疾病狀態(tài)之間的準(zhǔn)確聯(lián)系，也可能不能給出。應(yīng)用母系的橫斷式研究具有隨時(shí)間跟蹤mtDNA中突變的優(yōu)點(diǎn)，從而模擬了縱向設(shè)計(jì)的能力。是常見種群變體的突變以及與其相對(duì)的疾病相關(guān)突變均能夠被鑒定。
[0036]衰老
[0037]衰老由累積的分子和細(xì)胞水平上隨時(shí)間的變化組成；然而，衰老過程背后的特定分子機(jī)制還有待闡明。為了嘗試解釋衰老過程，將來自較年老受試者的線粒體基因組與同一母系譜系中較年輕受試者的線粒體基因組進(jìn)行比較。與衰老有關(guān)的一個(gè)缺失稱為普遍缺失或4977-bp缺失。衰老研究局限于該普遍缺失以及控制區(qū)中的多態(tài)性。為了清楚地了解這些突變，必須分析整個(gè)基因組。其他缺失參見表1，改自Wei，1992。
[0038]表1
[0039]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失的方法，其中所述缺失與皮膚癌和/或UV照射有關(guān)，所述方法包括檢測(cè)生物樣品的mtDNA中所述缺失的存在情況。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品是來自受試者的皮膚樣品。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品是組織培養(yǎng)樣品。
4.權(quán)利要求3的方法，其還包括在檢測(cè)所述缺失的存在情況的步驟前將所述組織培養(yǎng)樣品暴露于至少一個(gè)亞致死劑量的紫外線輻射(UVR)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中將所述生物樣品暴露于一系列重復(fù)性亞致死劑量的UVR。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述系列包括將所述生物樣品暴露于日劑量的UVR。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述UVR來自模擬太陽的UVR源。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述UVR包含UVA、UVB或UVA/UVB。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法用于檢測(cè)皮膚癌。
10.用于測(cè)定累積性UV照射的方法，所述方法包括在生物樣品中檢測(cè)跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失的存在情況。
11.用于監(jiān)測(cè)臨床UV光療方案的長期安全性的方法，所述方法包括在生物樣品中檢測(cè)跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失的存在情況。
12.用于監(jiān)測(cè)日光照射或相關(guān)的非黑色素瘤皮膚癌(匪SC)的方法，所述方法包括在經(jīng)一段時(shí)間間隔獲得的生物樣品中檢測(cè)跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失的存在情況。
13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述缺失為約3895bp。
14.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述缺失包含從D-環(huán)中的mtTFl結(jié)合位點(diǎn)左右至tRNA甲硫氨酸的mtDNA段。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述缺失基本上包含12srRNA基因、16s rRNA基因、NDl基因以及用于H和L鏈轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
16.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)mtDNA中所述缺失的存在情況的步驟包括擴(kuò)增所述mtDNA。
17.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)mtDNA中所述缺失的存在情況的步驟包括選自以下的PCR分析:缺失特異性PCR分析，放射性PCR分析，定量PCR，實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)分析或使用重組、熱穩(wěn)定Taq DNA聚合酶的RT-PCR。
18.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)mtDNA中所述缺失的存在情況的步驟包括使用跨過mtDNA接合處的引物的PCR分析，所述接合處由跨越約547至4443位核苷酸的所述缺失形成。
19.權(quán)利要求17的方法，其中使用跨過mtDNA接合處的PCR引物進(jìn)行所述PCR分析，所述接合處由跨越約547至4443位核苷酸的所述缺失形成。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述PCR分析是定量PCR分析，其包括使用跨過mtDNA接合處的引物，所述接合處由跨越約547至4443位核苷酸的所述缺失形成。
21.權(quán)利要求17的方法，其中使用具有根據(jù)SEQID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ IDNO:151或SEQ ID NO:152之核酸序列的引物檢測(cè)所述缺失。
22.權(quán)利要求2的方法，其中所述生物樣品來自非損傷皮膚。
23.權(quán)利要求2的方法，其中所述生物樣品來自所述受試者的真皮或表皮層。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品包括偶爾接受日光照射的組織、經(jīng)常接受日光照射的組織或幾乎不接受日光照射的組織。
25.權(quán)利要求24的方法，其還包括比較所述生物樣品與參照樣品中所述缺失的存在情況的步驟。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述參照樣品是:幾乎不接受日光照射的組織、偶爾接受日光照射的組織、經(jīng)常接受日光照射的組織或血液樣品。
27.跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失在檢測(cè)生物樣品的UV損傷中的用途。
28.權(quán)利要求27的用途，其中所述生物樣品是皮膚樣品或組織培養(yǎng)樣品。
29.跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失作為用于皮膚癌或UV損傷的生物標(biāo)記物的用途。
30.包含一個(gè)或更多個(gè)核酸成員以及固體基質(zhì)的陣列，其中至少一個(gè)所述核酸成員具有特異性結(jié)合人mtDNA片段的核酸序列，所述片段具有跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失，并且其中所述至少一個(gè)核酸成員在所述陣列上具有獨(dú)有的位置且與所述固體基質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合。
31.權(quán)利要求30的陣列，其中所述至少一個(gè)核酸成員是核酸探針。
32.權(quán)利要求31的陣列，其中所述核酸探針具有根據(jù)SEQID NO:153的核酸序列。
33.用于檢測(cè)與皮膚癌、UV損傷`或非黑色素瘤皮膚癌(匪SC)相關(guān)的mtDNA缺失的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)所述的陣列以及選自以下的至少一種成員:固體支持物、支持所述固體支持物的手段、提取線粒體DNA的手段、引物、試劑和說明書。
34.用于診斷皮膚癌、UV損傷或非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)的試劑盒，所述試劑盒包含用于擴(kuò)增mtDNA區(qū)段的至少一種引物，所述區(qū)段包含跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失。
35.權(quán)利要求34的試劑盒，其中所述至少一種引物具有根據(jù)SEQID NO:145、SEQ IDNO: 146、SEQ ID NO:151 或 SEQ ID NO:152 的核酸序列。
36.用于診斷皮膚癌、UV損傷或非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)的試劑盒，所述試劑盒包含特異性結(jié)合人mtDNA片段的核酸探針，所述片段具有跨越人mtDNA基因組劣弧中約547至4443位核苷酸的缺失。
37.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述核酸探針具有根據(jù)SEQID NO:153的核酸序列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103789405SQ201310399746
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2005年4月18日
【發(fā)明者】瑞安·帕爾, 羅伯特·塞耶, 加百利·道庫博, 珍妮弗·克里德, 克里·魯賓遜, 安德烈婭·馬格拉, 布賴恩·賴古伊, 安德烈·哈博特爾, 馬克·比爾克-馬金 申請(qǐng)人:米托米克斯公司