一種腫瘤細胞球三維可控圖案化的方法
【專利摘要】一種腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，首先利用負性光刻膠的熱塑性制得半球弧形凹槽模板，經(jīng)過聚二甲基硅氧烷兩次復制翻轉(zhuǎn)成型及特殊抗細胞貼附修飾，得到可用于細胞接種-沉降-聚集成球的聚二甲基硅氧烷微坑芯片；所得細胞球經(jīng)膠原胞外基質(zhì)的包埋，實現(xiàn)細胞球三維基質(zhì)中的圖案化排列。值得注意的是，通過芯片模板設計，可以調(diào)控細胞球圖案化排列，包括細胞球間距、相對位置等參數(shù)。
【專利說明】一種腫瘤細胞球三維可控圖案化的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于模擬腫瘤及其微環(huán)境研究領域，具體涉及一種腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法。

【背景技術】
[0002]傳統(tǒng)腫瘤研究體系多采用二維培養(yǎng)技術，與真實的體內(nèi)三維環(huán)境相差甚遠，由此取得的實驗結(jié)果對于臨床指導存在很大的偏差與局限性。
[0003]為更好地貼近體內(nèi)三維環(huán)境，研究者提出細胞三維成球模型用以代替?zhèn)鹘y(tǒng)二維方式。細胞三維成球方式，常見如“懸滴法”(細胞懸液在重力作用下形成多細胞聚集球體)、細胞-胞外基質(zhì)混合成球法及細胞-三維高聚物支架培養(yǎng)等。將所形成的細胞球包埋于細胞外基質(zhì)以模擬腫瘤微環(huán)境的工作如Truong等人利用微孔注射器將細胞球定點注入膠原內(nèi)部，觀察不同腫瘤細胞在其中的侵襲行為(Hoa H.Truong等，B1materials, 2012, 33, 181-188);再如Vinci等人將孔板微坑中形成的細胞球逐個轉(zhuǎn)移到空白的基底膠中，觀察藥物對基質(zhì)中三維細胞球的侵襲抑制效果。然而，上述已報道的腫瘤研究模型均不能實現(xiàn)高通量、可控的細胞球三維包埋。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，該方法是以實現(xiàn)膠原全方位、可控包埋細胞球，模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的研究方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，首先利用負性光刻膠的熱塑性制得特定圖案化的SU-8半球弧形凹槽模板，經(jīng)過聚二甲基硅氧烷兩次復制翻轉(zhuǎn)成型及特殊抗細胞貼附修飾，得到聚二甲基硅氧烷微坑芯片；將細胞懸液均勻平鋪在該芯片表面，經(jīng)過兩天沉降及細胞間相互作用的過程，微坑中的細胞成球樣；原位平鋪膠原液并于37°C固化，膠原塊與芯片模板一起反轉(zhuǎn)后將芯片剝離；由于此時的細胞球為半包埋于膠原塊中，需要再加一層膠原液并固化，最終得到全方位包埋于膠原胞外基質(zhì)中的細胞球三維可控圖案；或者基于同樣原理，得到全方位包埋于Matrigel胞外基質(zhì)的細胞球三維可控圖案。
[0006]本發(fā)明提供的腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，所述細胞球是通過在抗細胞貼附聚二甲基硅氧烷微坑芯片接種-沉降-聚集成球，直徑為300 μ m。
[0007]本發(fā)明提供的腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，所述特殊抗細胞貼附修飾過程為:SU_8半球弧形凹槽模板經(jīng)過聚二甲基硅氧烷兩次復制翻轉(zhuǎn)成型后，用表面活性劑泊洛沙姆(Pluronic F-127)浸泡，經(jīng)此修飾，固態(tài)聚二甲基硅氧烷表面修飾的疏水基團具有抗細胞貼附的作用，從而可促使細胞成球生長。
[0008]本發(fā)明提供的腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，所述細胞懸液為細胞均勻散布的培養(yǎng)基溶液。
[0009]本發(fā)明提供的腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，所述膠原胞外基質(zhì)選取了可用于細胞三維培養(yǎng)的I型鼠尾膠原或者其它適用于細胞三維培養(yǎng)的生物基質(zhì)材料；膠原胞外基質(zhì)的濃度為3mg/ml,厚度為l-3mm。
[0010]本發(fā)明提供的腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，所述細胞球的圖案化可實現(xiàn)高通量、可控的包埋。
[0011]本發(fā)明的創(chuàng)造性在于:通過芯片設計與膠原全方位包埋，實現(xiàn)高通量或者特定排列的腫瘤細胞球圖案化。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點在于:1、可實現(xiàn)高通量或者特定圖案化的細胞球三維排列；2、操作簡單易控。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1細胞球三維基質(zhì)中圖案化排列原理示意圖，各步驟圖依次分別代表SU-8光刻膠不完全曝光、顯影熱熔、PDMS復制反轉(zhuǎn)制成微柱芯片、PDMS再次復制反轉(zhuǎn)制成微坑芯片、細胞接種、細胞沉降聚集成團、一次膠原滴加固化、膠原塊與PDMS芯片反轉(zhuǎn)、膠原塊自PDMS芯片剝離、二次膠原滴加固化、最終成型；
[0014]圖2細胞球三維基質(zhì)中的圖案化排列表征。

【具體實施方式】
[0015]下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0016]實施例1:
[0017]基于膠原基質(zhì)中細胞球三維圖案化的方法表征。首先利用負性光刻膠的熱塑性制得SU-8半球弧形凹槽模板，澆注聚二甲基硅氧烷單體引發(fā)劑混合液固化，兩次復制翻轉(zhuǎn)成型后，用表面活性劑Pluronic F-127浸泡，經(jīng)此修飾，固態(tài)聚二甲基硅氧烷表面修飾的疏水基團具有抗細胞貼附的作用，得到可用于細胞接種-沉降-聚集成球的聚二甲基硅氧烷微坑芯片，芯片原位形成的細胞球直徑為300 μ m，選取可用于細胞三維培養(yǎng)的I型鼠尾膠原胞外基質(zhì)正-反兩次包埋細胞球陣列，實現(xiàn)細胞球三維基質(zhì)中的圖案化排列，膠原終濃度為3mg/ml，厚度為l_3mm，過程如圖1所示；通過芯片模板設計，可以調(diào)控細胞球圖案化排列，所得到的熒光蛋白轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U87細胞球方形矩陣及“cell”形圖案如圖2所示。
[0018]實施例2:
[0019]基于Matrigel基質(zhì)中細胞球三維圖案化的方法表征。利用負性光刻膠的熱塑性制得SU-8半球弧形凹槽模板，澆注聚二甲基硅氧烷單體引發(fā)劑混合液固化，兩次復制翻轉(zhuǎn)成型后，用表面活性劑Pluronic F-127浸泡，經(jīng)此修飾，固態(tài)聚二甲基硅氧烷表面修飾的疏水基團具有抗細胞貼附的作用，得到可用于細胞成球的聚二甲基硅氧烷微坑芯片，微坑直徑和間距均為500 μ m ;將密度為15個/ml的熒光蛋白轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U87細胞接種于芯片，經(jīng)過沉降及兩天的聚集，原位形成的細胞球直徑為300 μ m ;選取可用于細胞三維培養(yǎng)的Matrigel基質(zhì)正-反兩次包埋細胞球陣列，實現(xiàn)細胞球三維基質(zhì)中的圖案化排列，膠厚度為l_3mm。
【權利要求】
1.一種腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，其特征在于:首先利用負性光刻膠的熱塑性制得特定圖案化的SU-8半球弧形凹槽模板，經(jīng)過聚二甲基硅氧烷兩次復制翻轉(zhuǎn)成型及特殊抗細胞貼附修飾，得到聚二甲基硅氧烷微坑芯片；將細胞懸液均勻平鋪在該芯片表面，經(jīng)過兩天沉降及細胞間相互作用的過程，微坑中的細胞成球樣；原位平鋪膠原液并于37°C固化，膠原塊與芯片模板一起反轉(zhuǎn)后將芯片剝離；由于此時的細胞球為半包埋于膠原塊中，需要再加一層膠原液并固化，最終得到全方位包埋于膠原胞外基質(zhì)中的細胞球三維可控圖案；或者基于同樣原理，得到全方位包埋于Matrigel胞外基質(zhì)的細胞球三維可控圖案。
2.按照權利要求1所述腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，其特征在于:所述細胞球是通過在抗細胞貼附聚二甲基硅氧烷微坑芯片接種-沉降-聚集成球，直徑為300 μ m0
3.按照權利要求1所述腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，其特征在于:所述特殊抗細胞貼附修飾過程為:SU-8半球弧形凹槽模板經(jīng)過聚二甲基硅氧烷兩次復制翻轉(zhuǎn)成型后，用表面活性劑泊洛沙姆Pluronic F-127浸泡，經(jīng)此修飾，固態(tài)聚二甲基硅氧烷表面修飾的疏水基團具有抗細胞貼附的作用，從而可促使細胞成球生長。
4.按照權利要求1所述腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，其特征在于:所述膠原胞外基質(zhì)選取了 I型鼠尾膠原或者其它適用于細胞三維培養(yǎng)的生物基質(zhì)材料；膠原胞外基質(zhì)的濃度為3mg/ml,厚度為l-3mm。
5.按照權利要求1所述腫瘤細胞球在三維基質(zhì)中可控圖案化的方法，其特征在于:細胞球的圖案化可實現(xiàn)高通量、可控的包埋。
【文檔編號】C12N11/04GK104419696SQ201310400232
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權日:2013年9月5日
【發(fā)明者】秦建華, 馬靜云, 張旭, 石楊 申請人:中國科學院大連化學物理研究所