一種具有鎮(zhèn)痛作用的可穿膜多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有鎮(zhèn)痛作用的可穿膜多肽。該多肽是a）-c）中任一所示的多肽：a）氨基酸序列如序列表中序列1第10-25位氨基酸殘基所示的多肽；b）氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；c）對(duì)a）或b）所示的多肽進(jìn)行如下突變得到的具有1）-3）中至少一種作用的衍生多肽：將序列表中序列1的第10-25位氨基酸殘基中除序列1的第12位的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加：1）預(yù)防和/或治療疼痛；2）干擾肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白的磷酸化；3）降低瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1的功能。該多肽可用于預(yù)防和/或治療疼痛。
【專利說(shuō)明】—種具有鎮(zhèn)痛作用的可穿膜多肽
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種具有鎮(zhèn)痛作用的可穿膜多肽。
【背景技術(shù)】
[0002]生理?xiàng)l件下的疼痛可以作為機(jī)體對(duì)于身體損害的一種預(yù)警系統(tǒng)，引起機(jī)體的防御性保護(hù)反應(yīng)。但在一些病理?xiàng)l件下可以產(chǎn)生慢性的病理性疼痛，對(duì)機(jī)體而言卻構(gòu)成一種難以忍受的折磨。因而，疼痛作為一種疾病，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人們?nèi)粘９ぷ魃罴吧尜|(zhì)量的一大危害。隨著生活節(jié)奏的加快和社會(huì)老齡化的到來(lái)，各種疼痛疾病尤其慢性炎癥性疼痛的發(fā)病率約來(lái)越高。然而由于慢性病理性痛的病因復(fù)雜，分子機(jī)制和病理生理過(guò)程未被完全了解，故而尚缺乏有效而特異的治療手段。
[0003]關(guān)于疼痛的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為主要是由外周敏化和中樞敏化所致。很多因素參與了痛覺敏化的產(chǎn)生和維持，如多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、蛋白激酶和離子通道等，最終導(dǎo)致突觸傳遞效能的增強(qiáng)，敏化的產(chǎn)生。痛覺敏化可以發(fā)生于兩個(gè)水平，即轉(zhuǎn)錄后水平的修飾和轉(zhuǎn)錄水平的改變，分別介導(dǎo)了早期和長(zhǎng)期的痛覺敏化。但迄今為止，尚沒(méi)有任何一個(gè)因素可以完全解釋痛覺敏化的形成機(jī)制，而是細(xì)胞內(nèi)的各個(gè)信使分子之間通過(guò)相互作用、相互制約，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)，共同參與痛覺敏化的產(chǎn)生。在這個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中，無(wú)論是轉(zhuǎn)錄后水平的修飾還是轉(zhuǎn)錄水平的改變，蛋白質(zhì)磷酸化均起著核心作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種蛋白激酶，如 PKA (protein kinase A), PKC (protein kinase C), CaMK (calcium/calmodulindependent protein kinase), PI3K(phosphatidylinositol3kinase), ERK(extraceIIuarsignal regulated kinase)等，既可以通過(guò)磷酸化離子通道、受體等參與早期痛覺敏化的調(diào)控，也可以通過(guò)調(diào)控痛覺傳導(dǎo)中關(guān)鍵分子的轉(zhuǎn)錄參與長(zhǎng)期痛覺敏化的調(diào)控。因此，如果確定某些蛋白激酶參與疼痛傳導(dǎo)及痛覺調(diào)制，進(jìn)而找到發(fā)揮作用的靶蛋白，并且通過(guò)確定其磷酸化位點(diǎn)或關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域，即可據(jù)此開發(fā)一些特異性較強(qiáng)且副作用較小的鎮(zhèn)痛藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防和/或治療疼痛的多肽及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療疼痛的多肽，名稱為TAT-S3，為a) -c)中任一所示的多肽:
[0006]a)氨基酸序列如序列表中序列I第10-25位氨基酸殘基所示的多肽；
[0007]b)氨基酸序列如序列表中序列I所示的多肽；
[0008]c)對(duì)a)或b)所示的多肽進(jìn)行如下突變得到的具有I) -3)中至少一種作用的衍生多肽:將序列表中序列I的第10-25位氨基酸殘基中除序列I的第12位之外的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加；
[0009]所述I)-3)為:
[0010]I)預(yù)防和/或治療疼痛；
[0011]2)干擾肌動(dòng)蛋白解聚因子/切絲蛋白(ADF/cofilin)的磷酸化；[0012]3)降低瞬時(shí)受體電位香草酸亞型I的功能。
[0013]其中，序列表的序列I由25個(gè)氨基酸殘基組成，序列I的第1-9位氨基酸殘基組成具有穿透細(xì)胞膜作用的區(qū)域，該區(qū)域可以被具有相同作用的其它序列替換；序列I的第10-25位氨基酸殘基構(gòu)成可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞內(nèi)LIMK (LIM motif-containing proteinkinase, LIMK)對(duì)肌動(dòng)蛋白解聚因子/切絲蛋白cofilin的第3位絲氨酸(Ser_3)磷酸化的區(qū)域，其中，序列I的第12位絲氨酸為UMK的磷酸化位點(diǎn)(即拮抗內(nèi)源性Ser-3磷酸化的位點(diǎn))。
[0014]其中，b)所示的多肽是對(duì)a)所示的多肽進(jìn)行如下突變得到的具有所述I) -3)中至少一種作用的多肽:在a)所示的多肽的氨基端添加序列I的第1-9位的9個(gè)氨基酸殘基。在實(shí)際應(yīng)用中，也可以對(duì)a)所示的多肽進(jìn)行如下突變得到具有所述1)-3)中至少一種作用的多肽:保證序列表中序列I的第12位氨基酸殘基不變，將序列I的第10-11位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)以上的缺失，將序列I的第13-25位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)以上的添加；或者保證序列表中序列I的第12位氨基酸殘基不變，將序列I的第10-11位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)以上的添加，將序列I的第13-25位氨基酸殘基進(jìn)行一個(gè)以上的缺失。
[0015]編碼上述任一所述多肽的核酸分子(DNA或RNA)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述核酸分子具體可為上述任一所述多肽的編碼基因。含有編碼上述任一所述多肽的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(非動(dòng)植物繁殖材料)或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]上述任一所述多肽和/或編碼所述多肽的核酸分子在制備預(yù)防和/或治療疼痛的產(chǎn)品中的應(yīng)用以及以上述任一所述多肽和/或編碼所述多肽的核酸分子為活性成分的預(yù)防和/或治療疼痛的產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017]以上述任一所述多肽和/或編碼所述多肽的核酸分子為活性成分制成的干擾肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白(cofilin)的磷酸化的產(chǎn)品和/或降低瞬時(shí)受體電位香草酸亞型I的功能的產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]上文中，所述疼痛可為炎癥性疼痛。
[0019]所述預(yù)防和/或治療疼痛可體現(xiàn)為緩解痛覺敏化。所述緩解痛覺敏化具體可為緩解炎性痛覺敏化，如緩解炎性熱痛覺敏化。
[0020]上述產(chǎn)品具體可為藥物。
[0021]需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑和穩(wěn)定劑等。
[0022]本發(fā)明的藥物可以制成注射液、干粉針劑、片劑或粒劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
[0023]TAT-S3能夠干擾肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白(cofilin)的磷酸化，降低瞬時(shí)受體電位香草酸亞型I的功能，能緩解炎性熱痛覺敏化，可用于預(yù)防和/或治療疼痛。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為體外激酶實(shí)驗(yàn)以及western blot結(jié)果
[0025]圖2為TAT-S3及對(duì)照肽TAT-S3A的序列。[0026]圖3為蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3p印tide對(duì)大鼠體內(nèi)cofilin的磷酸化的影響。
[0027]圖4為蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3對(duì)TRPVl的功能的影響
[0028]圖5為蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3對(duì)CFA誘導(dǎo)的大鼠熱痛覺敏化程度的影響。
[0029]圖6為蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3不影響大鼠炎癥對(duì)側(cè)的熱痛覺敏化程度。
[0030]圖7為TAT-S3A沒(méi)有鎮(zhèn)痛或是促進(jìn)痛覺敏化的作用。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實(shí)施例中采用的數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)如下:
[0033]實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism5.01版軟件分析，以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean土SEM)表示。圖1、3、5所示柱狀圖中兩組比較使用非配對(duì)t檢驗(yàn)(unpaired t Test)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)以及鈣成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用雙因素方差分析(two-way AN0VA),并用Bonferroniposttests進(jìn)行檢驗(yàn)。以p〈0.05作為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。Western blot結(jié)果采用Quantity One (Bio-Rad)圖像分析軟件進(jìn)行光密度測(cè)量。
[0034]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035]下述實(shí)施例中的大鼠均為健康雄性SD大鼠，初始體重160_180g。
[0036]下述實(shí)施例中的TAT-S3溶液、TAT-S3A溶液均用無(wú)菌生理鹽水作為溶劑配制。
[0037]實(shí)施例1、TAT-S3的功能實(shí)驗(yàn)
[0038]1、TAT_S3peptide 的設(shè)計(jì)
[0039]LIMK(LIM motif-containing protein kinase, LIMK)蛋白激酶家族是一種絲氨酸蛋白激酶，僅包含LMKl和UMK2兩個(gè)成員。兩成員的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)特征相同，均包含N端的兩個(gè)連續(xù)的LIM結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，以及C端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，在PDZ結(jié)構(gòu)域以及蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中間還有一段絲氨酸/脯氨酸富集區(qū)。自UMKl和UMK2發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們對(duì)其在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能研究多集中在對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)UMK可以通過(guò)磷酸化cofilin調(diào)控生長(zhǎng)錐的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)以及神經(jīng)突起的延伸，參與各種刺激誘導(dǎo)的神經(jīng)元導(dǎo)向生長(zhǎng)。有許多證據(jù)提示LMK可能參與痛覺敏化的調(diào)控:UMK1的mRNA在神經(jīng)系統(tǒng)有著很高水平的表達(dá)，特別是在痛覺信號(hào)傳導(dǎo)中的兩個(gè)關(guān)鍵部位DRG (dorsal root ganglion, DRG)和脊髓，LMK2的mRNA在神經(jīng)系統(tǒng)也有分布；UMK1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出樹突棘形態(tài)的異常以及突觸功能的受損，而UMKl和UMK2雙基因敲除的小鼠則表現(xiàn)為突觸功能更為嚴(yán)重的受損，抑制齒狀回cofilin的磷酸化也可以干預(yù)晚期長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(late phase long termpotentiation, L-LTP);用凝血酶刺激可以引起血小板內(nèi)LIMKl的激活,而凝血酶受體PAR(protease-activated receptor, PAR)則可以通過(guò)多種機(jī)制參與痛覺敏化的調(diào)控；用NGF刺激PC12細(xì)胞可以引起UMKl的快速激活以及UMK2活性的緩慢上升，而NGF恰恰是炎癥痛中發(fā)揮重要作用的一種致炎因子；細(xì)胞骨架可能通過(guò)錨定在它們上面的蛋白激酶參與慢性痛的調(diào)控。
[0040] LIMK只有一種經(jīng)典的作用底物，即肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白cofilin。LIMK可以通過(guò)磷酸化cofilin第三位絲氨酸調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架的聚合狀態(tài)，從而廣泛參與到細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、形態(tài)發(fā)生、分裂、分化、凋亡、神經(jīng)突起生長(zhǎng)以及腫瘤發(fā)生等過(guò)程中。[0041]本課題組的研究表明，在完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)的炎癥痛中，UMK能夠通過(guò)磷酸化其經(jīng)典底物cofilin，調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架的聚合狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)TRPVl——感受傷害性刺激的重要分子整合器的功能，繼而參與炎性熱痛覺敏化的發(fā)生乃至維持。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了一段可以干擾LMK對(duì)cof i I in的Ser-3磷酸化的可穿膜融合肽TAT-S3。
[0042]其中，如下實(shí)驗(yàn)證實(shí)UMK是通過(guò)磷酸化cofilin參與炎性熱痛覺敏化的的調(diào)控。
[0043]局部炎癥是疼痛發(fā)生最常見的原因。目前國(guó)際上常用的慢性炎癥痛動(dòng)物模型有Butler所創(chuàng)的單發(fā)性佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型和足底注射CFA所致的大鼠炎癥痛模型，它們均是以弗氏佐劑作為致炎劑，后者疼痛指標(biāo)的檢測(cè)相對(duì)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，因而較前者更為常用。
[0044]慢性痛可產(chǎn)生痛覺超敏，主要表現(xiàn)為兩種癥狀:自發(fā)痛和誘發(fā)痛。誘發(fā)痛可分為兩種:熱痛覺敏化和機(jī)械痛敏或稱觸誘發(fā)痛。本申請(qǐng)選用足底注射CFA所致的大鼠炎癥痛模型，注射后大鼠足底局部出現(xiàn)紅腫熱痛現(xiàn)象，其它狀態(tài)均良好。分別取正常大鼠(Naive)及足底注射CFA后0.5h，lh, 2h，6h和Id的大鼠的給藥同側(cè)L4-L6DRG，提取總蛋白后進(jìn)行體外激酶活性實(shí)驗(yàn)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及western blot實(shí)驗(yàn)。
[0045]結(jié)果如圖1顯示，炎癥同側(cè)DRG中UMKl的激酶活性正常狀態(tài)下相對(duì)較低，在CFA注射后迅速增加，在Ih達(dá)到高峰，并在此后回落，但從2h至Id仍然維持在一個(gè)相對(duì)較高的水平。Western blot的結(jié)果表明，在整個(gè)過(guò)程中，LIMKl的蛋白表達(dá)水平是基本不變的(圖1 中 a)。
[0046]LIMK2則在CFA注射后0.5h即達(dá)到活性高峰，并于此后迅速回落。在整個(gè)炎癥過(guò)程中，LIMK2的蛋白表達(dá)水平也是基本保持不變的(圖1中b)。
[0047]如前文所述，UMK在CFA誘導(dǎo)的炎癥痛過(guò)程中發(fā)生了激活，因此我們推測(cè)UMK的最經(jīng)典的底物cofilin的第三位絲氨酸的磷酸化程度可能發(fā)生相應(yīng)的變化。Western blot的結(jié)果顯示，cofilin的磷酸化水平在CFA注射后0.5h即迅速增加，并于Ih達(dá)到高峰，此后一直到Id仍然保持在較高的水平(圖1中C)，其變化規(guī)律與UMKl和UMK2的激酶活性變化相符合，這提示UMK是通過(guò)磷酸化其經(jīng)典底物cofilin來(lái)調(diào)控炎性熱痛覺敏化過(guò)程的。
[0048]為了進(jìn)一步在體研究cofilin第三位絲氨酸的磷酸化對(duì)于UMK在炎性熱痛覺敏化過(guò)程中的作用的影響，針對(duì)Ser-3位點(diǎn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了可干擾其磷酸化的可穿膜融合肽——TAT-S3(TAT-S3p印tide)，將TAT-S3的Ser_3被丙氨酸所取代，得到對(duì)照肽TAT-S3A(TAT-S3A peptide))。
[0049]2、TAT_S3 的制備
[0050]TAT-S3的序列是序列表中的序列I，對(duì)照肽TAT-S3A的序列是序列表中的序列2(如圖2所示)。
[0051]TAT-S3和TAT-S3A均采用固相多肽合成法(Fmoc法)由羧基端向氨基端方向合成。合成的多肽采用高效液相色譜進(jìn)行純化得到純度為> 98%的TAT-S3和TAT-S3A。純化的TAT-S3和TAT-S3A經(jīng)質(zhì)譜鑒定，TAT-S3的氨基酸序列如序列表中序列I所示；TAT_S3A的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0052]3、TAT_S3 的功能
[0053]3.1TAT-S3 干擾 cofilin 的磷酸化
[0054]在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔插管后5d鞘內(nèi)給予TAT-S3或TAT-S3A半小時(shí)后，左側(cè)足底注射100 μ 125%CFAlh后提取L4、L?RG總蛋白，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白(cofilin)的磷酸化水平，結(jié)果如圖3顯示，鞘內(nèi)給予TAT-S3后能夠很好的降低cofilin在CFA誘導(dǎo)的炎癥痛中的磷酸化水平(**p=0.0048, n=6 (每組6只SD大鼠))，而對(duì)于cofilin的總蛋白量卻沒(méi)有影響。由此可見，在體內(nèi)，構(gòu)建的可穿膜融合肽TAT-S3能夠很好的干擾cofilin的磷酸化。圖3中，p-cofilin為磷酸化的cofilin, cofilin為cofilin的總蛋白量。
[0055]其中，使用到的實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0056]A、組織總蛋白的提取
[0057]I)動(dòng)物斷頭，迅速分離兩側(cè)L4、L5DRG, -80°C保存；
[0058]2)單側(cè)DRG加入200 μ I上述組織裂解液，組織勻漿器(Pellet Pestler?Motor, Rontes)研磨,研磨充分后分別補(bǔ)加200 μ I裂解液,4?混懸Ih ；
[0059]3) 40C 12，000gX 5min離心，分離組織碎片，取上清即為總蛋白提取物。
[0060]B、體外激酶活性實(shí)驗(yàn)(Kinase Assay)
[0061]I)提取DRG總蛋白。
[0062]2)珠子(protein A-Sepharose CL-4, Amersham Pharmacia, CAT#17-5280)每管30 μ 1，用PBS洗3次，與UMKl或UMK2抗體共同孵育，抗體終濃度為1:50，4°C孵育3h以上。
[0063]3)通過(guò) BCA 方法定量(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA),每個(gè)樣品取400-500 μ g蛋白，珠子和抗體的混合液等體積加入到每個(gè)樣品中，終體積用裂解液補(bǔ)至400μ 1，4°C孵育過(guò)夜。
[0064]4)用0.l%Triton X-100/1 XTBS洗珠子4次，每次lml。用激酶反應(yīng)緩沖液(無(wú)DTT、純化的底物蛋白及同位素)洗珠子2次，每次lml。
[0065]5)收集珠子，用 25-30 μ I 激酶反應(yīng)緩沖液(Tris-HCl (ρΗ7.6) 20mM，MgCl220mM,DTT0.1mM, [gamma_32Ρ]ΑΤΡ10μ Ci/50y 1，純化的底物蛋白)重懸珠子，30°C水浴 30min。
[0066]6)加入6X上樣緩沖液煮樣品5min,冰浴5min后離心上樣。
[0067]7) SDS-PAGE (10%)電泳。
[0068]8)電泳后染膠，脫色，干膠過(guò)夜。
[0069]9)暗室壓片，_80°C冰箱放置合適的時(shí)間，放射自顯影。
[0070]C蛋白質(zhì)免疫印跡分析(Western Blot)
[0071]I)先配分離膠溶液(10%或12%) 10ml，加入兩玻璃板之間，用蒸餾水沖凈未聚合的聚丙烯酰胺。配制濃縮膠液(5%) 4ml，注入分離膠上端。
[0072]2)膠凝后，拔去梳子，沖洗點(diǎn)樣孔，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，上槽液浸過(guò)凝膠。
[0073]3)按次序上樣。
[0074]4)恒壓電泳(80V)，當(dāng)樣品到達(dá)分離膠與濃縮膠分界線時(shí)，將電壓換成120V，至染料到達(dá)凝膠底部。
[0075]5)將凝膠放入轉(zhuǎn)膜液中，室溫洗膠20min。
[0076]6)剪一張與凝膠大小相等的 NC(nitrocellulose, NC)膜(Pall GelmanLaboratory, USA)和六張3MM濾紙(Whatman，UK)，4°C浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中待用。轉(zhuǎn)膜緩沖液置4°C預(yù)冷。[0077]7)將三張濾紙、NC膜、凝膠和另外三張濾紙按正極向負(fù)極依次疊放在轉(zhuǎn)移盤上，驅(qū)除氣泡。于室溫恒流轉(zhuǎn)膜(150mA) 1.5-2h。
[0078]8)封閉:將NC膜放入封閉液中，置于搖床室溫下lh。
[0079]9)加入一抗(封閉液稀釋)(cofilin 抗體(1: 100，sc-33779; Santa CruzBiotechnology)或 p-cofilin 抗體(1:2000，sc-12912-R/sc_21867-R;Santa CruzBiotechnology)或 GAPDH 抗體(1:2000, CW0100;CoWin Biotech C0., Ltd.)，4°C 孵育過(guò)夜。其中，GAPDH蛋白的表達(dá)量為內(nèi)參。
[0080]10)室溫下用TBST漂洗NC膜3次，每次5min。
[0081]11)加入HRP標(biāo)記的二抗(中杉公司，進(jìn)口分裝)，室溫孵育lh。
[0082]12)室溫下用TBST漂洗NC膜4次，前兩次5min，后兩次lOmin。
[0083]化學(xué)發(fā)光液A、B 液等量混合(Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA.sc-2048)孵育l-2min,暗室曝光。
[0084]3.2蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3能夠減弱DRG神經(jīng)元上TRPVl的功能
[0085]UMK是通過(guò)磷酸化其經(jīng)典底物cofilin，調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架的聚合狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)TRPVl的功能,繼而參與炎性熱痛覺敏化的發(fā)生乃至維持。那么，干擾cofilin的磷酸化是否會(huì)影響TRPVl的功能呢？我們?cè)诖笫笾刖W(wǎng)膜下腔插管后5d鞘內(nèi)給予30 g TAT-S3或是TAT-S3A，0.5h后足底給予25%CFA，給予CFAlh時(shí)急性分離L4、L?RG神經(jīng)元，貼壁1-1.5h后Fura-2AM孵育40min_lh，恢復(fù)之后進(jìn)行鈣成像檢測(cè)。結(jié)果如圖4，相對(duì)于對(duì)照肽TAT-S3A，DRG神經(jīng)元經(jīng)TAT-S3處理對(duì)辣椒素(Cap)的反應(yīng)性明顯降低。這說(shuō)明TAT-S3干擾cofilin的磷酸化可明顯降低TRPVl的功能。*#p〈0.0001，n=44-48 (每組44-48個(gè)神經(jīng)元)，雙因素方差分析(two-way AN0VA),并用 Bonferroni posttests 進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0086]其中，該實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0087]A主要試劑和溶液的配置
[0088]DMEM 培養(yǎng)液:DMEM 固體培養(yǎng)基(Gibco-BRL, USA) 13.48g 溶于 800ml ddH20 中，用3.7g NaHCOjjf pH值至7.2-7.4，定容至1L。0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0089]0.25%胰酶:稱取0.625g胰酶(Sigma)溶于200ml DMEM培養(yǎng)液中，定容至250ml，
0.22 μ m微孔小濾器過(guò)濾除菌。
[0090]3mg/ml膠原酶:稱取0.75g膠原酶(Sigma)溶于200ml DMEM培養(yǎng)液中，定容至250ml, 0.22 μ m微孔小濾器過(guò)濾除菌。
[0091 ]細(xì)胞外液:秤取 7.605g NaCl，0.3725g KCl，0.272g KH2PO4,0.094gMgCl2, 0.2775gCaCl2, 1.8g glucose 和 2.38g HEPES 溶于 800ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值至 7.2，Sucrose調(diào)滲透壓至300m0sm，定容至1L。0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0092]多聚賴氨酸(poly-D-lysine,PDL): 0.5mg/ml (Sigma-Aldrich)。
[0093]Fura-2AM:儲(chǔ)存濃度 ImM(Invitrogen)。
[0094]辣椒素(Capsaicin):溶于DMS0,儲(chǔ)存濃度 100mM(Enzo Life Sciences)。
[0095]PBS:NaC18g, Na2HPO4.12Η202.08g, KC10.2g, KH2PO40.2g 溶于 800ml ddH20 中，調(diào) pH值至7.2-7.4，定容至1L。0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0096]B急性分離DRG神經(jīng)元
[0097]實(shí)驗(yàn)前12h在鈣成像專用培養(yǎng)皿中鋪多聚賴氨酸，37°C孵箱過(guò)夜。高壓所需的器械。12h后吸走多聚賴氨酸(可回收再用)，用高壓過(guò)的蒸餾水洗滌三次，置入超凈臺(tái)吹干。
[0098]鞘內(nèi)插管給藥的SD大鼠在CFA造模后按所需時(shí)間點(diǎn)給予麻藥深麻醉處死，取L4-L6DRG胞體置于1.5ml膠原酶，37 °C，IOOrmp消化50min，吸出膠原酶，加入Iml胰酶，370C，IOOrmp消化IOmin,用500 μ I FBS終止消化，玻璃滴管吹打10-30次，移入15ml離心管，500rmp離心4min，小心吸去上清，加入合適的接種液(含10%FBS的DMEM)，混勻?qū)⒓?xì)胞接種于鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中，置于37°C孵箱中貼壁1-1.5h，進(jìn)行鈣成像實(shí)驗(yàn)。
[0099]C鈣成像
[0100]Loading buffer:用細(xì)胞外液稀釋 Fura_2AM 至 5mM。
[0101]I)用37預(yù)熱含細(xì)胞外液輕洗細(xì)胞兩次；
[0102]2)加入適量37°C預(yù)熱的loading buffer,室溫50min孵育；
[0103]3)棄去loading buffer,用37°C預(yù)熱的細(xì)胞外液輕洗細(xì)胞2次；
[0104]4)加入細(xì)胞外液，室溫恢復(fù)Ih ；
[0105]5)激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)；
[0106]6)觀測(cè)時(shí)程包括:10*10s baseline，給予5μ M辣椒素刺激后觀察30*10s，給予5 μ 110%KC1溶液后觀察30*10s檢測(cè)細(xì)胞活性。
[0107]3.3蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3能夠緩解大鼠的炎性熱痛覺敏化
[0108]本研究組已有的研究表明，UMK是通過(guò)磷酸化其經(jīng)典底物cofilin調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架的聚合狀態(tài)，從而增強(qiáng)TRPVl的功能來(lái)參與CFA誘導(dǎo)的炎癥痛的發(fā)生乃至維持。那么干預(yù)LIMK對(duì)cofilin的磷酸化是否會(huì)影響LIMK介導(dǎo)的炎性熱痛覺敏化的發(fā)生過(guò)程呢？接下來(lái)，我們?cè)贑FA誘導(dǎo)的炎癥痛大鼠模型中選擇通過(guò)干預(yù)cofilin Ser-3的磷酸化進(jìn)而干擾UMK對(duì)TRPVl的調(diào)控的方法來(lái)對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了研究。具體是采用蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3的方法來(lái)觀察其對(duì)大鼠痛行為的影響。
[0109]將濃度均為lmg/ml的TAT-S3溶液和TAT-S3A溶液分別以如下劑量注射大鼠:10 μ g、17 μ g或30 μ g TAT-S3或TAT-S3A注射入SD大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔，之后30min時(shí)，向大鼠左側(cè)足底注射100μ 125%CFA誘導(dǎo)炎癥，并于炎癥發(fā)生lh，2h, 6h, Id時(shí)，利用輻射熱刺激儀測(cè)定大鼠的熱刺激縮足潛伏期(paw withdrawal latency, PWL)。其中，蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3的大鼠為TAT-S3處理組，蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3A的大鼠為TAT-S3A處理組(對(duì)照組)。
[0110]結(jié)果如圖5，在炎癥發(fā)生Ih和2h時(shí)，30μ g和17μ g的TAT-S3處理組的大鼠(在圖5中表示為“TAT-S3”)的熱刺激縮足潛伏期明顯高于TAT-S3A處理組的大鼠(在圖5中表示為“TAT-S3A”，說(shuō)明TAT-S3可緩解CFA引起的熱痛覺敏化并呈現(xiàn)劑量依賴性(給予30 μ gTAT-S3或TAT-S3A的大鼠，組間差異###p=0.0001,n=7 (每組7只SD大鼠)(圖5中A);給予 17μ g TAT-S3 或 TAT-S3A 的大鼠，組間差異 #p=0.0350，n=10_ll(每組 10-11 只 SD 大鼠)(圖5中B);給予10 μ g TAT-S3或TAT-S3A的大鼠，組間差異p=0.6684，n=8_9(每組8-9只SD大鼠)(圖5中C))。在炎癥發(fā)生Ih和2h時(shí)，30 μ g TAT-S3預(yù)處理能顯著延長(zhǎng)大鼠的熱刺激縮足潛伏期(炎癥發(fā)生Ih:TAT-S3預(yù)處理的大鼠的PWL為10.77±2.416s ;TAT_S3A預(yù)處理的大鼠的PWL為4.935±0.5547s ;#p〈0.01。炎癥發(fā)生2h:TAT_S3預(yù)處理的大鼠的PWL為 8.404± 1.645s ;TAT_S3A 預(yù)處理的大鼠的 PWL 為 3.956 ±0.2916s ;*ρ〈0.05)。圖 5 中 A、B、C的曲線下面積(AUC)也表明TAT-S3可明顯緩解CFA引起的熱痛覺敏化(圖5中D )。而對(duì)給予CFA的對(duì)側(cè)炎癥熱痛敏均無(wú)明顯影響(如圖6，A為給予30 μ g TAT-S3或TAT-S3A的大鼠，B為給予17 μ g TAT-S3或TAT-S3A的大鼠，C為給予10 μ g TAT-S3或TAT-S3A的大鼠)，說(shuō)明蛛網(wǎng)膜下腔注射TAT-S3并沒(méi)有影響大鼠的基礎(chǔ)熱敏感性(basal heat sensitivity,即基礎(chǔ)狀態(tài)下對(duì)傷害性熱刺激的反應(yīng)性)。圖5和圖6中，baseline表示給藥前大鼠的基礎(chǔ)熱痛敏，baseline沒(méi)有差異說(shuō)明兩組大鼠沒(méi)有差異。上述統(tǒng)計(jì)均采用雙因素方差分析方法來(lái)計(jì)算兩組間的整體差異，并采用Bonferroni posttests對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)上的組間差異進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0111]然后，又以無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照確定了 TAT-S3A沒(méi)有鎮(zhèn)痛或是促進(jìn)痛覺敏化的作用:在SD大鼠左側(cè)足底注射IOOy 125%CFA誘導(dǎo)炎癥之前30min時(shí)向蛛網(wǎng)膜下腔注射30μ gTAT-S3AC30 μ I濃度為lmg/ml的TAT-S3A溶液)或者是相同體積的無(wú)菌生理鹽水，并于炎癥發(fā)生lh，2h, 6h和Id時(shí)測(cè)定大鼠的PWL。結(jié)果表明炎癥發(fā)生lh，2h, 6h和Id時(shí)，兩種處理大鼠在CFA注射后表現(xiàn)出相同程度的熱痛覺敏化(如圖7，PffL組間無(wú)顯著性差異，p=0.5966。其中，注射TAT-S3A的大鼠7只，注射無(wú)菌生理鹽水的大鼠6只)，說(shuō)明對(duì)照肽(TAT-S3A)本身沒(méi)有鎮(zhèn)痛或是促進(jìn)痛覺敏化的作用。上述統(tǒng)計(jì)均采用雙因素方差分析方法來(lái)計(jì)算兩組間的整體差異，并采用Bonferroni posttests對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)上的組間差異進(jìn)行檢驗(yàn)。圖7中，30 μ I normal saline表示向蛛網(wǎng)膜下腔注射30 μ I無(wú)菌生理鹽水的處理，30 μ g tat_S3Apeptide表示向蛛網(wǎng)膜下腔注射30 μ g TAT-S3A的處理。
[0112]其中，該實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0113]健康雄性SD大鼠，初始體重170_190g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。大鼠均置于鋪墊鋸末的塑料盒內(nèi)，每籠4-5只飼養(yǎng)。給予自然照明，自由飲水和飲食。
[0114]A炎癥痛模型的建立
[0115]采用大鼠左后側(cè)足底皮下注射CFA作為慢性炎癥痛動(dòng)物模型。大鼠用乙醚麻醉，右側(cè)臥位，用75%酒精將左 側(cè)后足底及周圍皮膚消毒，然后注入25%CFA0.1ml，分別于注射后第30分鐘(min)、炎癥發(fā)生1、2、6小時(shí)(h)和I天(d)進(jìn)行行為學(xué)指標(biāo)的測(cè)定。
[0116]B熱誘發(fā)痛縮足潛伏期(paw withdrawal latency, PWL)的測(cè)定
[0117]通過(guò)輻射熱刺激縮足潛伏期(PWL)反映大鼠的炎癥熱痛覺敏化程度。進(jìn)行測(cè)試前將大鼠置于玻璃板上，蓋以透明的有機(jī)玻璃罩(18cmX8cmX8cm)，使大鼠適應(yīng)環(huán)境15min，待大鼠的梳理和探究活動(dòng)基本消失后，開始測(cè)試。測(cè)試時(shí)，將輻射熱燈的焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)大鼠腳掌中心部位，開啟輻射熱燈并開始計(jì)時(shí)，視大鼠出現(xiàn)迅速縮足現(xiàn)象為陽(yáng)性反應(yīng)，大鼠出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)立即關(guān)閉輻射熱燈并停止計(jì)時(shí)。調(diào)整輻射熱的強(qiáng)度使大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)的PWL在10-15秒(sec, s)，如果大鼠刺激30s仍未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，關(guān)閉輻射熱燈，停止計(jì)時(shí)以避免燙傷。每只大鼠重復(fù)測(cè)量5次，每次測(cè)試間隔15min，去除一個(gè)最高值和一個(gè)最低值，剩余三個(gè)值的平均值為其輻射熱縮足潛伏期。
[0118]C蛛網(wǎng)膜下腔插管方法
[0119]SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛(300mg/kg, 1.p.)麻醉，背部剪毛，消毒。觸及T12、T13脊椎棘突交界(腰髓膨大，腰髓L3-L4水平)和髂棘(腰椎骨L4水平)，分別劃?rùn)M線做標(biāo)記，測(cè)量?jī)删€間距離，即為進(jìn)管長(zhǎng)度(對(duì)250g大鼠而言，約3.5-4.0cm)。在髂棘水平正中線縱向劃開皮膚，用一長(zhǎng)約5cm的不銹鋼管作為外套管(外徑0.9mm，前端打磨成斜面，可容PE-10管通過(guò))，在L4和L5脊椎骨間隙垂直刺入椎管(此時(shí)動(dòng)物的尾巴或后肢會(huì)出現(xiàn)輕微抽動(dòng))，改變不銹鋼管方向指向頭端，將PE-1O管(提前用75%酒精消毒，無(wú)菌生理鹽水沖洗)通過(guò)外套管送入蛛網(wǎng)膜下腔至腰髓L3-L4水平，拔除鋼管，褥式縫合，局部固定PE-10管。頸后皮膚剪小口，使PE-10管經(jīng)皮下由此穿出，褥式縫合固定，約外露5cm左右，縫合皮膚。術(shù)后1.p.注射青霉素1萬(wàn)單位以預(yù)防感染。大鼠恢復(fù)4d即可給藥。
【權(quán)利要求】
1.a) -C)中任一所示的多肽: a)氨基酸序列如序列表中序列I第10-25位氨基酸殘基所示的多肽； b)氨基酸序列如序列表中序列I所示的多肽； c)對(duì)a)或b)所示的多肽進(jìn)行如下突變得到的具有I)-3)中至少一種作用的衍生多肽:將序列表中序列I的第10-25位氨基酸殘基中除序列I的第12位的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加； 所述1)-3)為: 1)預(yù)防和/或治療疼痛； 2)干擾肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白的磷酸化； 3)降低瞬時(shí)受體電位香草酸亞型I的功能。
2.編碼權(quán)利要求1所述多肽的核酸分子。
3.含有權(quán)利要求2所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
4.權(quán)利要求1所述的多肽和/或權(quán)利要求2所述的核酸分子在制備預(yù)防和/或治療疼痛的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.一種預(yù)防和/或治療疼痛的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述的多肽和/或權(quán)利要求2所述的核酸分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用或權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述預(yù)防和/或治療疼痛體現(xiàn)為緩解痛覺敏化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或產(chǎn)品，其特征在于:所述緩解痛覺敏化為緩解炎性痛覺敏化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用或產(chǎn)品，其特征在于:所述緩解炎性痛覺敏化體現(xiàn)為緩解炎性熱痛覺敏化。
9.e)或f)所示的應(yīng)用: e)權(quán)利要求1所述的多肽和/或權(quán)利要求2所述的核酸分子在制備干擾肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白的磷酸化的產(chǎn)品中的應(yīng)用； f )權(quán)利要求1所述的多肽和/或權(quán)利要求2所述的核酸分子在制備降低瞬時(shí)受體電位香草酸亞型I的功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.g)或h)所示的產(chǎn)品: g)以權(quán)利要求1所述的多肽和/或權(quán)利要求2所述的核酸分子為活性成分制成的干擾肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白的磷酸化的產(chǎn)品； h)以權(quán)利要求1所述的多肽和/或權(quán)利要求2所述的核酸分子為活性成分制成的降低瞬時(shí)受體電位香草酸亞型I的功能的產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103467570SQ201310399841
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】王韻, 李逸, 陳海靖, 胡芳, 杜怡娟 申請(qǐng)人:北京大學(xué)